この方法により、研究者は基底前脳と顔の間の組織相互作用を評価することができます。この技術の主な利点は、評価のために基底前脳を分離し、分析を混乱させる神経堤細胞による汚染を防ぐことです。この技術の難しい部分は、宿主から前脳を取り除き、ドナー組織で置き換えることです。
手順を実演するのは、ラルフ・マルクシオ博士の研究室の研究科学者であるダイアン・フーです。まず、ニュートラルレッド、ガラストランスファーピペット、鋭利なタングステンを含むDMEMメディアを準備します。10ミリリットルの注射器と18ゲージの針を使用して、卵殻の先のとがった端から0.5ミリリットルのアルブミンを取り除きます。
はさみの先を使ってシェルの上に小さな穴を開けます。次に、穴の上にテープを置き、円形の開口部を切り取って胚を露出させます。胚をニュートラルレッドで染色します。
ステージ7または8の胚の基底前脳の左側から組織移植片を採取します。湾曲した鋭利なタングステン針を使用して、前脳の一部をそっと切開します。下にある内胚葉を含めないようにするには、針を前脳の下、神経管の軸と平行にスライドさせます。
ガラストランスファーピペットを使用してドナー胚から移植片をピックアップし、ニュートラルレッドを含むDMEMに2分間移して染色します。次に、染色した移植片を、生着の準備ができるまでニュートラルレッドを含まないDMEMに入れます。白いレグホンチキンの受精卵を加湿チャンバーで摂氏37度でハンバーガーハミルトンステージ7〜8までインキュベートします。
前に示したように胚を露出させます。鋭利なタングステン針を使用して、移植片を収容するために0.3 x 0.2ミリメートルの基底前脳片を切断して除去することにより、移植部位を準備します。卵黄顆粒が作られた裂け目から漏れ始めるので明らかになるであろう、下にある内胚葉の過度の破壊を避けてください。
移植片を宿主に移した後、移植片を配置して、宿主の摘出された基底前脳を置き換えます。穴の上にテープをしっかりと置き、分析の準備ができるまで胚を摂氏37度のインキュベーターに戻します。当初、キメラはウズラの組織をニワトリの胚に移植することによって作られました。
QCPN抗体を用いて、ウズラ細胞を可視化し、宿主組織と区別した。ウズラ-ひよこシステムは、すべての移植片が神経組織のみで構成され、他の細胞型で汚染されていないことを確認しました。ウズラ組織のアヒル胚への移植は、ウズラの脳の発達が速いため、キメラをひどく変形させました。
そのため、アヒル組織のニワトリ胚への移植が行われた。結果として生じるアヒルとひよこのキメラは、脳が形態の調節に関与していることを示唆しています。全山C2ハイブリダイゼーションを用いて、キメラにおけるソニックハリネズミの発現を評価した。
形態と同様に、キメラのアヒル側のソニックハリネズミの表情はよりアヒルのように見えました。ホストサイトの準備には練習が必要です。多数の胚は生き残れないため、多数のキメラを作成することで、分析に適したサンプルを確保できます。
この方法により、脳からの信号が前鼻外胚葉帯のソニックヘッジホッグ発現ドメインをどのように形成するかを評価することが可能になりました。
