著者らは、SEMイメージングのためのSU-8の作製とマリア·ベッカー（ISAS）のためのウルリッヒマルクグラーフ（ISAS）に感謝しています。研究は財政的にドイツ学術振興（DFG WE3737/3-1）、BundesministeriumエリーゼBildungウントForschung助成金（BMBF 0101-31P6541）でかつMinisteriumエリーゼイノベーション、WissenschaftウントForschung DESランデスノルトライン·ウェストファーレンによってサポートされていました。平家Hardelaufおかげインターナショナルライプニッツ研究科「システム生物学ラボオンチップ」の財政支援のために。

プロトコルは、神経科学者を対象としており、 図2にまとめた。そのためには、商業や機関の施設に委託されたPDMS複製に使用SU-8マスターズの微細加工をお勧めします。 2レイヤーマスクのデザインは、化学のウェブサイト12の王立協会の補足説明（ZIP形式）として自由にご利用いただけます。重要なのは、最初のSU-8層は、2.5〜3.0ミクロンの深さまで製造され、25〜30ミクロンの深さに二する必要があります。これらは、効果的なニューロン整列のために必要な重要な寸法です。 3ミクロンの高さの限界は、二つの区画12との間を搬送または移行されたニューロンを防止することも必要である。 PDMS中の1。マイクロ流体デバイスの複製<ol><li> 10:1の比率で硬化​​剤（184）で十分にPDMSプレポリマーを混合し、通常、20分間真空デシケーター中での混合物を脱ガス。代わりに、ミックスを入れて50ミリリットルファルコンチューブ内TUREと低gを使用してください 脱気のための遠心分離。 </li><li> 80℃のホットプレート上で2層の微細構造、SU-8のウエハを配置し、ウエハ上の各デバイスに、ポリマーフレームを合わせます。 ≥5ミリメートルの深さのフレームに、PDMSを注ぎ、&gt; 1時間が終了し、熱硬化性を確保することができます。 </li><li>硬化した後は、ホットプレートからウエハを取り外し、平らな面に冷却します。 </li><li>優しく賞ウェハからフレームとPDMSをする剛性のメスで（離れて、SU-8の微細構造から）1コーナーから保護メガネと仕事を着用してください。 </li><li>フレームからPDMSモールドを取り外し、過剰PDMSのデバイスをトリムするはさみを使用しています。 PDMSの薄膜は、ポリマーフレームとウェーハ表面との間に広がるときに、いわゆるフラッシングがしばしば製造される。 </li><li>残りPDMSは、ウェハ全体に塗布し、貯蔵中にウェーハを保護するために硬化させることができる。前その後のデバイスの成形にこれを削除し、そうすることで任意のPを削除表面から汚染物質を明確に。 </li></ol> 2。デバイスアセンブリおよび相互接続<ol><li>直径3mmの生検パンチを使用して6インタフェースポートを準備します。良好な光の条件にして、マイクロ流体チャネルとポートの配置を支援するために上に向けて、微細構造化機能を備えた、暗い表面に取り組んでいます。 </li><li>微粒子のための装置を点検してください。可逆粘着テープを使用して、これらを削除します。 </li><li>マイクロ流体回路は、ガラスカバースリップ上に取り付け薄いPDMS層を使用してカプセル化されている：これらは、可撓性のベース上にPDMS硬化剤混合物（10:1、601）を少量（〜0.5ml）に注ぐことによって調製される、細菌学的グレードのペトリ皿。優しく、PDMS層上にカバースリップを押して数分のためのホットプレートと熱的に治療上の場所。すぐに冷却した後、ペトリ皿からカバーガラス-PDMS重層を切り出して、賞にメスを使用しています。必要に応じて、はさみでトリミング。 </li><li>プラズマ結合のPDMSデバイスおよび良好なシールを生成するために、支持層：最適な条件は、機器固有のものです。たとえば、40秒間0.2ミリバール、酸素雰囲気中で70 Wおよび40 kHzで動作するプラズマ炉は、優れたPDMS-PDMS結合を生成する。プラズマ処理後は、一緒に両方の部分を押して、完全に結合する分に向けて出発。 </li><li>ポンプやシリンジとインタフェースするように、シリコンチューブ（3.2ミリメートル外径1.6ミリメートルID）を使用してください。 </li></ol> 3。生体材料のパターニングおよびマイクロ流体操作 その場での生体材料のパターニング、ニューロン培養物と流体的処置のためのプロトコルは図2に示されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> 図2図示のマイクロ流体プロトコル。 