authors gratefully acknowledge funding support from the Molly Towell Perinatal Research Foundation, Canadian Institutes of Health Research (CIHR), and Fonds de Recherche du Qu&#233;bec &#8211; Sant&#233; (FRQS) (to MGF) and CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (to LDD).
The authors wish to thank Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard and Carmen Movila for technical assistance.

動物のケアは、動物実験と動物実験のモントリオール大学評議会（プロトコル＃10-RECH-1560）による承認のカナダ人評議会のガイドラインに従いました。使用される材料及び方法の詳細については、表1に提供されます。 1.麻酔<ol><li>頸静脈にシングルルーメンカテーテルを挿入します。 </li><li>落ち着いた雌ヒツジ使用してアセプロマジン（Atravetを10mg / mL）を2 mgを静脈内に約30分今度はコルチゾールのレベルを低下させる手順に関連したストレスを軽減するために、麻酔導入前に。 </li><li>全身麻酔を誘導する（ジアゼパムを5mg / mL）を20 mgを、ケタミン（ケタラールを100mg / mL）を4-5ミリグラム/ kgおよびプロポフォール（プロポフォールを10mg / mL）0.5〜1ミリグラム/ kgの静脈内にジアゼパムを管理します。 </li><li>ウィスコンシン型ブレ​​ードで喉頭鏡を使用して気管に気道交換カテーテルを挿入挿管を補助する（エクストラロング350ミリメートルブレード左利き）。気道交換カテーテルオフと気管内にシリコン気管内チューブ（9〜12 mmの内径）をスライドさせます。この技術は、挿管プロセスを容易にします。気管の圧力誘起潰瘍を回避し、羊の頭にチューブを固定するために慎重に気管内チューブのカフを膨らませます。 </li><li>麻酔器の呼吸回路に気管内チューブを接続し、すぐに人工呼吸を開始します。 35〜45 mmHgでの正常範囲内で、P CO 2を維持するために、人工呼吸器の設定を調整します。 </li><li>耳介動脈にカテーテルを挿入します（22、G 20に、[0.9×25 mm]の1 [1.1×30ミリメートル]で1.16）と直接動脈血圧をモニターするために非準拠のチューブに接続します。 </li><li> 5分毎に心電図、直接動脈血圧、酸素飽和度（たSpO 2）、カプノグラフィー（P ET CO 2）、および温度を記録するためにマルチパラメータ生理学的モニターを使用してください。全てのpHを転送中央の生理学的データ収集コンピュータにシリアルケーブルを介してysiologicデータ。循環水ブランケットを使用して、通常の体温を維持します。 </li><li>全身麻酔の最初の1時間は10ミリリットル/ kgでバランスのとれたポリイオン溶液を投与し、その後、5 mLの/ kg /日hに減少します。 </li><li>直前に予防的抗菌薬として皮膚切開に羊にトリメトプリム - スルファドキシンの5mg / kgのIVを管理します。 </li><li>雌羊および胎児のすべての外科的操作で、標準的な無菌技術を使用してください。 </li><li>バリアナース常に雌羊。これは、非外科的な人員を含みます。これは。例えば、Q熱リケッチアのための流行の可能性を最小限に抑え、常に手袋とマスク（N-95型）を使用します。 </li></ol>手術手順の概要2。 <ol><li>腹部の筋損傷を最小限に抑えるために白線を介して乳房に直接頭蓋下腹壁20〜3cmの正中切開を行います。 <ol><li> R頭側大網をetractと子宮角を手動で触診されています。胎児の数とその大きさに気付いて、ホーンの先端に子宮体から各ホーンを触診。複数の胎児がある場合は、手動でヘッドの大きさと軌道の間の幅を評価することにより、より大きな胎児を選択します。 </li><li>しっかりと部分的に体外に子宮を介して選択された胎児の頭を保持します。 