この作品は、欧州プロジェクトBRIANBOW（FP7-ヤング探検家によってサポートされていました、著者は、ビデオで使用されるグラフィックスの生産に彼女の助けのための原稿上の有益なコ​​メント博士ヤコポTessadori、そしてシルビアChiappaloneに感謝したいと思います。

手順は、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hの基準に準拠して行われていたし、テルアビブ大学動物実験委員会（許可番号 - L-14から019）によって承認された。 楽器とPDMSの作製<ol><li>ウェハ（ 材料の表を 、または微細加工研究室からウェハを注文）の準備、外科用メス、およびピンセット-殺菌は必要ありません。 </li><li>以下の条件に従って、ポリ-D-リジン（PDL）溶液を作る：4ミリグラム/ 0.1 Mホウ酸緩衝液中に加え、pHを8、店舗-20℃。 </li><li>以下の手順に従って、PDMSのステンシルを準備します。 <ol><li> 10の割合と共にベースと硬化剤を混合することにより、ポリジメチルシロキサン（PDMS、シリコーンエラストマー）を調製：1、次に約5分間2物質をかき混ぜる。 </li><li> 15分間二回真空チャンバー内の各時間を置き、気泡がなくなっていることを確認します。 </li><li>いつガスの使用を可能にするオープン窒素ノブスピナー上のシリコンウェハ（ 図1A）を配置し、移動するのを防ぐために真空を使用しPDMSをスピンコーターを準備する、準備ができている。 </li><li>ウエハ上にPDMSを注ぎ、1000rpmで1分間スピナーをアクティブ（約100μm、高さが作成されます）。 </li><li> 30分間、100℃のホットプレート上でウェハを置きます。 </li><li> PDMSが硬化した場合には、パスツールピペットを用いて、PDMSとステンシルの国境を概説。 30分間、100℃のホットプレート上でウェハを置きます。 </li><li> PDMSの境界線が硬化したら、国境に応じてステンシルをカットし、ウエハからシリコンステンシルを剥離し、メスを使用します（単一のパターンを含む二乗PDMS）。 </li></ol></li></ol> 2.ペトリ皿とカバースリップの準備<ol><li>次の順序に従って、23ミリメートル角のガラスカバースリップを準備し、それらをきれいに： <ol><li>蒸留水、70％エタノール、及びアセトンで洗浄する。 </li><html><li>窒素でイソプロパノールと速乾性で洗うこと。 </li></ol></li><li>カバースリップ上にパターン化されたPDMSのステンシルを置き、優しく、彼らはしっかりとガラス表面に付着していることを確認するために押してください。 15分間の真空チャンバ内に配置する。 </li><li>ステンシル上のPDLの1ミリリットルをドロップします。二回20分毎の時間のための真空チャンバー内にカバースリップを挿入し、乾燥させるために、PDL O / Nを残す。 </li><li>支持細胞のネットワークを作成するためにペトリ皿を準備します。 <ol><li> RTで2時間PDL 1mlでディッシュ（3.5センチ）の表面を覆う。ピペットを用いてPDLドロップを削除します。 </li><li>蒸留水で洗浄し、乾燥さのまま。カバースリップの各コーナーにシリコーングリースの非常に小さなドロップを置きます。 </li></ol></li><li>添付ファイルを確認するために優しくペトリ皿（ すなわち、PDMSを上にする必要があります）、Enterキーを押しの中央にカバースリップを置きます。 </li><li>静かにピンセットを用いてカバースリップからPDMSを取り除く。殺菌のために、7分間UV照射にさらす。 </li></ol>ル &quot;&gt; 3。マルチ電極アレイ（MEA）の作製<ol><li>この順序（ 材料の表 ）のクリーンMEA： <ol><li>濃縮酵素の洗剤でタップし、超音波処理下に水で3回洗浄する。 </li><li>蒸留水中で超音波処理3回。 </li><li> 30分間のUV下で3回と場所のために（フード、千μlの先端に）蒸留水で洗ってください。 </li></ol></li><li>ネットワークの準備をサポートする： <ol><li>設計されたサポートネットワーク金型を準備します。 <ol><li> 12ウェルプレート（直径22mm）にPDMSを注ぐ。 </li><li> PDMSが硬化されると、金型を取り出し、メスを用いて、リング状を作成するために真ん中に穴をカット。 </li><li> MEA（ 図2A）の中心に設計されたサポートネットワーク型を置き、室温で2時間、PDLで表面の残りの部分をカバーしています。 </li></ol></li><li>ピペットを用いてPDLを削除し、蒸留水で洗浄する。 </li><li>金型を外し、（ 図2A）を乾燥させるために残す。&lt;/ LI&gt; </ol></li><li>以下の方法でMEAにステンシルを揃える： <ol><li>指定されたマイクロマニピュレータにステンシルを置きます。正確に電極にパターン化された構造を合わせ、そしてそれは、MEA面（ 図2B）上に置かれるまで、ステンシルを下げるために倒立顕微鏡を使用してください。 注：よく洗浄MEAとの接触は、PDMSとMEA自体の間で競争力のある接着性を提供します。 </li><li>マイクロマニピュレーターを持ち上げ、必要に応じて、それはMEAから取り外し防ぐために、PDMSの上に少量の圧力を適用するためにピンセットを使用しています。 </li><li>静かにMEA表面にステンシルを押して、それがしっかりと取り付けられており、十分に整列されていることを確認するために顕微鏡を使用しています。 （ 図2C、D）。 </li></ol></li><li> 15分間の真空チャンバ内にMEAを配置する。ステンシル上のPDLの1ミリリットル降下を置く。 </li><li>真空チャンバ内に20分間ずつ2回を挿入します。インキュベーター内でO / Nを乾燥させるために、PDLのままにしておきます。 </li><li>メッキ前に、多国間環境協定からPDMSのステンシルを削除し、wは、滅菌使用して洗う試合開始。 7分間UV照明の下に配置します。 </li></ol> 4.解剖と文化<ol><li>ヘルツォークら 2011 21で説明したように文化を準備します。 </li></ol> 5.めっき<ol><li> （結果で述べたように、回路の大きさに応じて最適な濃度）を、血球計数器を用いて、めっきに必要な細胞の数を計算する。 <ol><li> （きれいにアルコールを使用）、計数室（血球計）がクリーンであることを確認し、その上にカバースリップを配置。 </li><li>培地（希釈1:20）メッキの190μlの細胞懸濁液10μlを希釈する。 </li><li>負荷希釈した細胞の10μlの計数チャンバーの端の上にゆっくりとチャンバーがそれ自体を充填することができた細胞をピペット。 </li><li>倒立顕微鏡を用いて、血球計算グリッドを視覚化。 （健康な細胞がラウンドであるべき）直接計数によってチャンバ内のセルの数を決定します。大きな正方形コーティングしていない内のセルを数えるエッジを横切るものをUT。 </li><li>細胞の濃度を計算する。 細胞/ 1000 10 4×希釈係数×カウントμL=総細胞（血球計の面積）の合計数。 注：例えば、希釈倍率が20であり、計数した全細胞は100であった場合。 100×20×10 4 = 0.1×10 7細胞/ 1,000μlの1×10 6 /100μlの。 0.75×10 6細胞をプレーするためには、細胞外に75μlのを取る。 </li></ol></li><li>単一のMEAまたはペトリ皿当たりめっきに必要な細胞の数を取る凝集を防止するために細胞を再懸濁し、そしてpatternate領域の上に、中央にそれらをプレート（必要であれば、それは培地で細胞を希釈することが可能である） 。 MEAの場合、途中で100μlの低下を置く。カバースリップの場合は、途中で千μlの低下を置く。 </li><li> 40分間37℃で平板培養した細胞をインキュベートします。 1まで、播種した細胞をプレーティング培地を追加MEAあたりミリリットル、カバースリップあたり2ミリリットル。 </li><li> 37℃で維持し、4日ごとに、0.5ペニシリン - ストレプトマイシン、2％B-27及び0.75％グルタマックスに富む新鮮な増殖培地で希釈する。 </li><li> DIV 6/7からは、島々の間の接続を見た後、10μL/ mlのFUDR（25 mgのデオキシウリジン+ 62.5 mgの12.5ミリリットルMEM（最小必須培地イーグル）におけるウリジン）またはグリアを防ぐために、他の抗有糸分裂剤を含む培地を希釈異常増殖。 </li></ol>

