受精したGFP鶏卵は、ヘレン・サン教授、ロスリン研究所、英国エディンバラ大学によって供給されました。ロスリントランスジェニックチキン施設は、ウェルカムトラストとバイオテクノロジー生物科学研究評議会(BBSRC)によって資金提供されています。この作品は、グレート・オーモンド・ストリート病院児童慈善団体(ロンドン、英国)が一部資金提供を受け、NTが支援しました。著者らは、移植のための胚の準備に協力してくれたUCL小児保健研究所のベン・ジェバンズに感謝する。

1. 神経管アブレーションのためのマイクロメスの調製
<ol><li>市販のスチール製縫製針からマイクロメスを形作ります。<ol>
<li>まず、パワードベンチグラインダーに取り付けられた粉砕ホイールを使用して、両側の針を平らにします。</li>
		<li>メスの成形を開始し、最初に制御された円形の動きを使用して粗いグレードのアーカンソー石で、針の両側に交互に形成します。</li>
		<li>非常に細かいグレードのアーカンソー石に同じ研ぎの動きを持って、細かく定義された最先端を持つ超微細なマイクロメスを形作ります(図1A、B)。 注:マイクロメスの代替は、電解的に研いだ針、市販のタングステン針、または引っ張られたガラス針である可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 野生型とGFP卵を所望のステージにインキュベート
<ol><li>受精鶏卵とトランスジェニックGFP鶏卵を、この温度で発生が停止するため、インキュベーション前に14〜15°Cの冷却インキュベーターに保存します。卵は数日間、最大1週間保存します。</li>
	<li>開発を開始するには、野生のタイプとGFPの卵をトレイに水平に置き、加湿(58〜60%)で同時にインキュベートします。37.5 ºCのインキュベーターは、胚が神経管移植のための一致段階にあるように。</li>
	<li>迷走神経管移植を行うための発達の10-12のスマイト段階で胚を得るために、ハンバーガーとハミルトン21の発達テーブルに従って1.5日間(33〜38時間)および胚をステージにインキュベートする。</li>
</ol>3. 卵を窓と移植に備える
<ol><li>一度に1つの卵をカスタムメイドの卵ホルダーに移動して窓を付けます。卵の尖った端の上面に、まっすぐなはさみで繰り返しタッピングして、卵の殻に小さな穴を開けます。</li>
	<li>卵から2〜3mlのアルブミンを181/2G皮下注射針と5mlの注射器で取り出します。アルブミンを取り除くことは卵の中の黄身を下げ、胚に損傷を与えることなく、その後の窓を容易にする。<ol>
<li>アルブミンを捨てる。細かいはさみでサイズにカット透明テープの小さなストリップで穴をシールします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>湾曲したはさみを使用して、卵殻の上面に別の穴をタップします。はさみの先端を穴に入れ、ハサミをベンチに平行に保ち、シェルの上に直径約2cmの窓を切り取るために円形の動きで働きます。<ol>
<li>はさみを静止した位置に保ち、卵を回転させます。卵殻の取り外したディスクを捨てます。E1.5では、胚は黄身の上に暗い黄色の円盤として認識可能である。</li>
		<li>ピンセットを使用して卵の中に落ちた貝の破片を取り除きます。未受精卵を捨てる(それ以外の場合は薄い黄色の黄身の上に小さな白い斑点によって識別される)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 移植された組織を受け取るために宿主胚を準備する
<ol><li>ステレオ顕微鏡を目の高さに調整し、グースネック光源の向きを最適化して、反射を引き起こすことなく胚を適切に照らします。</li>
	<li>適切な胚を視覚化するには、口管と引っ張られたガラスマイクロピペットを使用して、暗い黄色の円盤の中心の下に少量のインドのインクを注入する(図1C、Oii)。<ol>
<li>ペニシリン/ストレプトマイシンを含むPBSで、インク50:50を100μg/mlの最終濃度で調製します。ブラトデアルムの周囲外の黄身膜を通してマイクロピペットを挿入し、慎重に胚の真下に先端を角度付けします。</li>
		<li>口管に吹いて胚の下にインクを送ります。口のピペットが許可されていない場合は、代わりに1mlの注射器を使用してください。胚の下に気泡を入れて汚染を引き起こす可能性があり、ガラスのマイクロピペットを慎重に取り除かないように注意してください。これは、正確に行われなければ胚の死につながる微妙なステップです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ハンバーガーとハミルトン21 を参照して胚をステージングし、ラボブックにステージを記録します。</li>
	<li>針ホルダーに取り付けられたカスタムメイドのマイクロメス(または細かいタングステン針)を使用して、マイクロ手術が行われる領域の隣にあるビテリン膜に非常に小さなガッシュを作ります。<ol>
<li>慎重に2〜3滴のPBSを膜の裂け目の上に塗布し(ガラスマイクロピペットと口管を使用して)胚と膜の間に空間を作り出す。膜内の大きな窓を切り、マイクロ手術が行われる領域全体を露出させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロメスを使用して対象の神経管領域を除去し、下部神経管全体(ビデオ中のスマイト1〜7のレベル)全体にわたるロストラルと尾側横切り切開から始まる。<ol>
<li>神経管とスマイトの間を両側で切断し、スマイトを損傷することなく、周囲の組織から神経管を分離する。</li>
		<li>非常に穏やかに、そのまま残るはずの根底にある脊索から神経管を分離する。神経管切除が成功すると、周囲のすべての組織が完全にそのまま残されることに注意してください(図2)。</li>
		<li>切除された神経管をガラスマイクロピペットに吸引して取り出し、捨てます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラボブックに神経管アブレーションのレベルを記録します。宿主胚はドナー神経管を受け取る準備が整いました。</li>
</ol>5. ドナー移植組織の準備
<ol><li>FITCフィルターを使用した蛍光ステレオ顕微鏡での視視により、ウィンドウ付きのステージに適合したGFP胚を選択します。GFP蛍光は、スマイトを視覚化し、胚をステージすることが非常に容易になります。</li>