Metzenbaumはさみで大きな曲率に10cmの子宮切開を行います。それは手であるかのように滅菌生理食塩水で満たされた非ラテックス無菌手術用手袋の頭の上にすぐに入れてください。また、湿った胎児の頭部を保つために湿らせた四輪駆動車を使用しています。腹壁に子宮を固定します。 <ol><li>左右の胸部手足を体外に出すと剣状突起に子宮までのうち、静かに胎児を引き出します。 </li></ol></li><li>標準カットダウン技術を使用して、左右の上腕静脈と動脈にポリビニルカテーテルを挿入します。 anothを挿入胎児の胸骨にその &#39;末端を固定することにより羊水腔へのERポリビニルカテーテル。 <ol><li>滅菌カテーテルのみを使用してください。私たちはあなたの標準的な設備でガス滅菌をお勧めします。後で採血や圧力の監視を可能にするために二重のコックに針に各カテーテルと針を取り付けます。 </li></ol></li><li>心電図（ECG）を監視するために胸骨柄、剣状突起へと肩の各点に縫合ステンレス鋼電極。 </li><li>子宮に胎児を返します。左脇腹の小さな刺し切開を介したすべてのカテーテルと電極を終了。 </li><li> 3層の閉鎖を使用して開腹切開を閉じます。単純な連続的に合成吸収性モノフィラメント縫合糸USP 2と腹壁を縫合。単純な連続的に合成吸収性編組縫合糸USP 0で皮下スペースを閉じます。皮膚切開を閉じるために、外科用ステンレス鋼ステープルを使用してください。 </li></ol></li><lI&gt;手術手順の詳細な説明<ol><li> 4％のグルコン酸クロルヘキシジンと3分間、柔らかいブラシで十分その後腹側腹部乳腺に剣状突起を剃ることで、ブレード＃40クリーンで各側の脇腹の折り目に沿って羊毛を削除します。 <ol><li>グルコン酸クロルヘキシジンを標準無菌スクラブ4％腹部の中心から開始して3分間遠心やり方で進んで行ってください。消毒石鹸を除去するために、腹部に滅菌生理食塩水を注ぎます。外科手術の準備の最終段階では、グルコン酸クロルヘキシジン液2％イソプロピルアルコール70％の3別の通路を行います。 </li></ol></li><li>麻酔の深さは前切開に十分であることを確認してください。腹部の筋損傷を最小限に抑えるために白線を介して乳房にちょうど頭蓋に臍から標準開腹切開を行います。 </li><li>左腹壁アップに沿って腹部に長いスポンジ鉗子を挿入paracostal地域におけるカテーテルの計画出口部位へ。 <ol><li>アシスタントがそれを見つけて、適切なサイトを確認できるまで壁に鉗子の先端を押してください。わずかに開いた（1 cm）の鉗子の顎と、アシスタントを全層2センチメートル刺し切開を作ってみましょう。 </li><li>再び開いて、切開部を通して鉗子の先端を体外に出す、と静かに最後に腹側腹部の切開を通って腹部の外に引き出されているピンセットでカテーテルを把握します。注目すべきは、いくつかのグループは、カテーテルを移植し、それらを体外に出します。これはintrasurgical胎児ECG監視が不可能であるという欠点があります。 </li></ol></li><li>胎児の位置と数を決定するために子宮を触診。両耳間の距離を使用して最大の胎児を決定します。子葉を避け、ヘッドの背の上に大きな曲率の子宮壁を切開。 <ol><li>午前を得るために、胎盤膜を通って平滑末端カニューレを挿入出血から無料niotic流体サンプル。はさみを使用して、胎盤膜を切開。 </li></ol></li><li>この切開を通して胎児の頭蓋半分を体外に出します。正常体温を維持するのを助けるために胎児の頭の上に37℃での滅菌生理食塩水で満たされた無菌の非ラテックス手術用手袋を置きます。 <ol><li>子宮から胎児の上半身を除去する際に、アシスタントが羊水の損失を防ぐために、バブコックのアップを保持しています。その後、再びバブコック鉗子を使用して、羊水と腹部の汚染を防止するために、皮膚に胎児膜および子宮壁をクランプ。 </li><li>それぞれ、計装および子宮内部の残りの部分を維持するか、しっとりと温かい（37℃）滅菌布で覆われてする必要が胎児の体の部分だけを公開します。 </li></ol></li><li>上腕動脈への曝露を容易にし、二国間静脈には、両方の胸部手足を誘拐。前腕と介護の両方の内側面に沿って切開完全に上腕動脈と静脈の周りを解剖します。 </li><li>左右の上腕動脈と標準カットダウンの手法を用いて、静脈左上腕にポリビニルカテーテルを挿入します。 <ol><li> 1センチメートル以上の隣接組織からカテーテルを挿入する血管を解放します。編組合成吸収性USP 2-0縫合糸で血管の先端部を連結。容器の近位面での合字をPreplaceが、アンタイドそれを維持。 <ol><li> Castroviejoはさみを使用して、その直径の約30％に対して横方向に容器をカット。近位の縫合糸を引っ張ることによって部分的に血流を停止します。近位方向にカテーテルを挿入します。 </li></ol></li><li> 8センチメートル近位または抵抗が検出され、その後、少し引き戻しされるまでまでポリビニルカテーテルを挿入します。時間的に血管クランプを使用して、カテーテルの近位側面を固定します。近位およびカテーテルの遠位面の両方の周りに別の縫合糸を配置します。アシスタントは、継続的にASPですiratingとカテーテルの開通性を確保するためにカテーテルをフラッシュします。 </li><li>連続縫合パターンで、USP 2-0編組合成吸収性縫合糸を用いて、胎児の皮膚を閉じます。 </li></ol></li><li>右と左の肩、胸骨柄と剣状突起には、胎児心電図のモニタリングを容易にするために、絶縁されたステンレス製の電極を固定。 </li><li>胸骨に羊水の圧力とサンプリングカテーテルを縫合。このカテーテルは、その先端に開窓されます。 </li><li> USP 2-0編組合成吸収性縫合材料を使用して、胎児の背の上にすべてのカテーテルを固定します。 </li><li>胎児の交換の前に戻って子宮へ、低血圧を回避し、子宮弛緩を提供するために、15分かけてゆっくりクレンブテロール30μgのIVを管理します。 </li><li>連続的なパターンでUSP 4-0編組合成吸収性縫合糸材料を用いて、胎児膜を縫合糸。 CLOSに一度に1つのカテーテルや電極を組み込みますタイトな閉鎖を確実にするURE。 USP 0編組合成吸収性縫合材料を使用して、子宮筋層を閉じますハルステッド原則を尊重二層クッシングパターンを使用してください。慎重に外科的結び目を埋めます。 </li><li>巾着縫合パターンを使用して、彼らは左paracostal切開を終了するように、すべてのカテーテルおよびECGケーブルを固定します。 </li><li> USP 2モノフィラメント合成吸収性縫合糸材料を使用すると、連続パターンと白線を確保。 USP 2-0は、連続したパターンで合成吸収性縫合材料を使用して編まれた皮下組織を閉じます。外科用ステープルで皮膚層を固定します。 </li><li>羊膜腔に羊膜カテーテルを介して静脈内投与し、再びアンピシリン250mgのを管理します。温かい生理食塩水で失われた羊水を交換してください。 </li><li>無菌性を維持するために、場所の袋にすべての体外カテーテルおよびECG電極を配置します。 ANすべてのカテーテルを固定するために羊の胴周りメリヤスを配置羊の体にD電極。 </li><li>全身麻酔を停止し、喉頭反射が正常に戻った後に羊を抜管。 </li><li>彼女は全身麻酔以下の安定したら、代謝ケージに羊を返します。雌羊は、実験期間中の代謝ケージに存在します。雌羊は、立って横になると母を鎮静することなく、非麻酔の胎児を監視しながら自由に広告を食べることができるはずです。 </li><li>以下の3日間、雌ヒツジ（トリメトプリムスルファドキシンを5mg / kg）および胎児（アンピシリン250mgの静脈内投与し、再び羊膜カテーテルを介して）に予防的に抗生物質を投与します。 </li><li>血液ガス分析を用いて、雌羊と胎児の両方の代謝状態を評価します。 </li><li>可能なヘパリン添加生理食塩水の最小量を持つすべてのカテーテルをフラッシュします。注意 - ヘパリン及び胎児への許容流体の毎日の線量を超えないようにしてください。流体が胎児をオーバーロードすることが可能です。フラッシュゆっくり回抗生物質の予防的投与の後の行あたりの日〜5 mLの塩化ナトリウム。 </li></ol></li><li>データ記録と分析<ol><li>手術中、必要に応じて母体と胎児の心電図や心拍数など連続母体動脈血圧および気道圧力（ポウ）（ 図1）を記録 。心電図を除くすべての母方のデータを取得する生活ウィンドウモニタを使用してください。