著者は、原稿の批評のためにLwigale研究室のメンバーに感謝。 SLGは、国立眼研究所（F32 EY02167301）からルースL.キルシュシュタインNRSAフェローシップでサポートされています。 PYLは、国立眼研究所（EY018050）によってサポートされています。

1。希望するステージにインキュベートひよこやウズラの卵 HH9胚については、典型的なインキュベーション時間は38℃63に29から33時間の範囲<ol><li>ぬるま湯と卵からの破片を洗ってください。 </li><li>水平トレイ上に鶏の卵を配置します。鉛筆で上を向く側をマークし、これは胚がローカライズされる領域に対応します。ウズラの卵平滑末端をインキュベートします。 </li><li> 38℃の加湿インキュベーター内に置きます。関数のロッキングオンにします。 </li></ol> 2。ウィンドウと解剖のために卵を準備します。 <ol><li>インキュベーターから卵を除去し、70％エタノールでトップを滅菌する。エタノールをスプレーし、卵殻を通してエタノールのいずれかの吸収を避けるために、紙タオルまたはキムワイプですばやく拭き取ってくださいすることをお勧めします。 </li><li>個々の卵ホルダー（我々は折り畳まれたペーパータオルを敷いたペトリ皿を使用して、例えば、 &quot;キムワイプ&quot;）上に配置鶏の卵。 AA鉗子を用いて、小さなHOLをタップ卵の尖った端に卵の殻の上面に電子。 </li><li> 18½G注射針、5 mLシリンジと鶏の卵からの光アルブミン1.5-3MLを削除します。卵（図2A）の先のとがった端に直面してベベルで、穴に垂直に針を挿入することをお勧めします。この方法では、アルブミンが取り下げられたときに、誤って吸引を介して卵黄を損傷のほとんどリスクがあります。アルブミンを破棄します。このステップでは、卵の殻で開かれるウィンドウを可能にするために卵内で卵黄と胚を下げます。 </li><li>上記のように70％エタノールで穴を拭き、スコッチテープでシールします。それは穴の周囲卵殻が完全に欠けているアルブミンと乾燥しているか、接着剤、シールされないことが重要です。 </li><li> AAの鉗子ではなく、非常に心尖部では、水平卵の著しい上面に別の穴をタップします。鉗子は、卵黄や胚の損傷を防ぐために、卵殻を通して遠く行かせないように注意してください。 </li><li>で卵の殻に穴を平行に湾曲した虹彩の鉗子の片側をSERT。鶏の卵の殻の直径ウィンドウで〜2センチメートルを破壊する円を描くように働いて、シェルの上にピンチ。削除され卵殻を破棄します。また、ガムテープで卵の上面を覆う、窓の外をカットするはさみのペアを使用しています。これは卵に陥る卵殻の破片の可能性を最小限に抑えることができます。胚は卵黄の上に不透明なディスクとして表示されます。すべての未受精卵を（胚盤葉の小さな白い卵黄の表面上のスポット、または不在で識別される）破棄します。 </li><li>胚のステージングを支援するための胚盤葉の下に：インドインク（最終濃度100μg/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン &quot;ペン/連鎖球菌&quot;抗生物質を含有する滅菌リンゲル液で1:10に希釈）を少量注入します。代わりに、1ミリアンペア、1 mLシリンジと26½Gの皮下注射針、針の基部に45°の角度に曲げ、上向きに面取りを使用します。yが引っ張らガラスパスツールピペットと口ピペッティング装置（皮下注射針を曲げたり、ガラスの針を壊したときに目の保護具を着用）を使用します。卵黄の胚盤葉の境界の外膜に近い卵黄の表面に、胚の下に針の先端をスライドさせて穿刺ではなく胚層で（図2B）。胚性に関する概要を説明するだけで十分なインクを注入し、慎重に針（図2C）を撤回することができる。あまりにも多くのインクを注入すると胚の死につながることができます。これは汚染の原因となる可能性がありますので、胚の下に気泡を注入しないことが重要です。 NB：この手順で使用されるすべてのリンゲル液を滅菌し、上記で定義されたペン/連鎖球菌が含まれています。緩衝生理食塩水（PBS）滅菌リン酸塩はまた、このプロトコルのすべてのステップでリンゲル液に受け入れられる代替手段です。 </li><li>ハンバーガーとハミルトン63に従って胚をステージングして、永久的なインクや鉛筆で卵殻上のステージを記録します。ステージは最高のステールの下に評価されているomicroscopy、限られた熱負荷を持つ光ファイバ &quot;グースネック&quot;の光源である。 </li><li> 2〜3滴脱水や汚染を防ぐために、胚の表面に暖かい滅菌リンゲル液を適用します。パラフィルムは、卵の表面上に伸ばして一時的にウィンドウをシールします。 </li><li>繰り返し移植実験を開始する前に、すべてのニワトリ卵で2.2から2.9を繰り返します。 </li><li>ウズラの胚のみがドナー組織のために使用されるので、OVOの手順で 2.2から2.9までを省略することができます。ドナー胚の元卵を調製するため、ウズラの卵は鈍い面を上にしてインキュベートし、胚を明らかにするために湾曲したピンセットで、この地域にオープンしました。解剖はさみを使用して、胚外卵黄膜と胚盤​​葉（すべてのカットが満たしていることを確認してください）​​を使用して正方形の形をした4カットを行います。湾曲した虹彩の鉗子を使用して、静かにワンカットエッジをつかみ、卵から胚を持ち上げ、ペトリ皿にリンゲル液に移します。また、一つの曲線を使用することができますDアイリスは下から摘出した胚を持ち上げるために鉗子、または胚スプーンまたはシリンダの広い部分を切ってプラスチック製のピペットは、卵の胚を転送するために使用されることがあります。優しく＃5ピンセットで卵黄膜を除去します。上記のように残っているウズラの胚を収集し、解剖顕微鏡下でそれらをステージングします。 </li></ol> 3。移植を受けるために宿主胚を準備します。 <ol><li>ホスト（ニワトリ）胚からパラフィルムを除去し、シャープタングステン針または＃5鉗子を用いて、神経管の所望の領域（図3A）における卵黄膜に小さな穴を開ける。 </li><li>胚へのリンゲル液のドロップを追加します。完全に組織の脱水を防ぐために、全体の手順の実行中にリンゲル液に浸漬胚を保つために世話をする。必要に応じてピペットを介した胚の表面にリンゲル液滴を追加してください。 </li><li>引っ張らガラス針を用いて、慎重に吻側およびCAを作る神経管背側の関心の長さと領域に対応する自由保有権横切開。一方的な移植のために切開だけで背側神経管の内腔を拡張する必要があります（プルガラス針は針引っ張って装置を加熱下で取得されたシリコンガラス毛細管から生成される）、および二国間の移植のために、全体で切開を行う全体の神経管背側。その後、神経管背側と沿軸中胚葉の間で二国間でカット。 </li><li>神経管から切り出し片を慎重に分離し、ガラスマイクロピペット（図3B）に吸引することによって胚から削除します。 </li></ol> 4。ドナー移植片組織を準備する<ol><li>ステージにマッチウズラの胚を選択します。 AAの鉗子で胚を押したまま、卵黄膜を除去し、消費税上記のように神経管の類似したサイズの領域（3.3から3.4）（図3A&#39;-B &#39;）。あなたの実験のニーズに応じて、この領域は可能性がありますrostro-尾軸に沿ったホスト（ひよこ）神経管または異なる領域からの相補的な領域。 （注：完全な神経管移植片を含むより大きな地域の移植のために、研究者は、移植前にドナー組織から任意の接着性の間葉組織を削除するには、この段階でプロテアーゼ消化を追加したい場合がありますしかし、初期段階での小さな背側神経管移植のためにここで詳述されている神経管が容易に厳密に外科的手法により、隣接する間充織から分離されているように、プロテアーゼ消化は必要ありません。） </li></ol> 5。移植組織<ol><li>リンゲル液を含むガラスピペットにドナー移植片を吸引除去する。ピペットに任意の気泡を導入しないように注意してください。 </li><li>ひよこホストの摘出した領域に隣接する植を転送します。東洋は、プルダウンガラス針を用いて植ゆっくりとアブレーション領域（図3C）にそれを導く。 </li><li>慎重にリンゲル液の数滴を追加脱水を防ぐために、胚へ。これは、移植片を取り除くことができるように移植部位に直接液体を落とさないように注意してください。 </li><li>ガムテープで窓をシールします。ウィンドウ卵のテープシールは、地域全体いることを確認してください。これにより、その後のインキュベーション中に脱水および胚の汚染を防ぐことができます。 </li><li>希望する段階までインキュベーターに卵を返します。キメラをインキュベートしながら、 &quot;ロッキング&quot;機能がオフになっていることを確認してください。開発の後期段階を対象としている場合、これは彼らの生存率を増加させる可能性がある卵が優しく手で1日2回をオンにすることができます。 </li></ol> 6。セクショニングのキメラ胚を準備する<ol><li>実験的なエンドポイントで、上質なハサミを使用してウィンドウを覆うテープを切り取る。 </li><li>湾曲した虹彩の鉗子（鋸歯状のヒントを実行する最も簡単な）と胚盤葉の端をつかみ、その後胚盤葉の境界の外側に4つの大きなカットを廃止する卵黄から胚を切った。 </lI&gt; <li>リンゲル液を含むペトリ皿に胚を転送します。組織の脱水を避けるために、空気への胚の曝露を最小限に抑えるように注意してください。 </li><li>実体顕微鏡下で、静かに第5鉗子を用いて胚盤葉から卵黄膜を分離します。 </li><li>それがフラットにレイアウト周囲の膜で、卵であったとして、胚が同じ向きになるように皿に胚を慎重に配置します。 </li><li>きれいに皿の底にタングステン線と平行の長さ、胚および胚体外組織の境界に針を配置することにより、胚から胚盤周囲を削除するには、タングステン線64から作られた解剖針を使用しています。組織を切断するために穏やかな鋸の動きを使用しています。 </li><li>慎重に＃5鉗子で羊膜を除去します。この時点で、どちらさらにご関心のある領域を分析する、または胚全体を残したいと思うかもしれません。 </li><li>氷冷4％PARAFに胚を転送する4℃で一晩ormaldehydeとロック</li><li>サンプルを調製し、凍結またはパラフィン切片用に埋め込むことができます。 </li></ol> 宿主胚内に移植した組織をトレースします 。ヘマトキシリン​​染色によるウズラ核小体の検出（ウズラの核がひよこの核よりも非常に大きく、暗い染色封入体を持っています）、フォイルゲン-Rossenbeck反応、アクリジン·オレンジまたはBIZ-ベンズアミド染色を含むニワトリ胚内ウズラ組織を識別するためのいくつかの手法があります。ウズラ特異的抗原3,47,65,66ための電子顕微鏡、または免疫標識と組み合わせた。ここでは、ウズラ - ニワトリキメラ（図4）ウズラ神経堤細胞を識別するためにQCPN抗原、標準ホールマウントまたはセクション免疫蛍光技術を使用しています。 QCPNの免疫はまた、ドナー（ウズラ）組織に由来する分化細胞を識別するために、他の抗体と組み合わせることができるように、この技術は、実験的なデザインの中で最も柔軟性を提供します。 standaを使用します。RD全体のマウントまたはセクション免疫蛍光テクニックはキメラでウズラ由来の細胞を標識します。 7。代表的な結果再インキュベーションの6時間後の神経管のグラフト化地域の代表的なイメージ（HH11に）ホスト（ひよこ）神経管（図4A）に移植したドナー（ウズラ）組織の期待の取り込みを示しています。 reinc​​ubation後、移植の不完全な統合、または頭蓋領域や体節の非対称発展を示す胚は破棄する必要があります。 HNK-1は、横方向に離れて神経管からの移行で標識されたHH11ショーNCCSでグラフトされた領域を通ってセクションを渡ります。 NCC渡り鳥ストリームにし、神経管に貢献ウズラ細胞は、明らかにQCPN（図4B）で標識されています。 後の段階で、ウズラNCC-由来細胞は、その最終的な標的組織にさかのぼることができます。 QCPN標識された細胞は、ニワトリ胚の間充織内に散在しているE5（図4C）で上顎のプロセス。 QCPN抗体は簡単にホスト環境でのウズラ由来NCCSの分化を調べるために他の抗体と組み合わせることができます。ウズラNCC由来の三叉神経感覚ニューロンはQCPNとTuj1抗体（図4D）によってラベルが付けられています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" /> 図1。