ATPは重要な細胞メッセンジャーであるため、ATPの受容体への結合を高精度に測定できる方法を開発しました。ヌクレオチド誘導体と蛍光標識タンパク質間のFRETを用いることで、インタクトな機能的受容体へのヌクレオチド結合をリアルタイムかつ優れた空間分解能でモニタリングすることができます。この方法を使用して、特定の形態の糖尿病に関係するATP感受性カリウムチャネルに対する細胞代謝の影響を理解します。
屋根のない膜実験を設定するには、まず鉗子を使用して、トランスフェクトされた細胞でカバースリップから小さな断片を破り、その断片をPBSですすぎます。カバースリップがポリリジンでプレコーティングされている場合は、2ミリリットルのPBSを含む35ミリメートルの皿の底に断片を置き、サンプルの3〜5ミリメートル上に3ミリメートルのプローブ超音波処理器を保持し、50ワットと20〜40%の振幅で200〜500ミリ秒パルスしてセルの屋根を外します。カバースリップが事前にコーティングされていない場合は、PBSですすいだ後、0.1%ポリ-L-リジンを含むチューブに約30秒間フラグメントを浸してから、示されているように短い超音波処理で細胞を屋根を外します。
超音波処理された断片を、2ミリリットルの浴液を含む覆われたガラス底35ミリメートル皿に移し、高開口60倍水浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡に皿を取り付けます。顕微鏡のカメラポートが高感度CCDカメラと直列に分光器に接続されていることを確認し、蠕動ポンプを使用して、毎分0.5〜1ミリリットルのバッファーの流量でバッファーでバスチャンバーを灌流します。ANAP標識チャンネルを発現する屋根のないメンブレンフラグメントを特定するには、サンプルを表示して、蛍光チャンネルを持つメンブレンを見つけます。
顕微鏡のカメラポートと分光器の間に分光器マスクを部分的にかみ合わせます。マスクの影がカメラ画像に表示されます。屋根のない膜の明視野と蛍光画像を取得して、分析する対象領域を選択できるようにします。
マイクロボリューム灌流システムの先端を屋根のない膜に近づけます。ANAP蛍光の画像を取得するには、390/18ナノメートルのバンドパス励起フィルターと416ナノメートルのエッジダイクロイックを介して385ナノメートルのLEDでメンブレンを励起し、400ナノメートルのロングパス発光フィルターを介して放出された光を収集します。分光器のマスクをかみ合わせ、放出された光が通過することを確認します。
関心領域を分光器マスクのスリットに合わせます。分光器の格子をかみ合わせます。格子を配置すると、分光器によって回折された光がCCDカメラのチップに投影され、スペクトル画像が生成されます。
画像は Y 次元の空間情報を保持します。X次元は波長に置き換えられます。ヌクレオチドフリー緩衝溶液で灌流しながら、実験の残りの部分を通して収集されたデータのダウンストリーム補正および正規化のために、1つ以上の0.1〜10秒の曝露を得る。
次に、浴溶液にTNP ATP濃度の範囲を適用して濃度応答曲線を確立し、各溶液を少なくとも1分間灌流して定常状態に到達し、各濃度の曝露を取得します。各濃縮後、TNP ATPをヌクレオチドフリーバス溶液で少なくとも1分間洗い流してから、治療後の露光画像を取得します。パッチクランプ蛍光測定実験を行うには、まずパッチピペットを厚肉のホウケイ酸ガラスキャピラリーからピペット溶液で満たしたときに1.5〜2.5メガオームの抵抗まで引き抜きます。
次に、細胞をトランスフェクトしたカバースリップを2ミリリットルの入浴液を入れたガラス底35ミリシャーレに移し、倒立顕微鏡に装着します。浴チャンバーを浴液で灌流し、ANAP標識チャネルを発現する細胞を同定します。パッチピペットに穏やかな陽圧を加え、ピペットをバスチャンバーに入れます。
ピペットを細胞の膜に押し付け、穏やかな吸引を加えてギガオームシールを実現します。パッチを切除するには、ピペットホルダーをパッチを当てた細胞からすばやく離します。パッチピペットの先端を灌流システムの先端に近づけ、パッチが分光器マスクのスリット内にあることを確認します。
次に、TNP ATPを適用し、画像スペクトルを収集します。これらの画像では、オレンジ色の蛍光タンパク質でタグ付けされたATP感受性カリウムチャネルを発現するHEK293T細胞からの典型的な屋根のない膜断片を観察することができます。5マイクロモルのTNP ATPに曝露されたHEK293T細胞からの屋根のない膜におけるANAPタグ付きATP感受性カリウムチャネルのこのスペクトル画像では、ANAPおよびTNP ATPのピーク発光に対応する高強度の2つの領域が観察され得る。
最終的なスペクトルは、平均化された関心領域スペクトルから平均化されたバックグラウンドスペクトルを差し引くことによって得ることができる。ここで、多重露光後のピークANAP蛍光の減少が観察できる。TNP ATPの非存在下での数回の曝露からのピーク蛍光は、単一の指数関数的減衰に適合した。
次に、これらのデータを使用して、光退色アーチファクトを修正しました。ここでは、TNP ATPの非存在下およびTNP ATP存在下でANAPタグ付きATP感受性カリウムチャネルを発現する細胞から得られた屋根のない膜からの代表的なスペクトル画像が示されている。補正された発光スペクトルを観察すると、ドナーとアクセプターの蛍光発光の間に明確な分離が明らかになります。
この図では、典型的なパッチクランプ蛍光測定実験からのANAPタグ付きATP感受性カリウムチャネルからの代表的な電流とスペクトルが示されています。発光スペクトルは、屋根のない膜で示されているように、バックグラウンドと漂白について補正されています。コントロールに注意して、蛍光シグナルが受容体に特異的であることを確認してください。
あなたの滲出が速く、効率的で、完全であることを確認し、あなたの露出をできるだけ短くしてください。この方法は、受容体の占有率とそれが機能にどのように関連しているかについての質問に答えます。同様のセットアップで使用される他のFRET技術は、受容体におけるリガンド誘導性確認変化をプローブすることができる。