胎児および母体ECG信号と共に、アナログ - デジタル変換器にそれらのデータを供給する。 1901プリアンプに最初の母体と胎児の心電図を渡します。記録とメーカーのソフトウェアのすべてのデータを表示します。 </li><li> （すぐに最初の動脈カテーテルを挿入した後）と子宮を閉じた後胎児手術の開始時に動脈血ガス分析、乳酸、グルコースのための雌ヒツジおよび胎児から同時に1 mLの動脈サンプルを取り、（血漿中）過剰決意をベース。 </li><li>術後の回復時には、IL-6およびTNF-αinflammを測定するために3 mLの胎児の血液サンプルを取りますatoryプロファイル。遠心4℃（4分、4,000×gで）での血漿、その後のELISA試験のために-80℃で血漿をデカントし、保存します。 注：報告された代表的な結果のために、6日目、手術後、動物を20 mLのペントバルビタールナトリウムの静脈内注射を使用して屠殺しました。胎児の成長は体、脳、肝臓及び母体の重みにより評価しました。実験期間の長さは、明らかに特定の研究課題のために選択されたデザインに応じて変動するため、〜6週間に到達することができます。 </li></ol></li><li>サイトカイン分析（オプションのステップ） <ol><li>ヒツジ固有のサンドイッチELISAを使用して、血漿中のサイトカイン濃度（IL-6、TNF-α）を決定します。 O / Nで4℃でELISAプレート上の濃度を4μg/ mlのプレコートマウス抗ヒツジモノクローナル抗体（抗体はIL-6を捕捉する）、またはマウス抗ウシモノクローナル抗体（TNF-α）、3時間後に洗浄緩衝液（PBS中0.05％のTween 20、PBST）で洗浄しました。 </li><li>PBST中の1％BSAで1時間プレートをブロックします。洗浄緩衝液で3回プレートを洗浄します。 </li><li>連続希釈標準7 31.25のpg / mlでの標準的な1 2,000のng / mlでの範囲で準備し、ELISAの標準として組換え羊のタンパク質（IL-6、TNF-α）を使用します。 </li><li>ウェルあたりの負荷50段階希釈タンパク質スタンダードμlのサンプルを、室温で2時間インキュベート、プレートを3回洗浄します。二重にすべての標準液およびサンプルを実行します。 </li><li> 1の希釈でウサギ抗ヒツジポリクローナル抗体を50μlの（検出抗体IL-6）またはウサギ抗ウシポリクローナル抗体（TNF-α）を適用する：ウェル250と室温で30分間インキュベートします。洗浄バッファーで5回プレートを洗浄します。 </li><li> 30分間：（5000希釈1）コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG-HRP50μlのを追加します。 </li><li>ウェルあたりTMB基質溶液50μlとインキュベートします。 </li><li> 2Nの硫酸25μlの所望の時間に発色反応を停止します。 </li><li> PL読みます570 nmの波長補正で450 nmでELISAプレートリーダー上のATE、。 注：我々のアッセイでは、IL-6 ELISAの感度は16 pg / mlであった、TNF-αELISAの感度は、それぞれ13.9 pg / mlでした。すべてのアッセイのために、分散のアッセイ内およびアッセイ間の係数はそれぞれ、&lt;5％および&lt;10％でした。 </li></ol></li><li>統計分析 注：正確な統計的手法が研究課題に依存します。ここでは、表2に報告された血液ガスの任意の有意差を試験するために使用される方法を報告します。 <ol><li>適切な多重比較のための調整とのパラメトリックまたはノンパラメトリック検定、続いコルモゴロフ - スミルノフ検定を使用して、通常のデータ配信をテスト。 </li><li>使用自発的に低酸素したコホートにおける胎児を特定し、それぞれのPO 2とO 2（土）の値が（フェタチーズとしてPO 2 &lt;20 mmHgのまたはO 2（土）&lt;55％を考慮して決定するためにクラスター分析をK-意味Lの低酸素症）。44-48 </li><li>分析のためにそのようなSPSSなどの統計ソフトウェアを使用してください。 </li><li>有意であると考えられてp &lt;0.05で統計的な差との平均±SDとして存在するデータ。 </li></ol></li></ol>