実験手順と必要な機器の概要について説明します。）ホスト（ひよこ）とドナー（ウズラ）の胚ステージ一致する必要があります。三叉神経節および顎下顎、地域に貢献するNCCストリームにラベルを付けるには、HH9が理想的です。 HH9で、神経管は、吻​​側領域で閉じ始めているが、まだ完全に密封されていません。図中の灰色の線は、閉鎖神経管の正中線を表しています。点線の白い線は、ホストとドナーから神経管の右側の脳領域を切り出すため、切断線を示すEMbryos。宿主胚の摘出した領域が破棄され、ドナー組織は、キメラ胚を生成するために移植されています。 B）必要な機器は、次のとおりです。）5mLを18とシリンジ½Gの注射針、b）が26と1 mLのシリンジ½45°の角度、c）を墨でGの注射針を曲げ、d）の明確なパッキングテープ、e）を口にピペッティングしたガラスピペット装置、f）は60ミリメートル、ペトリ皿、G）AAピンセット、h）の鋸歯状のヒント、私の湾曲した虹彩の鉗子）＃5鉗子、j）の罰金はさみ、k）はlのタングステン線をシャープ）ガラス針、m）をパラフィルムを引っ張った正方形。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" /> 図2。 18の理想的な挿入ポイントを含む卵の卵および胚の作製 ）断面図、½アルブミン光の撤退のためにGの注射針。 B）光アルブミンの〜3mlのを撤回した後、卵黄と胚は、研究者は、tに &quot;窓&quot;（矢印）をカットすることができ、卵内に下げる彼は、胚にアクセスするには卵殻。インドのインクは、滅菌リンゲル液で1:10に希釈し、胚の簡単なステージング用にコントラストを提供するために、胚盤葉の下に注入することができます。インクの後C）ニワトリ胚。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" /> 図3。移植手順の各ステップで回路図とHHステージ9ドナーとホスト胚の例）。ニワトリ宿主胚。図中の破線は、卵黄膜が移植のための脳神経領域にアクセスするために引き裂かれるべき場所を示しています。卵黄膜のかつて引き裂かれた三角形のフラップが尾側に剥離する必要があります。画像内のボックスは、（BC）に使用されるはめ込みを示しています。 &#39;）ウズラのドナー胚。画像は、ドナー胚卵から摘出し、移植組織の解剖用シャーレに入れである。画像内のボックスははめ込みます（B &#39;）で使用されていることを示します。卵黄と卵黄膜がtを除去するためにカットすべき場所の概略図の破線は（ &#39;）を示す卵から彼は胚。移植を待って摘出した神経管（白矢印）の一方的な脳領域とB）ホスト胚。カットは、中脳領域での消費税神経管に行われるべき場所の概略図で点線を示します。 B &#39;）摘出した神経管背側に移植組織（黒の矢印で示された移植組織）を持つドナー胚。カットが神経管の脳領域の移植のために一方的な消費税ドナー組織にウズラ胚で行われるべき場所の図の点線が示しています。ニワトリ中脳領域にウズラの神経管背側の外植の移植後のC）キメラ胚。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" /> 図4。免疫は、キメラ胚におけるドナー由来細胞におけるウズラ特異的核抗原QCPNを検出する。A）キメラHH11（HH9でグラフトされた）のホールマウントイメージQCPN赤で染色し、HNK-1染色（NCCSの移行のマーカー）を示すで緑色に点灯します。倍率10倍、背ビュー。神経管と渡り鳥NCC HNK-1（緑）との共染色にQCPN陽性ウズラ由来の細胞を示す（A）の胚を介してB）断面図。 40X倍率。 C）キメラE5の上顎のプロセスを介してクロスセクション（3日後に移植インキュベート）、胚の最終ロケーションに神経管のグラフト領域から移行したQCPN陽性NCC-由来細胞（赤）を示す。倍率10倍。 TuJ1陽性ニューロン（緑）に三叉神経節（赤）と分化にNCCを導出したウズラのE5キメラを示す貢献を通じて、D）のセクションをご覧ください。 40X倍率。 *、NCCS、MP、上顎のプロセス、NT、神経管、TG、三叉神経節。