<ol>
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E., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neural+representation+capacity+by+modular+architecture+in+networks+of+cortical+neurons.">Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).</li><li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microelectrode+array+(MEA)+integrated+with+clustering+structures+for+investigating+in+vitro+neurodynamics+in+confined+interconnected+sub-populations+of+neurons.">A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).</li><li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations.">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PloS One. 9, e107400 (2014).</li><li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+synchronous+oscillations+in+freely-organized+small+neuronal+circuits.">Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits.</a> PloS One. 5, e14443 (2010).</li><li>Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+neuronal+circuits:+a+new+platform+for+studying+the+role+of+modular+topology.">Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology.</a> Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).</li><li>Bonifazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+large-scale+experimental+and+theoretical+studies+for+the+realization+of+bi-directional+brain-prostheses.">In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.</a> Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).</li><li>Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triangular+neuronal+networks+on+microelectrode+arrays:+an+approach+to+improve+the+properties+of+low-density+networks+for+extracellular+recording.">Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).</li><li>Marconi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+functional+properties+of+neuronal+networks+with+controlled+topology.">Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology.</a> PloS One. 7, e34648 (2012).</li><li>Taylor, A. 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J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+properties+for+biomedical+micro/nanosystems.">Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems.</a> Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).</li><li>Campo, A. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8:+a+photoresist+for+high-aspect-ratio+and+3D+submicron+lithography.">SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography.</a> Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).</li><li>Liu, G. T. 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W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Fixed-Array+Multi-Microelectrode+System+Designed+for+Long-Term+Monitoring+of+Extracellular+Single+Unit+Neuronal-Activity+In+vitro.">New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro.</a> Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).</li><li>Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+of+spontaneous+activity+with+photoetched+microelectrode+surfaces+from+mouse+spinal+neurons+in+culture.">Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).</li><li>Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniature+microelectrode+array+to+monitor+the+bioelectric+activity+of+cultured+cells.">A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.</a> Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).</li><li>Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+validation+of+in+vitro+extra-cellular+neuronal+recordings.">Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings.</a> J Neural Eng. 8, 056008 (2011).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).</li><li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture.">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li><li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth.">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li><li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture.">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li><li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks.">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 36, 135-141 (1998).</li><li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays.">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li><li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates.">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