	<li>ステージマッチの胚が同定されたら、4回の切開を行い、Pascheff-Wolffスプリングハサミ(図1C、l)を胚の周りの長方形の形で卵子から取り除き、胚スプーンでそっと拾います。</li>
	<li>胚をシルガードポリマーベースの正方形の時計ガラスに入れます。デュモン#5ピンセットで卵子をそっと振り、付属の黄身を取り除きます。ビテリン膜を取り外し、ステンレスミヌティエンピンを使用して胚をポリマーベースに固定する(図1C)。</li>
	<li>スプリングハサミを使用して、宿主胚から除去されたのと同じ領域で、神経管と周囲のスマイトの周りの長方形の形状で4切開を行う。</li>
	<li>プラスチックトランスファーピペットを使用して、ドナーGFP胚からペン/ストレップPBSの0.2%膵臓を含むウォッチグラスに神経管とスマイト組織を移管する。</li>
	<li>酵素消化をRTで10分間進め、組織を分離します。酵素中でインキュベーションした後、ハンドルに取り付けられたステンレスミヌティエンピンを使用して、隣接するすべての組織から手動で神経管を分離します。</li>
	<li>ガラスマイクロピペットを使用して、DMEM + 10%血清(例えば、ヤギ、馬または胎児の子牛)を含む別の時計ガラスに解約した神経管を氷上で移し、余分な膵臓をすすぎ、酵素消化を止める。5分後、解剖された神経管は、チックホストに正交的に移植される準備ができている(図2およびS1)。</li>
</ol>6. 組織の移植
<ol><li>ガラスマイクロピペットを使用して、解剖された神経管を時計ガラスから宿主胚に慎重に移す。神経管を正しい前後方方向に配置し、マイクロメスルを使用してひよこ宿主の切除領域に隣接する外植を静かに押す。神経管の向きを識別するために、小さなニックを取り付けたり、小さなニックを切断したりして、小さな外皮の断片を残します。<ol>
<li>必要に応じて、切除物を切除領域の正確なサイズにトリミングするためにマイクロメスを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>神経管をアブレート領域にそっと導き、後側が正しく向き合うよう位置づけます。口の管に取り付けられたガラスマイクロピペットを使用して、移植片を取り巻くPBSおよび/または流体を除去する。これは、ドナーおよび宿主組織が付着し、移植片が確立するのを助ける。</li>
	<li>脱水や汚れを防ぐために、24 mm 幅のクリアテープで窓全体を密封します。</li>
	<li>卵殻に鉛筆で印を付けてキメラ胚にラベルを付け、その数をラボブックに記録します。さらなる開発のためにインキュベーターに卵を返します。</li>
</ol>7. 宿主胚の血管にDiIを注入する
<ol><li>所望の実験時点(ここでは、3〜10日後)で、培養器からキメラ胚を取り出し、まっすぐはさみを使用して透明なテープを取り出し、卵子内の胚にアクセスする。</li>
	<li>必要に応じて、はさみを使用してシェル内のウィンドウを拡大します。絨毛膜がシェルに付着している場合は、出血を引き起こし、血管の標識を危険にさらす場合は、その絨毛膜を損傷しないように注意してください。</li>
	<li>黄身のアクセス可能な静脈を選択して、血流が胚に向かっていることを確認します。ビテリン静脈の分岐点を選択します (図 3B, C)。 注:E6.5 - E7.5では、卵黄静脈にアクセスするために、絨毛膜をピンセットで静かに脇に移動する必要があります。E8.5の後、唯一の選択肢は、この段階までに絨毛管内膜が胚を完全に覆っているので、絨毛管内膜静脈の1つに注入することです。</li>
	<li>2 つのデュモン#5ピンセットを使用して、選択した注射点の上のビテリン膜を取り除き、反対方向に引き裂きます。</li>
	<li>デュモン#5を使用して引っ張られたガラスの針を破り、CellTracker CM-DiIでロードする前に静脈のおおよその大きさに直径を調整します。DMSOで40μg/μlのDiIストックソリューションを作成し、-20°Cで保存します。 4 μg/μlの濃度で0.3 Mスクロース/PBSで動作溶液を調製します。<ol>
<li>口管との吸引を使用して針に0.3 Mスクロース/PBSのDiIの5-10 μlの間の吸気。古い胚は25μl以上必要かもしれません。E8.5から、胚はより大きく、より多くの筋肉静脈を有し、DiIを装填されたガラス針で刺す前にデュモン#5の位置に保持する必要があるかもしれない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>迅速に静脈に針を挿入し、凝固を形成せずにゆっくりと血流に参加できるようにDiIが許可するように口管で着実に吹きます。あるいは、DiI送達用の圧力インジェクタを使用します。</li>
</ol>8. 切除または全山試験のための収穫胚
<ol><li>できるだけ多くのDiIを胚内に保持するには、穿穿なるスプーンにすくい、まっすぐハサミで血管と結合組織を切断して、注射直後に胚を収穫し、卵黄から胚を解放する。</li>
	<li>任意の緩い膜を除去し、関心のある器官(すなわち、このチュートリアルでは肺と消化管)を解剖し、DiIの拡散を作成する組織を圧縮しないように細心の注意を払う。直ちに、RTで1〜2時間4%PFAに浸漬して組織を固定します。</li>
	<li>組織をPBSで5分間リンスし、5μg/ml DAPIを含むPBSで15分間リンスします。サンプルをブリッジングされた顕微鏡スライドに取り付けて、全体のマウント検査を行うか、凍結切断のために埋め込みます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biological+cell+labeling+technique+and+its+use+in+expermental+embryology.">A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology.</a> Developmental Biology. 30, 217-222 (1973).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 97, 305-318 (1999).</li><li>Garcia-Castro, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+differentiation+of+the+neural+crest.