著者らは、開示することは何もありません。

ホストのニワトリ胚にウズラの神経管の移植はrostro-尾軸に沿って21,67-69さまざまな地域から発せられるNCCSを移行し、特定の集団を追跡するための簡単で安価な手法であるここで説明する。この手法は、実験的に調べるために、鳥類の胚へのアクセスのしやすさ（哺乳類胚に比べて）を活用し、そのような組織切除、阻害分子の注入、または発現プラスミドのエレクトロポレーション?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ひよこの卵</td><td>様々な - 私たちはテキサスA＆M大学の家禽科学部、TXを使用しています。 </td><td></td></tr><tr><td>ウズラの卵</td><td>様々な - 我々はオザークエッグ社、MOを使用しています。 </td><td></td></tr><tr><td>卵インキュベーター（デジタルリードアウト1502スポーツマンインキュベーターのw /湿度110から120ボルトAC） </td><td> <a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank">www.poultrysupply.com</a> </td><td> 1502 </td></tr><tr><td>デュモンAAピンセット、イノックスエポキシコーティング</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11210から10 </td></tr><tr><td>スコッチテープ</td><td>すべてのオフィス用品店</td><td></td></tr><tr><td>湾曲したアイリス鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11065から07 </td></tr><tr><td>私はndiaインク</td><td>任意の画材店</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌（ペニシリン、ストレプトマイシン）ソリューション</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 101447-068 </td></tr><tr><td>明確なパッキングテープ</td><td>すべてのオフィス用品店</td><td></td></tr><tr><td>針引っ張って装置</td><td> Narashige、日本</td><td> PE-21 </td></tr><tr><td> 1.5から1.8×100ホウケイ酸ガラス毛細管から作られたプルアップガラス針、 </td><td>キンブルチェイス</td><td> 34500 99 </td></tr><tr><td> 5から作られたガラスピペット、¾ &quot;パスツールピペットを引く</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から678-6A </td></tr><tr><td>口ピペット装置（キャリブレーションマイクロキャピラリーピペット用吸引チューブアセンブリ） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A5177-52A </td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251から30 </td></tr><tr><td>トゥンgsten線、0.1ミリメートルの直径</td><td> VWRインターナショナル</td><td> AA10404-H2 </td></tr><tr><td>ニードルホルダー（ニッケルメッキピンホルダー） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26018から17 </td></tr><tr><td> QCPN抗血清</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学</td><td> QCPN </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®二次抗体（例えば、Alexa Fluor 594のヤギ抗マウスIgG1） </td><td>インビトロジェン</td><td> A21125 </td></tr><tr><td>リンゲル液（2L）： <ul><li> 14.4グラムのNaCl </li><li> 0.34グラムのCaCl 2 </li><li> 0.74グラムのKCl </li><li> 0.230グラムのNa 2 HPO 4 </li><li> 0.04グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 2LまでのddH 2 O </li><li>フィルタとオートクレーブ</li></ul></td><td>フィッシャーサイエンティフィックからすべての試薬</td><td><ul><li> 7647-14-5 </li><li> 10043-52-4 </li><li> 7447-40-7 </li><li> 7558-79-4 </li><li> 7778-77-0 </li></ul></td></tr></tbody></table>

analysis of neural crest migration and differentiation by cross-species transplantation