機能的に相互接続された回路からなる、in vitroでの2Dモジュラー神経ネットワークを成長させるためのプロトコルについて説明する。手順は、細胞の接着層をパターニングに基づいています。パターニングは、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を再現するPDMSのステンシルを用いて達成される。 PDMSのステンシルは、細胞接着層が​​堆積される領域を定義する。細胞がメ?...

実験と理論の証拠は、脳が一過お互い、シェーピング、基礎となる別の脳の状態と対話ダイナミック機能ユニットとみなすことができるセルアセンブリ1-5、の協調活性化を介して動作している可能性を支持している。機能モジュール性にも依存すると脳回路6,7の構造的なモジュラー組織に関連付けられている。どの機能と脳回路の構成は相互に形状がまだ神経科学の主要な未解決の問題の一つである。この問題のより深い理解を提供するために、それは対処することが可能であり、少なくとも部分的に、これらの問題に最適な実験的なフレームワークを同定することが重要である。 in vivo実験で神経回路網の時空間的動態の制御された操作が困難であるので、 インビトロでの神経回路網モデルの開発は、その容易なaccのに重要な関心事であるessibility、監視、操作とモデリング8,9。近年では、高度な基板のパターニング方法でサポートされているインビトロの技術は、事前定義されたモジュラー構造体3の範囲を開発するために、神経細胞のネットワークを誘導し、課せられたトポロジ10とのネットワークの機能的特性を研究することができました。特に、本 ​​発明の方法は、最近、物理的な制約を課すことにより4,11ネットワークを編成するために使用された。実際に、神経回路網における構造と機能との間のリンクを研究し、ニューロンアセンブリを相互作用の簡略化したが、妥当な表現を提供するために、in vitro系は、相互接続された神経細胞の亜集団を提供するべきである。広く研究されている2D均質なニューロン培養は、回路の自己組織創発配線上の任意の空間的な制約を課さない。そのため人工的に相互接続された電池アセンブリを形成するための可能なアプローチは、スパッツの異なるニューロン集団を配置することであるially異なる領域。これらの領域間の距離は、インターアセンブリの接続を防ぐことはできません。このアプローチは、ネットワークの複雑性を超えるかなりの制御を確保しつつ、同期モデル6,7,12の豊かなレパートリーを提供することが示されている。 モジュラー神経アセンブリの再現性の培養を容易にするために、軸索および樹状突起によって連結されたニューロンのクラスタにネットワークの自己組織化を組み立てるためのプロトコルを提示し、説明する。神経細胞培養の物理的閉じ込めのためのポリマー構造がpolydimtheylsiloxane（PDMS）から作成されました。 PDMSは広くガス13に、その生体適合性、透明性及び透過性のために、生物医学的用途に使用されるエラストマーである。 PDMSをスピンコートジャックらに以前に記載されている「マスター」に液体PDMSを16 Tによって2075 14,15の構造を作製し、マイクロマシンSU8から除外される彼は、異なるサイズの相互接続されたモジュールで構成され、それらが成功したカバーガラスと微小電極アレイ（MEAの）17-20の両方で得られたパターン化された神経回路網を達成しました。モジュール間の接続の密度は、モジュール間の同期の過渡状態に、均一な培養の典型的な、完全に同期化ネットワークから、ネットワーク同期の機能を変更することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Vacuum Chamber</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>5305-0609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine PDL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell - Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well culture plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8217;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA1060-Inv-BC</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC02</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>03-033-1c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>01-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Electrode Arrays 4Q</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td>
			<td>cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon wafer</td>
			<td>microchem</td>
			<td>SU8-2075</td>
			<td>Preparation protocol: www.microchem.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, surface treatment, cellular plating, and culturing of modular neuronal networks composed of functionally inter-connected circuits