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慢性的に計装非麻酔下の胎児の羊：麻酔および手術の手順は、胎児の生理学と病態生理学を研究するための動物モデルを確立するために必要であることを提示しています。 プロトコル圏内の4つの重要なステップが強調されるべきです。まず、母体の脇腹を通ってカテーテルおよび電極を渡します。これは、任意の臓器損傷を避けるために、一度に行われることが重要で?...

種々の動物モデルは、実験用げっ歯類、非ヒト霊長類、国内の反芻動物を含む正常と妥協妊娠、両方の研究のために存在する。1,2,3,4,5慢性的に計装妊娠羊のように50年のために広く使用されてきましたそのようなリポ多糖（LPS）などの病態生理学的刺激に対する人間の胎児の発育と応答のモデル。LPS暴露後6-10病変は、両種の同様の成熟プロフィールに起因するものである脳室周囲白質軟化症と早産児に見られる、まさに模倣します。 11、12 その他の妊娠合併症はまた、出産前グルココルチコイドは、肺の開発13-15と胎児16,17の子宮内発育制限（IUGR）の影響を理解を促進することが発見として非常に詳細に研究されています。 胎児ヒツジモデルの広範な使用は、uniqのが原因でありますカテーテルおよび電極の外科的配置およびメンテナンスに非麻酔下のヒツジ胎児のUE従順、反復採血、生体電気活動の記録、電気刺激の適用および in vivo脳イメージングにすることが可能となる。使用頻度の低いが、18テレメトリは、も可能ですまだ設定だけでなく、初期およびメンテナンスコストが高く洗練さに起因する。19 計測器の多くのバリエーションが関心のある施策に応じて可能であるためまた、胎児ヒツジモデルは、非常に汎用性があります。例えば、それは、数日から数週間にわたって記録することができるように胎児の呼吸の動き、電気的脳活動、心血管応答、心電図、臓器の範囲に局所血流に流量プローブまたはマイクロスフェアなどのおかげでの使用など、リアルタイムで多変量の信号この汎用性は、研究の広い範囲がカルディの開発などが行われていますovascularシステム20,21、視床下部-下垂体-副腎（HPA）軸22、特に24で脳の発達23とスリープ状態の開発、低酸素症の影響/仮死25、低体温療法26、炎症6-11、両方の27の組み合わせ、グルココルチコイド28,29、抗うつ30、気管支肺異形成症（BPD）31,32、前と分娩時の名前が、胎児プログラミング33,34,35,36,37,38,39又は新規胎児監視モダリティの開発調査のいくつかの領域。40,41,42,43 提示された方法の全体的な目標は、この汎用性の高いモデルの基本的な実装を示すことです。これは、急性および慢性実験統合的に胎児の生理学と病態生理学を研究プロトコル、臓器、細胞および分子レベルの多種多様を確立することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE Light source</td>
			<td>Schott-Fostec</td>
			<td>A20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060 - 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006 - 09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003 - 12</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scalpel blades #12</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10012 - 00</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16044 - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S &#38; T suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00272 - 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont SS forceps - angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203 - 25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided silk suture size 6-0</td>
			<td>Teleflex Medical</td>
			<td>07 - 30&#160; - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Tape</td>
			<td>transpore</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride 100 mg/ml</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409 - 2051 - 05</td>
			<td>Final Does is 80 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranqui Ved Injection (xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td>Vecdo</td>
			<td>NDC 50989 - 234 - 11</td>
			<td>Final Does is 10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive orange 14</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R - 8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% Co2, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Final Concentration: 118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217 - 3</td>
			<td>Final Concentration: 4.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P -285</td>
			<td>Final Concentration: 1.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Jan-00</td>
			<td>Final Concentration: 0.57 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 310 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 5.95 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Final Concentration: 5.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED bioamplifier and ADC units</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited, 
			Unit 4, Science Park, 
			Milton Road, 
			Cambridge CB4 0FE 
			ENGLAND.</td>
			<td>Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Data acquisition software: Spike 2, V7.13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurolog analog signal bioamplifier</td>
			<td>Digitimer Ltd 
			37 Hydeway 
			Welwyn Garden City 
			Hertfordshire, AL7 3BE, England</td>
			<td>NL108A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABL800Flex</td>
			<td>Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5804R</td>
			<td>Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2 
			Mississauga, Ontario, L5N 8L2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrow Jugular Catheterization Set</td>
			<td>Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atravet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazepam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketalar</td>
			<td></td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SurgiVeT</td>
			<td>Endotracheal Tubes; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cook Airway Exchange Catheter with RAPI-FIT Adapters</td>
			<td>Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Ventilator</td>
			<td>Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte-W</td>
			<td>Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA</td>
			<td></td>
			<td>22 to 20 G; 1 in [0.9 x 25 mm] to 1.16 in [1.1 x 30 mm]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edwards Lifesciences Ref: PX272 Pressure monitoring kit with TruWave Disposable Pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow LW6000</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Babcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl catheters</td>
			<td>SCI (Scientific Commodities Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrocardiogram (ECG)</td>
			<td>LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>four copper electrodes in single sheath, 2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS II USP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim sulfadoxine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Argon Medical, Cat&#160;041220001A</td>
			<td></td>
			<td>Double 4-way Stopcock with male luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202389</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: for fetal arterial and venous catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202322</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: for amniotic catheters</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instrumentation of near-term fetal sheep for multivariate chronic non-anesthetized recordings

