This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

注：このプロトコルで使用される全ての試薬 ​​のためのベンダー情報は、 表1に列挙されており、 マテリアルリスト。細胞と接触するすべての溶液および機器は、無菌でなければならず、かつ無菌操作はそれに応じて使用する必要があります。特に指定しない限り、加湿した37℃、5％CO 2インキュベーター内ですべての培養のインキュベーションを行う。このプロトコルでは、すべての分化はhiPSCsが播種された、6ウェルプレート中で実施される。分化および精製の後、細胞を解離させることができ、下流の使用のために再プレーティング。 1.培地調製<ol><li> E8媒体については、各培地成分のためのストック溶液（飽和NaHCO 3、L-アスコルビン酸-2-リン酸、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、インスリン、FGF2、TGFB1）を作製し、-20℃での解を格納。滅菌するためにDMEM / F12及びフィルタのボトルにストック溶液の適切な量を加える。ソリューションconcentrストックコンポーネントおよびE8媒体ATIONと反応セットアップは、 表1に見ることができる。 </li><li>細胞外マトリックス溶液は、4℃CO / Nで（一般に10mg / mlで供給）基底膜マトリックスを解凍。ヒト多能性幹細胞は、α-6-β-1インテグリン9を用いて、この材料に良好に接着することができるので、マトリゲルは、一般的に、多能性幹細胞培養のために使用される。一度氷冷ピペットチップ、チューブを使用して氷上で2.25ミリグラム（250μL）アリコートを作成し、-80℃でアリコートを保存し、解凍した。 <ol><li> ECMSでプレートをプレコートすると、氷の上に細胞外マトリックス溶液（ECMS）を解凍し、アリコート。氷上で200：1の比率でECMS、氷冷DMEM / F12培地を混合する。時期尚早ECMSの固化を防止するために、冷静さを保つ。 </li></ol></li><li>インスリン媒体なしRPMI / B27については、RPMI培地500ml中にB27マイナスインスリンの10ミリリットルを追加します。 </li><li>培地（インスリン）RPMI / B27については、insuliで（B27サプリメントの10ミリリットルを追加n）およびRPMI培地を500mlにペンストレプトマイシン抗生物質を5ml。 </li><li>低グルコース培地では、グルコースを含まないRPMI培地500ml中にペン連鎖球菌の抗生物質のB27サプリメントの10ミリリットルと5ミリリットルを追加します。 </li><li> 1の比率：凍結/凍結保存培地の場合は、9位のジメチルスルホキシド（DMSO）と一緒にウシ胎児血清をミックス。凍結培地を4℃で1ヶ月まで保存することができる。 注：すべてのメディアは、ろ過し、保​​存され、4℃で、指定がない限り、2週間以内に使用する必要があります。特に断らない限り、以下で使用される全ての試薬/溶液体積は、6ウェルプレート中で単一のウェルのために意図されている。 </li></ol> ECMS 2.プレコーティング6ウェルプレート<ol><li>次に、6ウェルプレートを各ウェルにたてECMS 2mlの適用、200：1の比で氷冷DMEM / F12培地（ 例えば 、マトリゲル）基底膜マトリックスを混合することによりECMSを行う。 6ウェルプレート中でそれぞれが約90 mgのECMを受信します。 </li><li> ECMをインキュベートSは、37℃で1時間プレートをコーティングした。直前に各ウェルから細胞、吸引DMEM / F12液をメッキする。次いで、プレートを、細胞を受信できるようになります。 </li></ol> 3.解凍冷凍hiPSCs 注：それは、最適な培養および凍結/解凍サイクル以下のhiPSC-CMSへのhiPSCsの下流分化につながる可能性が密接に、この手順に従ってください。 <ol><li> 6ウェルプレートの各ウェルについてhiPSCsの1バイアルを解凍する。各バイアルのためのROCK阻害剤（10μM）と冷たいE8培地9mlで15ミリリットルコニカルチューブを準備します。 ROCK阻害剤は、凍結保存10以下のhiPSCsの生存率を改善する。約5mm直径の氷結晶が残されるまで、細胞を融解し、37℃の水浴中でバイアルを維持。 </li><li> 70％エタノールバイアルの外側をスプレー。無菌層フードにそれらを移動する前にティッシュペーパーとのバイアルを拭きます。 </li><li>準備されたコニカルチューブに細胞を移す。 Tをすすぐ彼はE8の培地500μlで一度バイアルと同じ円錐管に解凍した細胞を含む培地を転送する。 200×gで4分間、室温で遠心する。 </li><li>遠心分離後、上清を吸引し、軽くROCK阻害剤（10μM）とE8培地2mlで細胞ペレットを再懸濁します。 ECMSでプレコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに再懸濁した細胞を移す。 </li><li>培養24時間後にROCK阻害することなく、E8媒体とのメディアを交換してください。細胞は、この時点で接着している必要があります。 </li></ol> hiPSCsの4継代<ol><li>典型的には、6ウェルプレート中の75％-80％の集密度に達した後通路hiPSCs。培養液を吸引除去する。すぐに無菌の1ミリリットル、RT PBSでウェルを洗浄。吸引するPBS。 <ol><li> 0.5 mMのEDTAまたは1x細胞分離液（ 例えば 、のAccutase）の500μl加え、室温で1-7分間インキュベートする。 EDTAのインキュベーションのための適切な時間は、hiPSCラインに応じて変化する。目に見えるカーリングOを期待これは、EDTAまたは細胞剥離溶液を除去する準備ができていることを示すようにエッジの周りコロニーのr個の肥厚。 </li></ol></li><li> EDTAまたは細胞分離液を吸引除去する。 10μMのROCK阻害剤を補充したE8培地の1ミリリットルを追加します。繰り返しピペッティングとP1000ピペットでコロニーをオフに噴霧することにより、ウェルのhiPSCコロニーを変位。コロニーは終了後の5〜10細胞塊に分割する必要があります。 </li><li> 15ミリリットルの円錐管にROCK阻害剤とE8媒体1mlに懸濁されたコロニーを移す。 </li><li> E8媒体中の小さな塊に大きな細胞塊を破砕。細胞を希釈し、細胞懸濁液を阻害剤とE8メディア​​の適切なボリュームを追加する。希釈に追加するメディアボリュームは細胞密度に依存し、ウェルの数は、播種する。理想的には、hiPSCsのシングル、80％コンフルエント井戸1:12に希釈されるべきである。 <ol><li> CEの既存の1mlにROCK阻害剤を用いた11ミリリットルE8培地を追加前述の15mlコニカルチューブ中でllの溶液を、1：12希釈物を得る。 </li></ol></li><li>さらに（各フラグメントで約50-200の細胞がベストです）小細胞断片に細胞塊を粉砕する。これは細胞の生存を減少させるので避け過粉砕する。 </li><li>吸引除去前のコーティングされたプレートからECMS、各ウェルに再懸濁した細胞の2ミリリットルを追加します。 6ウェルプレートのウェルあたり約100,000個の細胞が理想的である。ウェルの中央に細胞のクラスタリングを回避するためにも周りに均等に細胞を分配することを目指しています。 </li><li>培養24時間後、ROCK阻害することなく、E8培地で培地を交換してください。細胞が80％コンフルエントになるまで培養液を24時間毎に変更します。その後、細胞を再び通過に対する準備ができている。これは、通常80％の密集度に到達するための通路の間に3-6日かかります。 </li></ol> 5.凍結のhiPSCs 注：それは、最適な培養およびヒップの下流分化につながる可能性が密接に、この手順に従ってください凍結/解凍サイクル以下のhiPSC-CMSへのSC。 <ol><li>細胞株名、細胞型、継代数、および凍結日付極低温管にラベルを付ける。一般的なガイドラインとして、6ウェルプレートの各ウェルに1つのバイアルを使用します。 ROCK阻害剤（10μM）とE8培地9mlで満たされた15ミリリットルコニカルチューブを準備します。 90％のFBSおよび10％DMSOで凍結培地を準備し、そして使用するまで4℃で培地を維持する。 </li><li>培養培地を吸引500 0.5mMのEDTAμlのまたは1xの細胞剥離溶液を添加し、室温で2~7分間インキュベートする。 EDTAまたは細胞剥離溶液の暴露時間は、細胞株、細胞株ごとに異なる​​。 </li><li>吸引し、EDTAまたは細胞剥離液。 E8培地の1ミリリットルを追加します。 </li><li>ピペッティングとP1000ピペットでコロニーをオフに噴霧することにより、ウェルのhiPSCコロニーを変位。コロニーはより小さい100細胞塊に分割すべきではありません。 