+Current+Opinion+In.">Induction and differentiation of the neural crest. Current Opinion In.</a> Cell Biology. 11, 695-698 (1999).</li><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+switches+in+Mammalian+neural+crest+cell+differentiation.">Signals and switches in Mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, (2013).</li><li>Burns, A. J., Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sacral+neural+crest+contributes+neurons+and+glia+to+the+post-umbilical+gut:+spatiotemporal+analysis+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system.">The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system.</a> Development. 125, 4335-4347 (1998).</li><li>Burns, A. J., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development:+analysis+of+the+selective+developmental+potentialities+of+vagal+and+sacral+neural+crest+cells+using+quail-chick+chimeras.">Enteric nervous system development: analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras.</a> The Anatomical Record. 262, 16-28 (2001).</li><li>Burns, A. J., Delalande, J. M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+transplantation+of+enteric+nervous+system+precursors+from+vagal+to+sacral+neural+crest+results+in+extensive+hindgut+colonisation.">In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation.</a> Development. 129, 2785-2796 (2002).</li><li>Burns, A. J., Champeval, D., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacral+neural+crest+cells+colonise+aganglionic+hindgut+in+vivo+but+fail+to+compensate+for+lack+of+enteric+ganglia.">Sacral neural crest cells colonise aganglionic hindgut in vivo but fail to compensate for lack of enteric ganglia.</a> Developmental Biology. 219, 30-43 (1006).</li><li>Wang, X., Chan, A. K., Sham, M. H., Burns, A. J., Chan, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+sacral+neural+crest+cell+contribution+to+the+hindgut+enteric+nervous+system+in+the+mouse+embryo.">Analysis of the sacral neural crest cell contribution to the hindgut enteric nervous system in the mouse embryo.</a> Gastroenterology. 141, 992-1002 (2011).</li><li>Goldstein, A. M., Hofstra, R. M., Burns, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+brain+in+the+gut:+development+of+the+enteric+nervous+system.">Building a brain in the gut: development of the enteric nervous system.</a> Clinical Genetics. 83, 307-316 (1111).</li><li>Delalande, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularisation+is+not+necessary+for+gut+colonisation+by+enteric+neural+crest+cells.">Vascularisation is not necessary for gut colonisation by enteric neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385, 220-229 (2014).</li><li>Anderson, R. B., Stewart, A. L., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypes+of+neural-crest-derived+cells+in+vagal+and+sacral+pathways.">Phenotypes of neural-crest-derived cells in vagal and sacral pathways.