A）PL と、PLL-G-PEGパターニング ;細胞接着層の添加（ 例えば 、PL、緑）、蒸発水整列マスクB）露出PLの大気空気プラズマ処理を産生有する。 2アンテナ端子はピンクの星を示すプラズマ導入アンテナと、使用されている。吸引によりC）PBS（青）洗浄は、PLでプラズマ処理された地域の汚染を避けるために使用されたPLL-G-PEGの。D）テイクアウト （赤。）による被覆する吸引プラズマ処理された領域がE） セル負荷 ;静油圧駆動流を用いて吸引の両方に隣接する区画へのニューロンの同時マイクロ流体アレイ化、F）メディア（ピンク）灌流G） 絶縁流体トリートメント 。試験剤（黒）の周辺治療を吸引し、吸引によって底部中央入口から配信さH）中央処理により下部に隣接する入口から配信。化学の王立協会の許可を得て複製図と凡例（RSC）12。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> PDMSマイクロ流体チャネルとを接合直後の血漿（5°≤接触角）高親水性である。このような表面は、分化したヒトSH-SY5Yニューロン様細胞のような細胞株の付着及び培養に適している。一次ニューロンなどルンドヒト中脳細胞株（LUHMES）ポリアミンコーティング、ポリリジン（PL）又はポリオルニチン（PO）のいずれかとして神経前駆細胞株の培養物のex vivo培養のために、静電アンカーとして必要とされる。さらに、ラミニンやフィブロネクチンなどの接着タンパク質は、多くの場合、インテグリンのインタフェースコーティングとして必要とされる。しかし、PLと、POコーティングが容易にアレイ·サイトへのマイクロ流体供給を妨げ、また、不要なせん断応力を課し、神経細胞と結合する。この問題を解決するために、チップ内の生体材料パターニングは、トラップサイトと伸長マイクロチャネルでの接着材を定位させることが求​​められる。これはまた、インターコンパートメント接続の開発を促進し、地元の絡み合いを低減します。プロトコルはまた、タンパク質およびニューロンが長い培養中の所望の位置に制限されるように、隣接領域へのPEG材料の添加を含む。以下のプロトコルは、 図3に記載されています： <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。水は、プラズマステンシルにより生体材料のパターニングのためのマスク。プラズマステンシルのための場所で水メニスカスをピン止めされたPDMSマイクロピラーと水マスク処理のA）のイラスト。垂直面におけるメニスカスの曲率が無視されてきた。b）水マスク赤色染料で可視化し、メニスカスPによって位置決めタンパク質の血漿ステンシル。 日後に画像化されイニング。C）パターン化されたPL-FITCコーティング）付加プラズマパターン化されたPL-FITCコーティングに拒否し、細胞撥PLL-G-PEG-TRITC。これは、SH-SY5Y細胞の登録のために、また、LUHMES細胞のための付加的なフィブロネクチン層をパターニングするために使用した。図や王立化学協会（RSC）の許可を得て複製伝説12。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <ol><li>プラズマステンシルによるその場生体材料パターニングするための水のマスキング<ol><li>まもなくプラズマ接合ピペット後下部中央ポートに、PLまたはPO（100μg/ mlで1X PBS）の0.5μlのボリューム。ほんの数秒以内に全体のマイクロ流体回路は、毛管作用により充填する。ポリAに完全に被覆することで数分の親水PDMS表面に向けて出発地雷。 </li><li> 1分間（ 図2C参照 ）×PBSで吸引駆動の洗浄により未結合のポリアミン分子を除去する。 </li><li>ポートからすべてのPBSを削除し、顕微鏡で照明することにより、デバイスを加熱する。これは、急速な水マスク形成用のポートからの蒸発が増加します。水マスク（ 図3Aに示され、 図3Bに記載されている）を、約5分以内に確立される。 </li><li>水マスキングが完了したことを確認するために顕微鏡によってデバイスを点検します。アレイ部位の上流リザーバ構造は水マスク（〜15分）の安定性を延長するために、マスク設計に含まれることに注意してください。 </li><li>ポート（ 図2B）にステンレス製のピンを挿入します。これらは、大気圧手持ちコロナ放電又はテスラ発生器によって生成されたプラズマ（2 MHzで動作する、 例えば 、30kVの信号）19,20が空いているマイクロ流体チャネルに結合するために使用される。 Tの先端を指す彼は、1ピンとプラズマの先端に近い筋は≤1秒間マイクロチャネルを扱うプラズマ。