Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

<ol>
	<li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity,+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy.">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li><li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li><li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants.">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li><li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+genetic+analysis.">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR.">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li><li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences.">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li><li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function.">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li><li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508.">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li><li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation.">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li><li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells.">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li><li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li><li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. 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F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li><li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose.">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li><li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+potentiator+VX-770+(ivacaftor)+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li><li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li><li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface.">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li><li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR.">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li><li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+as+drug+targets.">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li><li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR,+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease.">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li><li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods.">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li><li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane.">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li><li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane.">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li><li>Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).</li><li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H++channels.">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li><li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+(PKA)+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites.">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li><li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation.">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li><li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion.">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li><li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative.">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li><li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts.">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li></ol>

Die Autoren danken den Rat von Dr. Mohabir Ramjeesingh während der Entwicklung der hier beschriebenen Reinigungsverfahren. Diese Studien wurden durch Betriebskostenzuschüsse zur CEB von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und Cystic Fibrosis Canada (CFC) unterstützt. PDWE wurde teilweise durch Fellowship Awards durch den CIHR und CFC unterstützt. Die Autoren danken der Bereitstellung von Korrektor Potentiator und Inhibitor-Verbindungen von Dr. R. Bridges (Rosalind Universität für Medizin und Wissenschaft) sowie den Vertrieb durch die Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Die Autoren hervorragenden Service zu bestätigen auch von der Baylor Cell Culture Facility (NIH P30 CA125123) auszudrücken Wt und mutierten CFTR-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-System. Die inaktive VX-770 analog, V-09 bis 1188, war ein Geschenk von Vertex Pharmaceuticals.

Es gab eine beschränkte Anzahl von Reinigungsprotokolle für Volllängen-funktionelle CFTR Isolierung war, aus einer Vielzahl von Zellexpression Systemen. Das hier beschriebene Verfahren ist vorteilhaft, da sie ermöglicht eine schnelle Reinigung von Wt-CFTR oder hohe Anreicherung von F508del- und G551D-CFTR in moderaten Mengen, die hochfunktionell in Assays einschließlich ATPase und direkte Messungen der Kanalfunktion, einschließlich Einzelkanalmessungen in planaren Doppelschicht Systeme und zeigte Maßnahmen CFTR P...