</a> Cell And Tissue Research. 323, 11-25 (2006).</li><li>Takase, Y., Tadokoro, R., Takahashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost+labeling+with+highlighter+ink+efficiently+visualizes+developing+blood+vessels+in+avian+and+mouse+embryos.">Low cost labeling with highlighter ink efficiently visualizes developing blood vessels in avian and mouse embryos.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55, 792-801 (2013).</li><li>Bates, D., Taylor, G. I., Newgreen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neurovascular+development+in+the+forelimb+of+the+quail+embryo.">The pattern of neurovascular development in the forelimb of the quail embryo.</a> Developmental Biology. 249, 300-320 (2002).</li><li>Mayes, P., Dicker, D., Liu, Y., El-Deiry, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+vascular+imaging+in+fluorescent+tumors+using+multispectral+unmixing.">Noninvasive vascular imaging in fluorescent tumors using multispectral unmixing.</a> BioTechniques. 45, 459-460 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li><li>Eichmann, A., Thomas, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+parallels+between+neural+and+vascular+development.">Molecular parallels between neural and vascular development.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Medicine. 3, a006551 (2013).</li><li>Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessels+and+nerves:+marching+to+the+same+tune.">Vessels and nerves: marching to the same tune.</a> Cell. 120, 299-302 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring.">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436, 193-200 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Senut, M. C., Alvarado-Mallart, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytodifferentiation+of+quail+tectal+primordium+transplanted+homotopically+into+the+chick+embryo.">Cytodifferentiation of quail tectal primordium transplanted homotopically into the chick embryo.</a> Brain Research. 429, 187-205 (1987).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-species+grafting+caused+extensive+and+heritable+alterations+of+DNA+methylation+in+Solanaceae+plants.">Inter-species grafting caused extensive and heritable alterations of DNA methylation in Solanaceae plants.</a> PLoS One. 8, e61995 (2013).</li><li>Freem, L. J., Delalande, J. M., Campbell, A. M., Thapar, N., Burns, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+organ+specific+commitment+of+vagal+neural+crest+cell+derivatives+as+shown+by+back-transplantation+of+GFP+chicken+tissues.">Lack of organ specific commitment of vagal neural crest cell derivatives as shown by back-transplantation of GFP chicken tissues.</a> The International Journal Of Developmental Biology. 56, 245-254 (2012).