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as endotoxins, bacteria, umbilical cord occlusions, hypoxia and various pharmacological treatments. The life-saving clinical practices of glucocorticoid treatment in fetuses at risk of premature birth and the therapeutic hypothermia have been developed in this model. This is due to the unique amenability of the non-anesthetized fetal sheep to the surgical placement and maintenance of catheters and electrodes, allowing repetitive blood sampling, substance injection, recording of bioelectrical activity, application of electric stimulation and in vivo organ imaging. Here we describe the surgical instrumentation procedure required to achieve a stable chronically instrumented non-anesthetized fetal sheep model including characterization of the post-operative recovery from blood gas, metabolic and inflammation standpoints.

38妊娠中の時間日付雌ヒツジは、（一般的な麻酔下で無菌技術を用いて、動脈、静脈および羊膜カテーテルおよび心電図（ECG）電極を用いて妊娠の128±2日（DGA、〜0.88妊娠、用語145 DGA）で雌羊と胎児の両方をインストルメントされました）。双子妊娠の場合には、より大きな胎児は触診と異時点間の直径の推定に基づいて選択されまし​​た。代わりに、インストルメントされる胎児の潜在?...

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Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

それは外科的配置およびカテーテルおよび電極、反復採血、物質の注入、生体電気活動の記録の維持、およびin vivoイメージングでを許可するため、慢性的に計装非麻酔下の胎児ヒツジモデルは、健康と病気におけるヒト胎児発達を研究するために使用されます。我々は、このモデルを確立するために必要な手順について説明します。

多変量慢性非麻酔下の録音のための短期的ヒツジ胎児の計測

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K ビュー.  CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC. それは外科的配置およびカテーテルおよび電極、反復採血、物質の注入、生体電気活動の記録の維持、およびin vivoイメージングでを許可するため、慢性的に計装非麻酔下の胎児ヒツジモデルは、健康と病気におけるヒト胎児発達を研究するために使用されます。我々は、このモデルを確立するために必要な手順について説明します。 

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Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

発生生物学

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

体内の胎児と胎盤の開発の分析のための高周波超音波

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

胎児と新生児のネズミの長骨の培養と測定

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

胎児腸オルガノイドを用いたインビトロで吸引から破乳移行を再現する

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). Following TO, retention of the secreted epithelial fluid increases luminal pressure and induces lung growth. Various animal models have been defined to understand the pathophysiology of CDH and TO. All have their own advantages and disadvantages such as the difficulty of the technique, the size of the animal, cost, high mortality rates, and the availability of genetic tools. Herein, a novel transuterine model of murine fetal TO is described. Pregnant mice were anesthetized, and the uterus exposed via a midline laparotomy. The trachea of selected fetuses were ligated with a single transuterine suture placed behind the trachea, one carotid artery, and one jugular vein. The dam was closed and allowed to recover. Fetuses were collected just before parturition. Lung to body weight ratio in TO fetuses was higher than that in control fetuses. This model provides researchers with a new tool to study the impact of both TO and increased luminal pressure on lung development.

Various animal models of congenital diaphragmatic hernia and fetal tracheal occlusion present advantages and disadvantages regarding ethical issues, cost, surgical difficulty, size, survival rates, and availability of genetic tools. This model provides a new tool to study the impact of both tracheal occlusion and increased luminal pressure on lung development.

マウスにおける胎児の気管咬合モデル

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

羊の成人および前頭前卵巣から採取された体外期の成熟卵母細胞のガラス化

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...