E8を含む準備されたコニカルチューブに懸濁した細胞を転送します。 Rでの遠心機T 200×gで4分間。 </li><li>上清を吸引し、ペレットに冷たい凍結培地500μlを添加する。一から二回ピペッティングしてペレットを再懸濁。細胞生存は、大きな塊で細胞を維持することによって改善される。 </li><li>ラベル極低温チューブに再懸濁した細胞を転送します。すぐに徐々に冷却を可能にする冷凍コンテナ含むイソプロパノール、にバイアルを移動する。長期保存のために液体窒素に細胞を転送した後、24時間-80℃で細胞を容器に保管してください。 </li></ol>人間のIPSCの6.心臓分化注：追加された場合は、すべてのメディアは、少なくとも室温であるべきである。 <ol><li> EDTAまたは1x細胞分離液と解離した後、約10万分化のためのECMSコーティングした6ウェル培養プレート上の人間のiPS細胞（細胞継代手順と同じ手順を）シード。細胞が85％コンフルエントに達したときに、6を有するインスリン媒体なしRPMI / B27に培地を変更μMGSK3ベータ阻害剤CHIR99021（CHIR）と48時間維持する。 </li><li> 48時間後、インスリン媒体を含まないRPMI / B27とCHIR-含む培養液を交換して（3日目まで）24時間放置。 </li><li> 3日目に、5μMWntシグナル阻害剤IWR1とインスリンないRPMI / B27にメディアを変更し、（5日目まで）48時間維持する。 注：以前の研究11に記載のWnt阻害はまた、他の小分子化合物を使用して試みることができる。 IWR1は、それが11 Wnt シグナル伝達を阻害するのに有効であることが示された増加した範囲に起因する他の小分子Wntシグナル伝達阻害剤の上に選択した。 </li><li> 5日目に、インスリン媒体なしにバックRPMI / B27にメディアを変更し、（7日目まで）48時間に向けて出発。 </li><li> 7日目では、（インスリン）RPMI / B27培地で培地を交換し、同じ培地で3日ごとに、その後培地を交換してください。心筋細胞の自発的な鼓動は、初日に約8日目で見えるはずです10。 </li></ol>グルコース飢餓を通じて人間の心筋細胞の7精製<ol><li> 10日分化後に、2mlまで6ウェルプレートの各ウェルに、低グルコース培地に培地を変更し、3日間（13日まで）を、この培地中で細胞を維持する。 </li><li> 13日目では、（インスリン）RPMI / B27培地に細胞を戻す。 </li><li>必要に応じて、グルコース飢餓時の非心筋細胞のより容易に解離を可能に、培養プレートから非心筋細胞を緩める助けるためにグルコース飢餓の第二ラウンドの前に心筋細胞をreplate。 <ol><li> 13日目、吸引培地で、PBSで一回洗浄し、37℃で5分間、細胞解離酵素を500μlを用いて、単一細胞への細胞を解離する。具体的には、酵素処理の5分後に、手動で繰り返し細胞解離酵素を引き上げcardiomyoに対してそれを噴霧することにより、6ウェルプレートから心筋細胞を解離1,00​​0μlのピペットを使用してcyte単分子層。最大30分注繰り返しが単一細胞に心筋細胞を解離するために必要な場合があります。 </li><li>細胞を解離させ、単一細胞形態であるした後、200×gで4分間、細胞解離酵素および遠心分離機を希釈するためにインスリンをRPMI / B27培地5mlを充填した15ミリリットルの円錐管にすべての細胞を回収する。吸引し、上清を捨てる。 </li><li>新しいECMSコーティングした6ウェルプレートに2ミリリットルRPMI / B27培地プレートで細胞を再懸濁する。一般的には、心筋細胞の高い集密度は、再播種時の細胞の生存に役立ちます。再播種時に最適な生存のための新たな6ウェルディッシュあたり2万個の細胞をreplateを目指す。 </li></ol></li><li> 14日目に、第二グルコース欠乏サイクルのためにバック低グルコース培地2mlにメディアを変更します。文化3日間以上、この低血糖状態にある細胞。非心筋細胞のほとんどは、この低グルコース培養状態で死んでしまう。 </li><li> 17日目では、Rの中に2ミリリットルを変更インスリンとのPMI / B27培地。残りの細胞は、高度に精製された心筋細胞になります。これらの心筋細胞は、遺伝子発現分析、薬物スクリーニング、代謝分析、および他の様々な下流アッセイのために使用され得る。 </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