</li><li>Delalande, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+tyrosine+kinase+RET+regulates+hindgut+colonization+by+sacral+neural+crest+cells.">The receptor tyrosine kinase RET regulates hindgut colonization by sacral neural crest cells.</a> Developmental Biology. 313, 279-292 (2008).</li><li>Freem, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre;YFP+reporter+mice.">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> Journal of Anatomy. 217, 651-664 (2010).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PloS One. 5, e12674 (2010).</li></ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここで説明する血管標識と組み合わせた、種内神経管移植の方法は、卵子内の鳥類胚のアクセスの容易さ(他の脊椎動物胚と比較して)を最大限に活用して、自律神経系(ENS)および血管系の要素の共発達を研究する。
NCC誘導体の標識に関して、我々が説明するひよこGFP-ひよこ種内移植法は、40年以上前に1-3で確立された古典的なウズラ・チック・キメラ法に対して多くの利点を有する。まず、FITC光の下では、GFP+細胞が生きたキメラ胚で容易に識別できる範囲で、GFP蛍光は非常に明るいです。これにより、移植片の成功をovoでチェックすることができ、ウズラひよこ移植は、移植片の成功を確認する前に、QCPNを使用して胚を殺し、処理し、免疫染色する必要があるのに対し、2。第二に、トランスジェニックチックGFPにおけるGFP発現は細胞質であり、したがって細胞体にラベルを付けるだけでなく、移植された細胞の投影も可視化することを可能にする22。これにより、複雑なニューロンネットワークを高解像度で観察することができます(サンプルが抗GFP抗体で免疫染色されたときに、微細な投影が最もよく視覚化されることに注意してください)。QCPN標識はウズラ細胞核に限定されるため、ウズラひよこキメラを使用してそのようなネットワークは明らかにされません。第三に、種内移植は、キメラ胚内の細胞間の潜在的な種差を排除する。ウズラ胚はひよこよりも潜伏期間が短いため(19日対21日)、ウズラ細胞はひよこ細胞よりも増殖率が高く、キメラ組織の発達に影響を与える可能性が示唆されている。興味深いことに、植物では、種間移植が宿主24におけるDNAメチル化パターンに広範な変化を生じさせる可能性が示されている。第4に、ひよこGFPは、NCC運命および細胞コミットメント25のようなトピックに対処するために、背中の移植実験を促進する。第5に、遺伝子導入性のチックGFPは、GFP+細胞亜集団のFACS選別、GFP+細胞を含む器官の組織的培養、発現プラスミド26のエレクトロポレーションによるGFP+移植組織の遺伝子操作、および光学投影トモグラフィー27などの他のイメージング技術を含む多くの他の技術にも有用である。
神経管移植アプローチは、より短い量の神経管を微小外科的に置換することによって変更することができる。神経管の小さなセグメントを使用することにより、マイクロサージャストは潜在的に胚にダメージを与えにくく、生存率を改善することができる。しかし、移植する神経管の少ない欠点は、宿主のGFP+NCCの数が減少することです。ユーザーは、胚の最適な生存を与えるために移植された神経管の量と、有益な結果を与えるために十分な宿主腸内のGFP + NCCの数とのバランスを試みることができます。
容器の塗りのために、DiIは蛍光が非常に明るく、強いという利点がある。また、最も優れた開いた毛細血管の染色を保証する固定中に拡散する能力を有する。それは重要な染料であるため、胚は注射手順を生き残り、染色された血管系で開発を続けることができます(私たちの手の中で最大24時間、染色は時間の経過とともにより穿刺されますが、 図3Eを参照してください)。したがって、DiI血管絵画との接木のひよこGFP の組み合わせは、ライブイメージングと互換性があります。これらすべての利点に加えて、血管注入は発光した血管のみを標識し、未開封の毛細血管、内皮先端細胞または単離された内皮細胞を同定しないことに注意することが重要である。しかし、鳥類の遺伝子導入のさらなる進歩は、Tg(tie1:H2B-eYFP)ウズラ胚を使用して血管形態形成を研究する実験によって例示されるように、そのような問題を回避する新しい方法を提供することができる。この技術のもう一つの制限は、E7.5以降の胚に効果的な血管標識のために、より多くの量の染料を注入する必要があり、実験を高価にすることができるということです。しかし、この技術の変更には、蛍光ペンインク14を使用した低コストの血管標識が含まれる可能性があるが、このアプローチは我々の手では試みられていない。
手順の重要なステップは、ブラストディスクの下にインクを注入することによって胚を視覚化するプロセスを含む。この段階で黄身を覆う膜がインクで満たされた針によって引き裂かれると、胚の生存が著しく損なわれる。また、ドナー神経管を調製する際に、組織が膵臓で過度に長時間放置されないことが重要である(最大として約10分を考慮する)。膵臓への長期暴露は組織に損傷を与え、神経管は処理が困難であり、宿主にうまく組み込まれません。キメラ胚を注入する前に、キメラ胚に対するDiI注射技術の経験を得ることは、一般的に各胚に対して1回の注射しか可能であるため、不可欠である。DiIの容積および針の直径は各胚のための重大な変数であり、野生のタイプ、ステージ一致した制御で査定されるべきである。
結論として、生きたひよこ胚における神経管移植とDiI血管塗装の二重標識法は、器官形成中のNCCと血管ネットワークの相互関係を調べるのに使用できる。臓器の開発中に正しい標的のインナーゼーションと血管化を確立するメカニズムはまだほとんど知られていないので、この方法論は、この分野における将来の発見の可能性を秘めています。