プラズマパターニングを観察するために、低光条件を使用してください。 </li><li>洗浄工程の水のマスクを削除します。上側の3ポートから並列吸引を使用してください。並列吸引を達成するための吸引ポンプに4ウェイアダプタで接続されたシリコンチューブの4同じ長さを使用してください。吸引を開始し、マイクロ流体回路を介して、PBSを描画するために下の3ポートにPBSを分注する。このように、PDMS -ポリアミン物質のコントラスト（ 図3C参照 ）が生成される。マイクロ流体回路から、PBSを避難し、ネイティブ、疎水性の状態を復元するために数時間を残す。これは、細胞接着にPDMSが完全に非許容にする。 </li><li>ラミニンやフィブロネクチンなどの追加の接着材料は、場合は、以下のステップが必要であり、すぐに水のマスクを除去した後に実行する必要があります必要になること：ピペットのグラフト共重合ポリ-Lの10μl容量-リジン-ポリ（エチレングリコール）（PBS中のPLL-gの -PEG、100μg/ mlの）両方の底部に隣接するチャネルに、2分間の上側隣接チャンネルから吸引した。 </li><li>流れを中断することなく、PBS緩衝液で交換することにより、過剰なPLL-G-PEGを除去。 PEG部分はタンパク質吸着および細胞接着17,21を防止するために作用すると、これは選択的に被覆する、非ポリアミンコーティングされた領域。 </li><li>その後、ポリ - アミンコーティングと共局在することができるように、ラミニンやフィブロネクチンなどの接着タンパク質：これらのECMタンパク質のピペット10μlの容量（通常は10μg/ ml）を3つのすべての一番下のポートへ。デバイスは、タンパク質溶液を充填し、良好な品質のコーティングを製造するために1時間インキュベートされるまで、トップスリーポートからの吸引物。 </li><li>下の3ポートから、PBSを吸引することにより、過剰なタンパク質を除去。 </li></ol></li><li>マイクロ流体シングルニューロンアレイ化<ol><li> appropriとプライムデバイスメディアを食べた。下の3ポートに20μlのボリュームを追加し、上部の3ポートからパラレル吸引により急速にメディアとマイクロ流体回路を埋める。吸引ポンプに等しい長さのシリコンチューブを経由して結合するための4ウェイチューブコネクタ3上部のポートを使用します。 </li><li> （ 図1の0,1）に隣接する入口ポートの各々に脱凝集し、細胞懸濁液を20μl（1×10 6細胞/ ml）を添加する。 </li><li>流量調整と吸引ポンプを装備または上位3ポートからの穏やかな吸引用の注射器を使用しています。完全なニューロンアレイ化は、一般的に1分を必要とします。 </li><li>その後のマイクロ流体デバイスで配列するためのピペットで4隣接ポートに残っている余分なニューロンを収穫します。 </li><li>チューブを外します。メディアにすべてのポートを入力し、インキュベーター内のデバイスを配置します。数時間以内に細胞が生体材料のパターンに完全に接着性になる。 </li></ol></li><li>ニューロン文化、セレクティブフルイディック治療、および免疫nostaining <ol><li> （2ミリメートルの柱の高さの差が適切に遅い）静水圧のフィードを使用して定期的に灌流して、メディアを交換します。 </li><li>代わりに、標準的な細胞培養と同様に（2-3日）を定期的にメディアを交換し、メディア内のマイクロ流体デバイスを沈める。 </li><li>次のように神経細胞培養区画または中央神経突起伸長コンパートメントのいずれかに選択的な流体治療が達成されています。興味のあるチャンネルの一番下のポートに被験物質の20μLを分注して、真上ポートから吸引除去する。長い治療のための流量調節器を使用して流量を減少させ、必要に応じて、被験物質を補充する。 </li><li>免疫染色のプロトコルは、各分子標的および関連試薬によって異なります。遅い流速が使用されたニューロンへの剪断誘発損傷の潜在的危険性に対抗するためである。これは通常のプロトコルの時間を延長する、完全にシステムを灌流するために増加、アプリケーションの時代になる。ハイ（2ミリメートル重量例えば ）異なるカラムの高さにポートを使用してdrostatic灌流試薬を送達するために使用した。ポンプを使用して、より迅速な試薬添加および除去は、実験の時間スケールを減少させるために使用することができる。下の3ポートからの試薬を描画するために、上3ポートに吸引ポンプを接続します。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