脳は協調活性化し、神経アセンブリの動的な通信を介して動作します。主要な未解決の問題は、最も多様な脳機能の基礎となる力学モチーフの膨大なレパートリーは、脳回路の固定されたトポロジカルとモジュラー組織の外に出てくることができる方法です。現在の本質的な実験的な困難神経回路のin vivoでの研究と比較して、in vitroでの製剤は、実験的なニューロン系の、構造的な力学的特性および化学的特性を操作し、プローブするための非常に大きな可能性を提供する。この作品は、空間的に異なる、機能的に相互接続された神経細胞の集合体で構成モジュラーネットワークの成長を可能インビトロ実験方法について説明します。プロトコルは、位相的複雑さの異なるレベルでの神経回路網の2次元（2D）アーキテクチャを制御することができる。 目的のネットワークパターニングが可能正規のカバースリップと基板埋め込みマイクロ電極アレイの両方を達成しました。微細加工された構造は、シリコンウエハ上にエンボス加工され、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を含む生体適合性ポリマーステンシルを作成するために使用される。ステンシルは、細胞接着を促進するための分子層を有する表面コーティング手順中に培養基質上に配置される。ステンシルを除去した後、ニューロンは、めっきされ、それらは自然発生的に被覆された領域にリダイレクトする。インターコンパートメント距離を小さくすることにより、それが単離または相互接続されたいずれかの神経回路を得ることができる。細胞生存を促進するために、細胞を培養皿の周囲に配置され、支持神経回路網と共培養する。基板埋め込みマイクロ電極アレイおよびカルシウムイメージングを使用することによってそれぞれ得られたモジュラーネットワークの活性の電気生理学的および光学的記録が提示されている。各モジュールはSPONTを示しているがaneousグローバル同期は、モジュール間の同期の発生は回路間の接続の密度によって調節される。

約100μmの特徴厚さを有するシリコンウェハ上SU8-2075モールドはPDMSを成形するために使用した。パターンは、辺長との距離は200との間に700ミクロン（ 図1B）を変化させて、いくつかの寸法の正方形で構成された。正方形のサイズは（辺の長さ&lt;800ミクロンとの島々のための）10Xのと（辺の長さ&lt;400ミクロンとの島々のための）20Xの目的の視野に合うように選ばれました。三つのパ...

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Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

この原稿は、空間的に閉じ込められた、機能的に相互接続された神経回路からなる生体外モジュラーネットワークで成長するプロトコルについて説明します。ポリマーマスクは、培養基材上に細胞接着を促進するために、パターンにタンパク質層が使用される。メッキニューロンは、被覆された領域自発的な接続を確立し、電気生理学的活性を示す上で成長。

デザイン、治療、セルラーめっき、機能的に相互接続された回路で構成モジュラー神経回路網の培養表面

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

design-surface-treatment-cellular-plating-culturing-modular-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K ビュー.  Tel-Aviv University. この原稿は、空間的に閉じ込められた、機能的に相互接続された神経回路からなる生体外モジュラーネットワークで成長するプロトコルについて説明します。ポリマーマスクは、培養基材上に細胞接着を促進するために、パターンにタンパク質層が使用される。メッキニューロンは、被覆された領域自発的な接続を確立し、電気生理学的活?...

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

神経科学

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

動物を振る舞う、覚醒中のシングルユニット記録のためにマイクロワイヤの組織化された配列を移植するための手順

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

閉ループ神経のロボット実験は、神経回路網の計算特性を試験すること

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

ニューロン回路の再学習：速い神経突起伸長と機能的ニューロン結合の新しい方法

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...