鶏の胚は脊椎動物発生生物学において非常に貴重なモデル生物であり、ovoでの開発は、子宮内で発達する脊椎動物では行うことが不可能な実験的操作を可能にするため、少なくとも。このアクセシビリティと操作の容易さは、発生生物学の分野で多くの精巧な発見で重要な役割を果たすひよこ胚につながっています。最も強力な技術の中で、ウズラひよこキメラ胚を使用して細胞の運命を研究してきました, 1970年代の1-3でニコール・ル・ドゥアラン教授によって開拓された方法.特に、ウズラひよこキメラは、初期の発達の間に非常に回遊性神経堤細胞(NCC)集団を遺伝的にマークし、従うために特に有用であった。NCCは、神経管の余白の後部外胚に生じる回遊細胞の多能集団であり、脊椎動物胚全体に幅広い細胞型を生じさせる。これらには、頭蓋顔面構造(軟骨、骨、筋肉)、神経およびグリア(感覚および自律神経系における)、メラノサイト、および内分泌系2,4,5の細胞の亜集団が含まれる。NCCの運命に影響を与える最も重要な要因の1つは、神経管の前後軸に沿った最初の位置である。例えば、腸管神経系(ENS)のニューロンおよびグリアを生じさせる腸管NCCは、2つの離散サブ集団から生じる:第1は迷走(尾頭脳)領域に位置し、第2は神経管6-13の仙骨領域に位置する。神経管の対応する領域の種間または内接合は、これらの細胞に恒久的にラベルを付け、その後、神経管の余白での出生から消化管内の最終目的地までの追跡を可能にする選択の技術であった6,7,10。
他の動物モデルと比較して、ひよこで行うより容易な別の胚操作は、血管系の重要な標識である。確かに、ひよこ胚が発達するにつれて、それは黄身から酸素と栄養素を循環する胚外血管ネットワークの上に横たわっている。卵黄の表面に位置するこのアクセス可能な血管ネットワークは、器官形成中に胚の発達中の血管系を標識するゲートウェイとして使用することができる12,14-17。各種色素DiIなどの種々の色素の血管内注射は、新生血管網のすべての発光血管を線引き/染色することを可能にする。
発達器官は神経系(感覚および運動制御用)と血管系(ガス交換、流体および栄養供給用)の両方に接続する必要があるため、2つのネットワークは互いに並行して発達し、分岐アーキテクチャ18-20において顕著な類似点を共有する。ここでは、臓器形成中の血管系と共にNCC由来ENSの同時発生を研究することを可能にする胚操作を報告する。これは、神経堤を含む神経管の離散セグメントの移植を介して鶏キメラを生成することによって達成され、血管DiI注射と組み合わされる。ウズラチキンキメラからの進歩として、我々の方法は、細胞内移植のためにトランスジェニックGFPひよこ胚を使用し、細胞とその予測をイメージングするという点で移植技術をより強力にし、種の違いに関連する潜在的なバイアスを排除する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="58">
			<td height="79" rowspan="2" style="height:80px;width:528px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:312px;">Company&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:320px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Fertilised chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">Henry Stewart and Co, Louth, UK</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">Fertilised GFP chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Egg incubator (Profi-H Hatcher)</td>
			<td>Lyon Technologies, CA, USA</td>
			<td style="width:320px;">910-033</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">14C Incubator</td>
			<td style="width:312px;">Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK</td>
			<td style="width:320px;">Model LT2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo-microscope&#160;</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">Model MZ 12.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">DC500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">IM50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Goose neck halogen cold light source</td>
			<td style="width:312px;">Advanced Imaging Concepts, Inc</td>
			<td>KL 1500 LCD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">181&#8260;2 G hypodermic needle&#160;</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">HSWNH181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancreatin</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">P3292</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>D5030</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>G6767</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">5ml syringe</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z248010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Mouth tube</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">A5177</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in.</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">S6018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Transfer pipettes, polyethylene</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z350796&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PY8 30-0035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holders (Nickel-plated pin holder)&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pascheff-Wolff Spring Scissors&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:320px;">15371-92</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>11251-30&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Minutien pins&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">26002-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11210-10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perforated spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10370-18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten needles (0.125mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10130-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sellotape (clear, 24mm width)</td>
			<td style="width:312px;">Any Supplier</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution</td>
			<td style="width:312px;">VWR international</td>
			<td>101447-068&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:312px;">Dow Corning</td>
			<td>S09 512 516</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pelikan black ink</td>
			<td style="width:312px;">Pelikan</td>
			<td>211-169</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">C-7001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Settings for glass needle puller&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller model P-86</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual labeling of neural crest cells and blood vessels within chicken embryos using chickgfp neural tube grafting and carbocyanine dye dii injection