Chlorid-Transports durch die apikale Membran von Epithelzellen in Geweben wie der Lunge, des Darms, der Bauchspeicheldrüse und Schweißdrüsen wird primär von der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), einem ATP- und Phosphorylierung reguliert Mitglied der ABC (ATP-vermittelten Binding Cassette) C-Unterfamilie von Membranproteinen (in 1 überprüft). Wie andere Mitglieder der ABCC Familie ist CFTR eine große, mehr Spanning integrales Membranprotein, das an zwei ATP-Nukleotid-Bindungsstellen an der Schnittstelle ihrer Nukleotid-(NBDs), wo es geringe ATPase-Aktivität besitzt, in einer einzigen gebildet bindet Website. Im Gegensatz zu anderen ABCC Familie Mitglieder CFTR wurde als einzigartiges geregelten Cl Kanal anstatt als aktiven gelösten Transporter entwickelt. Mutationen im CFTR Ursache Mukoviszidose, einer Krankheit, die mehrere Organe wie die Lunge, Magen, Darm, Pankreas-und Fortpflanzungsorgane, was zu morbidity und Mortalität bei jungen Erwachsenen. Lungenerkrankungen nimmt normalerweise Frühletalität bei zystischer Fibrose und in den meisten Fällen wird durch den Verlust der CFTR-Funktion auf dem Oberflächenepithel der leitenden Atemwegen verursacht wird. Der Mangel an CFTR Chlorid-Kanal-Aktivität führt zu einer Verringerung sowohl der Cl - und Wasserbewegung über die Oberfläche Epithel, um die Fluidschicht auf der apikalen Oberfläche der Wimper Respirationsepithels modifizieren. Dies führt zu einem viskosen Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die die Fähigkeit von Wimper respiratorischen Epithelzellen beeinträchtigt effektiv klare Pathogenen aus den Atemwegen. Als Folge sind die meisten CF-Patienten leiden unter wiederkehrenden Anfällen von Lungenentzündung und Lungenschäden aufgrund einer Entzündung. Wie erwartet, Studien über den Wirkungsmechanismus des normalen CFTR-Protein konzentrierte sich hauptsächlich auf detaillierten elektrophysiologische Untersuchungen der Kanalöffnung Aktivität. Einkanal-Studien haben direkt, dass CFTR fungiert als PKA-abhängige Cl gezeigt- Kanal, der ein ATP-regulierten Tor 2 besitzt. Detaillierte elektrophysiologische Studien bieten eine Vielzahl von Informationen über einzelne CFTR-Kanäle 1,3, es kann jedoch Sorge, ob die Eigenschaften eines bestimmten einzelnen Kanal, der untersucht wurde, ist repräsentativ für die gesamte Bevölkerung von CFTR-Kanäle und damit die einzelnen Kanal Testergebnisse sollten stets zusammen mit Methoden, um die makroskopischen Bevölkerung studieren berücksichtigt werden. Direkter Assay der Bevölkerung Kanalaktivität von gereinigtem CFTR hat das Potential, um einen Einblick in die molekularen Defekts mit krankheitsverursachenden Mutation assoziiert ist und Entdeckung chemischer Modulatoren, die Reparatur mutierten CFTR-Proteine ​​zu treiben. Bis heute gibt es mehr als 1.900 verschiedene Mutationen im CFTR gedacht, um Mukoviszidose 4 verursachen. Der Haupt Mutation F508del-CFTR, auf mindestens einem Allel in etwa 90% der Patienten in Nordamerika und Europa führt zu Proteinfehlfaltung and Retention im endoplasmatischen Retikulum 5. F508del-CFTR hat auch andere Folgen, einschließlich defekte Kanalaktivität 6-9. Die sich ergebende Fehlen von CFTR von der Zelloberfläche ist mit einer schweren Erkrankung. G551D-CFTR, eine weniger häufige Mutation, wird angenommen, dass noch richtig gefaltet dysfunktional als Chlorid-Kanal an der Zelloberfläche 6 ist. Die Entwicklung niedermolekularer Korrektoren und Potentiatoren hat das Ziel, Korrektur Faltung und / oder Menschen von Mutanten, wie F508del-CFTR an der Zelloberfläche und potenzierende oder Erhöhung der Kanalaktivität von Mutationen wie G551D, wenn sie auf der Zelloberfläche vorhanden sind, jeweils . Während die Korrektoren VX-809 und VX-661 (noch nicht zur Anwendung bei Patienten zugelassen, die Potentiator Kalydeco (Ivacaftor, VX-770) wird auf 150 mg alle 12 h bei CF-Patienten&gt; 6 Jahre mit mindestens einem G551D verwendet -CFTR Mutation, und in jüngerer Zeit für Patienten mit einem G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pund G1349D. Kalydeco sowohl sicher und führt zu einer Verbesserung der klinischen Maßnahmen CF Krankheit 10 ist jedoch der Mechanismus der Wirkung des kleinen Moleküls war schlecht bei der FDA-Zulassung für die Anwendung bei Patienten verstanden. Eine Handvoll von CFTR Reinigungsverfahren wurden zuvor 2,11-18, von denen viele erfordern eine beträchtliche Zeitdauer in Anspruch beschrieben. In einer kürzlich erschienenen Publikation 19 wurde eine einzigartige schnelle Reinigung und Rekonstitution Verfahren zur CFTR in Sf 9-Zellen-Expressionssystem überexprimiert beschrieben, und das gereinigte Protein in definierten Lipidsystem wurde verwendet, um ein CFTR Halogenid Kanalaktivitätstest für eine Population von CFTR entwickeln Molekülen. Der Assay fasst die bekannten Wirkungen der Phosphorylierung, Nukleotide und Inhibitoren auf die CFTR-Funktion. Das System wurde verwendet, um die Wirkungen der Potentiator abzufragen VX-770 / Kalydeco auf Wt (Wildtyp), F508del- und G551D-CFTR und es wurde zum ersten Mal gezeigtZeit, die das Arzneimittel interagiert direkt mit dem CFTR-Protein, seine Kanalaktivität in einem ATP-unabhängigen Weise zu verstärken, was die Nützlichkeit und Anwendbarkeit dieser Verfahren auf die Untersuchung der Wechselwirkung von CFTR und Mutanten mit Nukleotiden und kleinen Molekülen aus einer Population Perspektive beantworten klinisch relevante Fragen zum Protein. Die Verfahren sind auch verwendet worden, um andere Potentiator Moleküle und deren Derivate 20, als auch die Auswirkungen eines kleinen Moleküls Korrektor auf die Aktivität des Proteins 21 zu studieren. Efflux-Assays wurden in vielen Studien verwendet worden, die zuvor um die Aktivität des CFTR-Mutanten und die Wirkungen von CFTR-modulatorische Verbindungen auf ihre Aktivität, einschließlich der Gesamtzelltests unter Verwendung von Elektroden, radioaktiven Tracer und Fluorophore 22,23, Membranvesikel mit ionenselektiven Elektroden 24 zu untersuchen und gereinigt wieder hergestellt CFTR mit radioaktiver Tracer 25. Allerdings the Verwendung von ionenselektiven Elektroden zu reinig wiederhergestellt CFTR Studie wurde vor kurzem 19 ausgewiesen. Eine Anpassung der aktuellen Methode ist für die Rekonstitution und funktionelle Charakterisierung der beiden Membranproteine ​​von Pseudomonas aeruginosa, einem gemeinsamen CF Pathogen verwendet. Rekonstitution von gereinigten Alge Protein der äußeren Membran gekuppelt mit Jodid Efflux-Messungen wurden verwendet, um ein Modell für die anionische Alginat Sekretion durch diese Transporter 26 zu unterstützen. Rekonstitution und Iodid Auslauf Messungen wurden mit dem gereinigten WZX Protein, das ein Modell vorgeschlagen werden, die ein H + -abhängigen Antiport-Mechanismus für die Lipid-verknüpftes Oligosaccharid Translokation über die bakteriellen Innenmembran schlägt dieses Protein 27 dürfen angewandt. In beiden Fällen wurde Jodid als Surrogat für die anionische Substrat bei geringeren Durchsatz verwendet, wenn auch, als man für eine native Substrat erwarten. Das Verfahren kann für die Anpassung an andere Proteine, die mit c istationic Transport oder Leitungsbahnen für die anionische Substrate. Hier wird eine schnelle Reinigungsverfahren ist für den CFTR-Proteins und seiner Rekonstitution in Proteoliposomen von definierten Lipid beschrieben. Die rasche Rekonstitution kann leicht zur Verwendung mit CFTR durch andere Verfahren gereinigt zugeschnitten werden, dass die Art des Detergens in der Reinigung verwendet zugänglich ist, um die Entfernung von den hier verwendeten Methoden oder nach einem geeigneten Detergens vor der Rekonstitution ausgetauscht werden. Das Iodid Efflux Verfahren zur Messung der Kanalaktivität der gereinigten und rekonstituierten CFTR-Protein ist im Detail beschrieben, und einige typische Ergebnisse, die durch dieses Verfahren erhalten werden können, sind dargestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1269">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:403px;">fos-choline 14 detergent</td>
			<td style="width:515px;">Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td>
			<td style="width:145px;">F312</td>
			<td style="width:207px;">Affymetrix: Anatrace Products; CAS#&#160;:77733-28-9</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>04 693 132 001</td>
			<td>EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack&#160;</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qaigen GmbH</td>
			<td align="right">1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Screening columns</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>11-387-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K</td>
			<td>Millipore (www.millipore.com)</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td>
			<td>Peirce PKA is also suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PC, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PS, Porcine Brain</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840032C</td>
			<td>(CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w))</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>841118C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ergosterol</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td align="right">45480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Detergent removal spin column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">87779</td>
			<td>1 ml capacity columns</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">valinomycin</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>V-0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VX-770 (ivacaftor)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iodide selective microelectrode</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td>
			<td>LIS-146ICM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clampex 8.1 software</td>
			<td>Axon Instruments (www.axon.com)</td>
			<td></td>
			<td>we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alternate Software: ArrowLabb System&#160;</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td>
			<td>LIS-146LICM-XS</td>
			<td>Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.&#160; This software should serve a similar function to our setup</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">small stir bars</td>
			<td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td>
			<td>SBM-0502-CMB</td>
			<td>choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sephadex G50, fine</td>
			<td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td>
			<td>17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td>Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional reconstitution and channel activity measurements of purified wildtype and mutant cftr protein

