我々のアプローチは、磁気操作を用いてニューラルネットワーク形成を制御することを可能にする。これは、ネットワークのインビトロ研究のための効果的なツールであり、バイオインターフェーシングデバイスのための新しい治療方向を提供しています。この技術により、ミクロンスケールで細胞の位置と成長の両方を制御することができ、磁気パターンの柔軟な設計、ネットワーク組織を可能にします。
効率的で非毒性の磁気ナノ粒子の滅菌は非常に重要です。成功するためには、適切な磁性ナノ粒子が必要です。重要な特徴は、サイズ、コーティング、および状況磁化値です。
手順のデモンストレーションは、私の研究室のマスター学生であるロイト・プレンとダフナ・レベンバーグです。まず、スクリバーペンを使用してガラススライドを2センチメートルに切ります。アセトンでガラススライドをクリーニングし、超音波浴でそれぞれ5分間イソプロパノールを清掃します。
その後、超高純度窒素でそれらを乾燥させます。6,000 RPMのスピンコーティングを使用してガラスを60秒間コーティングし、厚さ1.5マイクロメートルを達成し、摂氏100度を60秒間焼きます。フォトマスクまたはマスクレスリソグラフィを使用してサンプルを光源に公開し、目的のパターンを実現します。
メーカーの指示に従って蒸留水で希釈した現像液でサンプルを40秒間開発します。その後、45秒間水で洗浄し、UHP窒素ガスで乾燥させます。光学顕微鏡でパターンを検査します。
蒸着システムのロードロックチャンバーにサンプルを挿入し、ベース圧力を待ちます。サンプルをメインチャンバに移し、堆積のために適切な高さにサンプルをセットします。目的のレートが達成されるまで、各ターゲットの電力を増やします。
回転をオンにし、強磁性多層を堆積させ、コバルト、鉄、パラジウムのターゲットを交互に、それぞれターゲットシャッターを開閉します。コバルト鉄パラジウムの14の二重層を堆積させ、追加のパラジウムキャッピング層で仕上げ。堆積が完了したら、堆積システムからサンプルをアンロードします。
試料をアセトンに30分間浸し、イソプロパノールですすます。その後、UHP窒素でそれを乾燥させ、顕微鏡の下でそれを調べます。使用するまで清潔で乾燥した環境に保管してください。
強磁性多層を堆積させた幅100マイクロメートルの十字形の磁気棒を備えたガラススライドを使用してください。両面テープを使用してサンプルをホルダーに取り付けます。ワイヤーボンダーを使用して、クロス電極の各脚に1本の4本のワイヤをサンプルに接着します。
サンプルに対して磁場が垂直になるように、輸送測定システム内のサンプルホルダーとサンプルを磁場で設定します。テキスト原稿に記載されているように、横電圧測定を行います。磁場を掃引し、横電圧を磁場の関数として測定します。
横方向抵抗を磁場の関数としてプロットし、フィルム内の垂直磁化に比例する異常なホール信号を求めます。テキスト原稿に記載されているように、PC12細胞培養のための基本的な増殖培地及び分化培地を調製する。10ミリリットルの塩基性増殖培地を用いた非処理培養フラスコで細胞を増殖させ、2~3日ごとに10ミリリットルの培地を添加する。
8日後に細胞をサブ培養する。細胞の取り込みのために、細胞懸濁液を200Gと室温で8分間遠心分離し、次に上清を捨てる。新鮮な塩基性増殖培地の3ミリリットルで細胞を再懸濁.
再び細胞を5分間遠心分離し、上清を捨て、新鮮な分化培地の3ミリリットルで細胞を再懸濁する。注射器と針を使って細胞を10回吸引し、細胞クラスターを分解し、ヘモサイトータを使用して細胞を数え、通常のコーティングされていない35ミリメートル皿に100万個の細胞を播種する。MNP懸濁液と分化培地の計算量を皿に加えて、所望のMNP濃度を達成する。
細胞、MNP、分化培地を混合し、24時間摂氏37度で5%炭酸ガス加湿インキュベーターで皿をインキュベートします。70%エタノールでパターン化された基材を洗浄し、フード内の35ミリメートルの培養皿に入れます。パターン化された基板の下に大きな磁石を1分間置き、皿を上下に動かしてマグネットをフードから取り出して取り外します。
紫外線を15分間点灯します。コラーゲン被覆ガラス基材を調製するために、コラーゲンタイプ1を30%エタノール中の1~50比で希釈する。ガラスを溶液で覆います。
すべての溶液が蒸発するまで4時間フードに皿を覆い、滅菌PBSで3回洗います。インキュベーターから細胞を取り出し、200Gで5分間細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨てる。新鮮な分化培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
シード10を35ミリメートル培養皿の中の基質の上の5つの細胞に、分化培地を2ミリリットル加えた。5%炭酸ガス加湿インキュベーターで37°Cで培養をインキュベートします。24時間後、100個から100個の新鮮なマウスβ-NGFを細胞に加える。
分化培地を更新し、2日ごとに新鮮なβ-NGFを追加します。光顕微鏡を用いて2日毎に細胞を画像化し、ネットワーク形成後に細胞上で免疫染色を行う。異なる幾何学的形状を有する磁気プラットフォームを作製し、蛍光酸化鉄MPを核化によって合成した。
MNPsの磁気測定では、磁化曲線にヒステリシスがなく、低飽和磁場であり、磁化飽和度が比較的高いということが示されています。PC12細胞を酸化鉄蛍光剤と混合した培地でインキュベートし、磁性ユニットに変換した。MpPsは細胞のソーマに内在したが、核内には内部化されなかった。
細胞内の鉄濃度は培地中のMNP濃度の増加に伴って増加した。異なる濃度のMNPsに対するMNP搭載PC12細胞の生存率を、ショール解析を用いてMNP負荷細胞の形態学的パラメータを比較することにより評価し、対照細胞との差を示さなかった。XTTおよびResazurinベースのアッセイは、MNPsの評価された濃度が細胞に対して有意な細胞毒性を示さなかったことを確認した。
MNP処理の有無にかかわらずPC12細胞を成長させ、磁気基質上で分化した。磁化された細胞は磁気パターンに付着し、パターンに従って枝を成長させることが判明し、MNP治療を受けていない細胞は磁気デバイスに親和性を持たずに成長した。六角形の幾何学を有する基質上の細胞の位置をここに示す。
MNP装填された細胞体の75%が磁気ストライプに接触していたのに対し、磁化されていない細胞の35%だけが縞に位置していた。細胞の位置決め効果に加えて、これらの磁気プラットフォームは成長する神経突起の方向性を制御することを発見した。神経細胞の成長方向に対する磁気効果を評価するために、神経突起と磁気ストライプの間の角度を測定し、磁気ストライプの配向と有意な相関を示した。
この手順は、磁性ナノ粒子に結合した後、薬物のような活性化合物を導くために容易に適応される。高スループットの薬物スクリーニングアッセイまたは組織内の局所治療に翻訳することができる。この新しいアプローチは、磁気的な魅力的な構造を追加することにより、他の基質やデバイスを機能化するための新しい可能性を開きます。
現在、生体適合性ニューロンチップインターフェースの改良を進めています。