高度に精製されたhiPSC由来の心筋細胞を大量に取得することは基本的な心臓の研究だけでなく、臨床および翻訳アプリケーションのために重要である。心臓分化プロトコルは、心原性成長を利用し、胚様体に基づく方法からの移行はサンドイッチ法12をマトリックスへの、2因子 、および最終的に小分子変調単層ベースの方法5に、近年の大幅な改善を経験した。上記の...

初代ヒト心筋細胞が原因侵襲心臓生検、単一の細胞に解離であり、なぜなら、培養中の乏しい長期の細胞生存の難しさの要件を得ることが困難である。初代ヒト心筋細胞の欠如を考えると、患者特異的なヒト誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CM）技術は、基礎研究のための強力な代替的な心筋細胞源、ならびにこのような疾患モデルおよび薬物の臨床および翻訳アプリケーションと見なされている発見1。心筋細胞への多能性幹細胞を分化の初期の努力は、胚様体（EB）を用いた分化プロトコールを用いるが、EB中の細胞の、しばしば25％未満が、心筋2,3拍動しているため、この方法は、製造心筋細胞における非効率的である。比較的、AとBMP4、アクチビンサイトカインを用いて、単層ベースの分化プロトコルは、EBをより高い効率を示したが、このプロトコルはまだ比較的非効率的であり、ヒト多能性幹細胞株の限られた数4に高価な成長因子、および機能のみを必要とする。最近では、高効率、hiPSC単層ベースの心筋細胞分化プロトコルは、Wnt /βカテニンが5シグナリング変調することによって開発されました。これらのhiPSC-CMは、心筋トロポニンTとアルファアクチニン、心筋細胞6の標準マーカーである2筋節タンパク質を発現する。プロトコルは、ここに記述し、この小分子ベースの、フィーダー細胞を含まない、単層分化方法5,7を適応したものです。私たちは、7-10日間（ 図1）の後にhiPSCsから心筋細胞を破って入手することができます。しかし、50％が細胞を破って、その結果心筋細胞の分化以下、一貫して免疫染色することは、心臓特異的トロポニンTおよびアルファ - アクチニンなどの心筋細胞特異的マーカーに対して陰性である非心筋細胞の人口の存在を示している。 FUに対するrtherが心筋細胞を精製し、非心筋細胞を排除し、不均一な分化した細胞集団は、複数の日のために極めて低グルコース培地（ 図2）で処理することにより、グルコース飢餓に供した。この処理は、選択的に低グルコース環境8で生き残るために、一次エネルギー源として乳酸を代謝するために、心筋細胞の能力に起因する非心筋細胞ではなく、非心筋細胞を排除します。この精製工程の後に、非心筋細胞の心筋細胞の割合が40％の増加が観察される（ 図3、図4）、これらの細胞は、下流の遺伝子発現解析、疾患モデル、および薬剤スクリーニングアッセイに使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

人間の人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CMS）は基礎研究および翻訳アプリケーションで利用初代心筋細胞の不足に対処するための重要な細胞源となっている。心筋細胞へhiPSCsを区別するために、胚様体（EB）ベースの分化および増殖因子の誘導を含む様々なプロトコルが開発されている。しかしながら、これらのプロトコルは、精製された心筋細胞を生成する能力において非効率的であり、非常に可変である。最近では、Wnt /βカテニンシグナル伝達の小分子ベースのプロトコルを利用変調は、高効率で心臓分化を促進することが示された。このプロトコルでは、分化した細胞の50％よりも-60％が心筋トロポニン陽性心筋細胞を一貫して観察されたされた。さらに、心筋細胞の純度を高めるために、分化した細胞を特異的に代謝の差に基づいて、非心筋細胞を除去するためにグルコース飢餓に供した心筋細胞と非心筋細胞の間の。この選択戦略を使用して、我々は一貫して、分化した細胞の集団における非心筋細胞への心筋細胞の割合で30％を超える増加を得た。これらの高度に精製された心筋細胞は、in vitro疾患モデル研究及び薬物スクリーニングアッセイにおいてヒトIPSCベースからの結果の信頼性を高めるべきである。

hiPSC分化の間の形態学的変化。 無フィーダープレートで培養hiPSCはフラット、二次元のコロニーとして成長した。約85％コンフルエントに達すると、hiPSCs分化6μMCHIR（ 図1A）で処理した。細胞死の実質的な量の、正常および共通の現象は、CHIR処置の24時間後に観察された。 CHIR治療の2日後、hiPSCsは中胚葉の運命に分化し続けた。 hiPSCコロニー中の?...

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Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

小分子変調分化とその後のグルコース飢餓を用いたヒト人工多能性幹細胞からの高度に精製された心筋細胞の導出

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.4K ビュー.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

ビデオ: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

発生生物学

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.