マイクロ流体アレイ化技術は、最小限の文化を確立するための単精度ニューロンの取り扱いが可能になり、その種の最初のものです。マイクロ流体構造を用いて細胞のパターンを揃えるその場生体材料のパターニング方法において 、強力なアプローチと相まって、これらのミニマルな文化が減少した地元の絡み合い高intercompartment接続レベルを有する。これらの特徴は、区画間?...

<html>神経組織は非常に複雑である。空間的に細胞接触を通じて、特に軸索と樹状突起増生によって定義層や区画内とプラスチックの接続と一緒に注文された異種の細胞の混合物である。新技術は、より深い洞察力や病気、開発、健康的な機能の中心UNRAVELメカニズムを獲得する大きな実験的な自由を与えることが必要である。 Campenot室1,2、最近微細加工の実施例3,4は、選択的に異なる体細胞集団と、それらの神経突起増生を撹乱する能力を備えたネットワーク接続された神経細胞の共培養のex vivo製造に使用することができる。これらのマイクロ流体デバイスは、たとえば、化学、5,6またはレーザー軸索切断6-8、タウオパチー9、ウイルス伝播10,11、および軸索4におけるmRNAの局在後の軸索の変性と再生を研究するために使用されてきた。 ENT」&gt; 神経生物学者の範囲を拡大するために、技術開発を最小限の神経細胞の共培養を準備する必要があります。これは、単一の細胞と細胞内の精度でシステムの調査のための神経回路網の解きほぐしを可能にします。最小限の細胞数の要件は、パーキンソン病、耳から螺旋神経節、末梢ニューロンに関連するドーパミン作動性黒質細胞を含む希少細胞タイプを分析し、幹細胞の可能性を開く。これ以外に、携帯経済は3Rのイニシアティブに関連しています。これらのマイクロ流体プラットフォームは、大規模な毒性スクリーニングまたは他のハイスループットを用いて、動物のニューロンを必要とするデータに富む一連の実験を考えることができる。 本論文では、マイクロ流体デバイスの製造および使用のためのプロトコルが記載されている。 その場 biomateri 内と組み合わせたマイクロ流体アレイ化他のパターニング方法は、最小限の細胞数を用いて高度に相互接続神経細胞の共培養の登録に使用することができる。マイクロ流体アレイ化は、差動フロー· ​​アプローチの微細構造トラップは流体回路（ 図1のSEM像と一緒に示されている）内に配置されることにより、12月15日 、に基づいています。神経突起伸長チャネルへの入口-パス0→1は、微細構造化アパーチャの直線状のアレイにニューロンを搬送するためのより低い流動抵抗（R 2&gt; R 1）を有する。単一のセルによるトラップの占有率が局部的に近隣のトラップに、その後の細胞を捕捉するための流線をそらすために流れを妨げる。アレイ内のトラップの完全な占有は、過剰なニューロンの除去のための操作のバイパスモードを生成するために蛇行路（0→2）に流線をそらすために、流体の比（R 1&gt; R 2）を切り替える。 図1。マイクロ流体回路。マイクロピラーメニスカス固定有する二重層区画化ニューロン共培養アレイのA）神経突起伸長チャネルによって相互接続された培養チャンバに隣接有する単一ニューロン整列のために微分抵抗流体回路を、B、C）SEM画像である。この設計では、三叉状ニューロントラッピング構造は、神経突起増殖物の束形成を促進するために使用した。図や王立化学協会（RSC）の許可を得て複製伝説12。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> 平面基板上のマイクロパターン神経回路網の製造は容易にexamplのために（達成することができ<html>我々のグループからのESは、Frimat ら 16と平家ら 17）を参照してください。しかし、PDMSデバイス内およびマイクロ流体チャネルへのこれらのマイクロメートルスケール整列の要件を、生理活性物質パターンをカプセル化することは、主要な技術的課題を提起する。セクション3.1にするためのプロトコルは、チップ内、またはその場で 、生体材料のパターンの製造は、提示されている。これらのパターンは、長い培養時間スケールの間にニューロンの登録を有効にして、区画間の増生を促進する。メニスカスピニング微細構造ニューロン部位および神経突起伸長のチャンネルを配列して、所謂水マスクを整列させるために使用される。露出表面は生体材料のパターンを定義するために解砕されるのに対し、水マスクは、プラズマ処理の間、接着分子コーティングを保護する。また、プロトコルは、細胞培養のために、異なる共培養区画の選択的治療のために必要な流体の単離のために設けられている。 ve_content &quot;&gt;プロトコルは同様に、 その場での生体材料のパターニングに蒸発し、表面張力現象を利用し、簡単です。ポリレプリケーション（ジメチルシロキサン）（PDMS）マイクロ流体デバイス18のためのソフトリソグラフィーのユーザーフレンドリーな原則を活用するように設計されており、唯一の安価なハンドヘルド型プラズマ源を必要とする。マイクロ流体回路を効果的にプログラム正しい底部ポートに材料を分配し、上方から吸引するだけで問題これらの操作を行うセル負荷と区画特定の治療法。この方法では、神経生物学者を与えることを意図している自分の研究室でマイクロ流体デバイスを準備し、使用する自由。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">PDMS Sylgard 184</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDMS Elastosil RT 601</td>