Die Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist eine eindeutige Kanal-Bildungselement von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Superfamilie von Transportern. Die Phosphorylierung und Nucleotid-abhängigen Chlorid-Kanal-Aktivität von CFTR wurde häufig in Ganzzellsystemen und als einzelne Kanäle in abgetrennten Membranflecken untersucht. Viele Mukoviszidose verursachenden Mutationen wurde gezeigt, dass diese Aktivität ändern. Obwohl eine kleine Anzahl von Reinigungsprotokolle sind veröffentlicht worden, haben eine schnelle Rekonstitution Methode Kanalaktivität beibehält und ein geeignetes Verfahren zur Untersuchung Population Kanalaktivität in einem gereinigten System fehlte. Hier schnelle Methoden zur Reinigung und funktionelle Rekonstitution des Volllängen-CFTR-Protein in Proteoliposomen von definierten Lipid-Zusammensetzung, die eine Aktivität als geregelter Halogenid Kanal beibehält beschrieben. Diese Rekonstiutionsmethode zusammen mit einem neuen Fluß basierenden Assay Kanalaktivität ist ein geeignetes System zurStudium der Bevölkerung Kanaleigenschaften von Wildtyp-CFTR und die krankheitserregenden Mutanten F508del- und G551D-CFTR. Insbesondere weist das Verfahren die Anwendung in der Untersuchung der direkten Effekte der Phosphorylierung, Nukleotide und kleine Moleküle wie Potentiatoren und Inhibitoren auf die CFTR-Kanalaktivität. Die Verfahren sind sich auch zur Untersuchung anderer Membrankanäle / Transporter für anionische Substrate.

In dieser Publikation geschrieben werden Verfahren zur Reinigung, zu rekonstruieren und zu messen geregelten Kanalaktivität des CFTR-Proteins. 1a zeigt den Arbeitsablauf für die Reinigung, Wiederherstellung und Iodid Auslaufverfahren. Verfahren zur Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen durch Jodid Fluss auch in weiteren Einzelheiten in der zugeordneten Video gezeigt. Reinigung und Wiederherstellung der CFTR in Proteo CFTR funktionell in ...

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Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

functional-reconstitution-channel-activity-measurements-purified

Research

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