すべての開発器官は、神経系(感覚および運動制御用)と血管系(ガス交換、流体および栄養供給用)の両方に接続する必要があります。その結果、神経系と血管系の両方が互いに一緒に発達し、分岐アーキテクチャの顕著な類似点を共有しています。ここでは、神経堤由来の神経組織(この場合は腸神経系)と血管系の同時発生を研究することを可能にする胚操作を報告する。これは、同じ胚の血管DiI注射と組み合わせた、神経管の離散セグメントの移植、および関連する神経堤の移植 を介して チキンキメラを生成することによって達成される。我々の方法は、種内移植のためにトランスジェニックひよこGFP 胚を使用し、移植技術は1970年代以来大きな効果を発揮して使用される古典的なウズラ-ひよこ種間移植プロトコルよりも強力である。ひよこGFP-ひよこ内種移植は、移植された細胞のイメージングと無傷の組織におけるその予測を促進し、種の違いに関連する細胞開発における潜在的なバイアスを排除する。この方法は、鳥の胚のアクセスの容易さ(他の脊椎動物胚と比較して)を最大限に活用して、腸神経系と血管系の共発達を研究する。

図1 は、神経管の微小外科的隔離および移植を行うために必要な典型的な器具を示す。 図2 は移植手順を示す。移植胚の後に移植の成功のためにスクリーニングされる。これは、移植片由来(GFP+)NCCの存在のために、ステレオ蛍光顕微鏡(典型的にはマイクロ手術後の朝)の下で胚を調べることを含む。移植が成功した場合、GFP+ NCCは神経管の近傍および前腸に向かう早期移動経路で観察することができる。手順が成功しなかった場合、GFP+ NCCは神経管の外で観察されないか、またはそれらが宿主に存在する場合、それらはより少ない数にあるかもしれない。これらの失敗した胚は廃棄されます。典型的には、5-8の神経管移植は1日で行われ、これらの80%は成功する。神経管移植が失敗した理由としては、微小手術中に発生した組織損傷による胚の死亡、または宿主胚に統合する神経管の障害が含まれる。後者は、宿主内の神経管の配置が悪かったり、解離技術が悪かったり、解離酵素に過度に曝露したりして、質の悪い神経管から生じる可能性がある。GFP+細胞の初期スクリーニングステップと同様の後の検査は、腸内にGFPラベルのNCCを持たない胚の実験を行うことによって時間とリソースが無駄にされないことを意味するので有用である。
図3は、血管のDiI注射の手順を示す。DiI注入技術の効率/成功は、まず、注射針を標的静脈の最適な直径に切断し、第2に静脈に針を挿入する際の正確なジェスチャー(反対側を貫通しないように)、第3に一定の速度で吹くことによって注射中に針が差し込まれるのを避けることによって異なります。これらの3つのパラメータのいずれかが間違って行われた場合、出血がすぐに再注入することがほとんど不可能になるため、2回目の試みが行われる前に胚が出血するか、回復に数時間が必要になります。成功した胚は、立体蛍光顕微鏡で観察することによって直ちに選択されるべきであり、迅速に解剖されなければならない。正常な胚では、DiI標識された血管が毛細血管を含む胚全体に存在する(図3C,D)。
胚の収穫と組織切片または全山胃腸管の検査に際して、 典型的な結果は、原始的なENS内のGFP+ NCCとDiIラベル付き腸血管ネットワークの微細な構造を明らかにする(図4)画像スタックがGFP+ ENS細胞とDiI染色血管系の微細投影との間の相互関係を示す3次元(3D)再構成を生成する共焦点顕微鏡を使用して全体実装調製を検討することができる(図4 A-C;G-I;ビデオ 1 と 2)。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig1.jpg"> 図 1.推奨マイクロ手術用器具。 (A) 縫製針から形をしたマイクロメス。 (B) マイクロメスを形作るための細かいアーカンソー石。 (c)a) ストレートハサミ、b)湾曲したはさみ、c)5mlの注射器と181/2G皮下注射針、d)プラスチックピペット、e)カスタムメイドの卵ホルダー、f)黒インク、g)スクエアウォッチガラス、 h)黒シルガードベース付きの正方形の時計ガラス、i)針ホルダーのマイクロメス、j)ミヌーティエンピン、k)ミヌーティエンまたは針ホルダーのタングステン針、l)パシェフ・ウォルフスプリングハサミ、m)デュモン#5ピンセット、n)穿刺スプーン、oi)短い火災引っ張り転送針、オイ) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig2.jpg"> 図 2.種内神経管移植. ひよこ胚/GFP神経管画像はデラランド らから変更された。12.腸管神経堤細胞による腸内植分化には血管形成が必要ない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig3.jpg"> 図 3.静脈内DiI注射。(A)推奨器具:a)セルトラッカーCM-DiIはパラフィルム上に落とし、b)引っ張られたガラス注射針、c)口管。