鳥類の胚は卵内の胚​​の簡単なアクセスのために多くの脊椎動物の発達過程を研究するためのユニークなプラットフォームを提供します。ウズラのドナー組織が​​OVOでニワトリ胚に移植されたキメラ鳥類の胚は、鳥類の胚によって提示された操作の容易さと細胞集団の消えない遺伝標識のパワーを兼ね備えています。 ウズラ-ニワトリキメラ1-3渡り鳥神経堤細胞（NCCS）をトレースするための古典的なツールです。 NCCSは、発展途上の神経管4の背側領域に由来する胚における細胞の一過性の渡り鳥集団である。彼らは、葉への移行上皮を受け、その後、彼らは軟骨5-13、メラノサイト11,14-20、ニューロンとグリア21から32までを含む様々な種類の細胞に分化する胚の他の地域に移行します。 NCCSは多能性であり、その究極の運命はインフルです。1）彼らは胚11,33-37、2 rostro -尾軸に沿って発信された神経管の領域）が38から44に移行するように隣接セルからの信号を、その究極の3）微小で積んだ胚45,46内の宛先。胚内での最終的な位置と運命に、神経管に由来それらの点から、これらの細胞を追跡し、パターニングおよび器官形成を制御する発達過程に重要な洞察を提供します。 ドナー神経管（グラフトホモトピック）またはドナー神経管（グラフト異所性）の異なる領域の相補的領域の移植はrostro-尾軸に沿って2,47 NCCSの事前の仕様の違いを明らかにすることができます。この手法は、さらに一側がドナー組織由来されるように、神経管の一方的なコンパートメントを移植するように適応し、反対側の遺跡は、ホスト胚に動じない、yiをすることができます同じサンプル2,47の内部制御を薪。前方神経管47を閉じたときにも、HH10した後、後で胚の脳セグメントの移植に適合させることができます。 ここでは、神経管の独立したセグメントから派生した渡り鳥NCCSのトレースを可能にする神経管移植を介して、ウズラ - ニワトリキメラを生成するための手法を報告します。ウズラ固有QCPN抗体を48から56のドナー由来細胞の種特異的標識は、研究者は実験終了時点で、ドナーと宿主細胞を区別することができます。この手法は、安価で、簡単で、トレース、およびrostro-尾軸45に沿って事前にパターニングイベントを識別する運命マッピング、細胞系譜を含む多くのアプリケーションを持っています。ので、鳥類の胚へのアクセスのしやすさから、ウズラ-ニワトリ移植技術は、他の操作と組み合わせて含むが、レンズのアブレーション4に限定されるものではない0の場合、胚の発達プログラムの摂動にNCCSの特定の渡り鳥ストリームの応答を識別するために、阻害分子57,58、または59から61発現プラスミドのエレクトロポレーションを介した遺伝子操作の注入。さらに、この移植技術はまた、鳥類の胚の操作のしやすさとマウス遺伝学の力を組み合わせることがNCCの顔面形態形成への貢献や、マウス、ニワトリキメラを勉強するようなウズラ、アヒルのキメラのような他の種間キメラ胚を生成するために使用することができ62

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation at JoVE.com

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

ウズラ - ニワトリキメラ胚における鳥類の神経堤細胞の遊走と最終的な運命を分析するためのアプローチが説明されています。このメソッドは、unmanipulatedニワトリ胚内で区別することはそうでなければ困難な移行および分化における神経堤細胞をトレースするためのシンプルで簡単なテクニックです。

クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

analysis-neural-crest-migration-differentiation-cross-species

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.7K ビュー.  Rice University. ウズラ - ニワトリキメラ胚における鳥類の神経堤細胞の遊走と最終的な運命を分析するためのアプローチが説明されています。このメソッドは、unmanipulatedニワトリ胚内で区別することはそうでなければ困難な移行および分化における神経堤細胞をトレースするためのシンプルで簡単なテクニックです。

ビデオ: Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

神経科学

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

マウスで作業していて、メモリの参照を評価するためのT-迷路強制交替と左右弁別課題

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...