			<td style="width:163px;">Wacker</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Coverslips</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td>630-1590</td>
			<td>130-160 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">3 mm Biopsy Punches</td>
			<td style="width:163px;">Kai Medical</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Handle with care - extremely sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">S-50-HL</td>
			<td>1.65 mm ID; 3.35 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix)</td>
			<td style="width:163px;">Braun</td>
			<td style="width:143px;">6064204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">4-Way Tubing Connector</td>
			<td style="width:163px;">VWR or Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Flow Regulator</td>
			<td style="width:163px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:143px;">722645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">0.5 mm Pins</td>
			<td style="width:163px;">Dressmaking Departments</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">PLL-g-PEG</td>
			<td style="width:163px;">SuSoS</td>
			<td style="width:143px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td>
			<td>Stability in storage can be an issue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">poly-lysine-FITC</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P3069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">poly-ornithine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">fibronectin</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">laminin</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">PBS</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Inverted Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">Example Aspiration Pump</td>
			<td style="width:163px;">KNF Neuberger, Laboport</td>
			<td style="width:143px;">N811KVP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">Hand Held Corona Discharge Device</td>
			<td style="width:163px;">Leybold-Heraeus, USA</td>
			<td style="width:143px;">VP23</td>
			<td>May not comply with your country&#39;s safety standards</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Femto Plasma Oven</td>
			<td style="width:163px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Vacuum Dessicator or Centrifuge</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neuronal co-cultures with single cell precision