(B)E4キメラひよこ胚への静脈内DiI注射の模式図。(c)ovo DiI静脈注射で静脈に挿入されたDiIを含む細かいガラス針(矢印)を示す。(D)E4キメラ胚ポストDiI注射(赤)GFP+ニューラルチューブ(矢印)を用いた。(E)DiIは、生きた胚、24時間の注射後に細かい血管ネットワークを染色した。Br: 脳;H: 心臓;LB:四肢の芽。A:アラントワ。(C)と(D)の画像は、デラランドらから変更されています。12腸管神経堤細胞による腸内コロニー形成には血管形成は必要ない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig4.jpg"> 図4:E5.5のひよこ胚の胃および精液の代表的な結果。(A-C)(D)GFP+腸管性クレスト細胞(ENCC)を示す胃の領域における共焦点の3次元(3D)再構成(E)DiI染色された血管系と(F)両ネットワークの結合画像D-F組織学的切片を示す(G)DiI染色血管系と(I)両方の画像を合成した。核はDAPI(シアン)で染色される。(G-H)(A)GFP+ENCC移行前線を緑色で示すcaecum領域における共焦点画像スタックの3D再構成、(B)DiI染色された血管系を赤色で、(C)両ネットワークの結合画像を示す。 画像(A-F) はデラランドらから変更されました。12腸管神経堤細胞による腸内コロニー形成には血管形成は必要ない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/52514/52514figS1.jpg"> 図 S1.酵素消化とマイクロ解剖による周囲組織からのドナーGFP+神経管 の分離。(A) GFP+ニューラルチューブ及び隣接するスマイトをドナー胚から解剖する。 (B) ステンレスミヌチエンピンを用いた膵臓消化およびマイクロ解剖後の神経管の分離。だから:スマイト。NT: 神経管;Nc: 脊索。
<img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514video1.jpg"> 図4Cにおける画像の3次元360°回転を図1に、E5.5(HH27-28)で胃の血管系とENCCを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video1.avi" target="_blank">このビデオを見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514video2.jpg"> 図4Iにおける画像の3次元360°回転を示す図2.E5.5(HH27-28)におけるcaecumの領域における血管系およびENCC移行前線を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video2.avi" target="_blank">このビデオを見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

ここでは、血管内DiI注射と組み合わせたひよこGFP 神経管の種内移植を用いた神経堤細胞および血管の二重標識を報告する。この実験技術により、臓器形成中にNCC由来の(腸管)神経系と血管系の発達を同時に可視化し、研究することができます。

鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

dual-labeling-neural-crest-cells-blood-vessels-within-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

8.0K ビュー.  UCL Institute of Child Health. ここでは、血管内DiI注射と組み合わせたひよこGFP 神経管の種内移植を用いた神経堤細胞および血管の二重標識を報告する。この実験技術により、臓器形成中にNCC由来の(腸管)神経系と血管系の発達を同時に可視化し、研究することができます。 

ビデオ: Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

発生生物学

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

神経クレスト細胞の形成と移動の研究のためのマウスからの原発性頭蓋神経クレスト細胞の解剖、培養および分析

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

神経紋の分離、培養、脂肪形成誘導、周食脂肪組織由来の脂肪由来幹細胞

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

胎内ナノ注射(NEPTUNE)によるマウス神経板ターゲティング(胎内7.5日目)

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...