Campenot室のマイクロ流体の実施形態は、神経科学のコミュニティから大きな関心を集めている。これらの相互接続された共培養プラットフォームは、感染および疾患の伝播に発達および機能的神経生物学に及ぶ、様々な問題を調査するために使用することができる。しかし、従来のシステムは、重要な細胞の一次ドーパミン作動性黒質、スパイラル神経節、およびショウジョウバエキイロニューロンなどの少量の細胞を研究するための不適切な入力（コンパートメントごとに何千）、および高スループット実験のための非現実的が必要です。緻密培養物はまた、非常に局所的に二つの文化を相互接続するいくつかの増殖物（&lt;10％）で、交絡している。 （I）、マイクロ流体、単一のニューロンが方法を配列し、プラズマパターニング生体材料コーティングはREGIするための（II）水マスキング法：本論文では簡単なマイクロ流体とパターニングプロトコルはこれらの課題に対処が記載されているSTERニューロンとコンパートメント間の伸長を促進する。最小限のニューロン共培養物は、高レベル（&gt; 85％）intercompartment接続を用いて調製した単一細胞精度の高スループット神経生物学実験のために使用することができる。

水マスキングエクスプロイトは、表面張力。気液界面での圧力耐性が[曲率半径に反比例<img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" />マイクロ流体寸法で非常に安定インターフェイスを生成する。マイクロピラーを効果的な場所に水マスクを固定。水マスク形成は、加熱によって増加率は、マイクロ流体ポートからの蒸発によって駆動される。低倍率（4X - 10X）からの熱を?...

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Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

生体材料コーティングのチップ内のプラズマパターニングのための単一ニューロンマイクロ流体アレイ化と水のマスキングのためのプロトコルが記載されている。高度に相互接続された共培養細胞は、最小限の入力を用いて調製することができる。

単セルの精度で神経共培養の調製

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

preparation-of-neuronal-co-cultures-with-single-cell-precision

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K ビュー.  ISAS. 生体材料コーティングのチップ内のプラズマパターニングのための単一ニューロンマイクロ流体アレイ化と水のマスキングのためのプロトコルが記載されている。高度に相互接続された共培養細胞は、最小限の入力を用いて調製することができる。 

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Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

神経科学

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経筋共培養

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

動物を振る舞う、覚醒中のシングルユニット記録のためにマイクロワイヤの組織化された配列を移植するための手順

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which macrophages are induced to produce conditioned medium (CM) that promotes neurite outgrowth. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are acutely dissociated and plated. After the neurons are stably attached, peritoneal macrophages are co-cultured on a cell culture insert overlaid on the same well. Dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) is applied to the co-cultures for 24 h, after which the cell culture insert containing the macrophages is moved to another well to collect CM for 72 h. The CM from the co-cultures treated with db-cAMP, when applied to a separate adult DRG neuron culture, exhibits robust neurite outgrowth activity. The CM obtained from the db-cAMP-treated cultures consisting of single cell type alone, either DRG neuron or peritoneal macrophage, did not exhibit neurite outgrowth activity. This indicates that the interaction between neurons and macrophages is indispensable for the activation of macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity into CM. Thus, our co-culture paradigm will also be useful to study intercellular signaling in the neuron-macrophage interaction to stimulate the macrophages to be endowed with a pro-regenerative phenotype.

The current protocol presents experimental procedures to stimulate cultured macrophages to be endowed with capacity to release molecular factors that promote neurite outgrowth. Treatment of cAMP to the neuron-macrophage co-cultures induces the macrophages to produce conditioned medium that possesses strong neurite outgrowth activity.

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・ マクロファージ共培養

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...