このプロトコルは、研究者が市販または自社製のhiPSC-CMを成人様表現型に成熟させ、心毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの予測値を大幅に改善することを可能にするため、重要です。このプロトコルの主な利点は、成熟したhiPSC-CMを高スループットフォーマットで提供し、カルシウムまたは電圧変化の光学マッピングを行うことです。このプロトコルは、疾患メカニズムを調査したり、心毒性の薬物をスクリーニングしたりするために使用できます。
手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるジェフリー・クリーチです。心筋細胞メッキの1時間前に、成熟を誘導する細胞外マトリックス(MECM)プレートを200マイクロリットルのハンク平衡塩溶液(HBSS)で2回洗浄することから始めます。ウェルを水和させてください。
心筋細胞チューブを液体窒素タンクからドライアイスに移し、チューブキャップを少し開けて圧力を解放します。次に、チューブキャップを再シールし、水浴中で4分間解凍します。細胞を解凍した後、チューブを開く前に70%エタノールをチューブにスプレーします。
細胞を1ミリリットルのピペットで15ミリリットルの円錐形チューブに移します。1ミリリットルのメッキ媒体をクライオバイアルに加え、洗浄液を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。次に、1ミリリットルのメッキ媒体をゆっくりと滴下し、チューブを攪拌します。
8ミリリットルのメッキ媒体を移すまでこれを繰り返します。15ミリリットルのチューブを300 x gで5分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのメッキ媒体に再懸濁します。アリコートを除去し、血球計算盤で生細胞計数を行ってからプレーティング培地を添加し、ミリリットルあたり7.5 x 10〜5番目の細胞を得ました。
マルチチャンネルピペットを使用して、MECMコーティングされた96ウェルプレートのウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を分注し、細胞を2日間インキュベートします。次に、培地を200マイクロリットルの維持培地と交換し、プレートを7日間維持し、5日目に培地を交換します。7日目に、本文に記載されているようにEPアッセイを実行します。
細胞培養の延長を選択する場合は、必ず一日おきに培地を交換してください。磁気活性化セルソーティング(MACS)を介してhiPSC-CMを精製するには、細胞培養培地を吸引し、1ミリリットルのHBSSで細胞を洗浄し、1ミリリットルの0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加して細胞を解離し、細胞を10分間インキュベートします。次に、2ミリリットルのプレーティング培地で細胞を再送して単離化することにより、トリプシン/EDTAを不活性化します。
6つのウェルから、70マイクロメートルのストレーナーを使用して細胞を50ミリリットルの円錐形のチューブに集めます。3ミリリットルのメッキ媒体でストレーナーを洗浄した後、細胞を数えます。計数後、遠心分離し、細胞ペレットを2ミリリットルの氷冷MACS分離バッファーで洗浄してから、ペレット化し、5 x 10あたり80マイクロリットルの冷たいMACS分離バッファーで細胞を6番目の細胞に再送します。
20マイクロリットルの冷たい非心筋細胞枯渇カクテルを加え、氷上で10分間インキュベートする前に懸濁液を混合します。細胞を300 x gで5分間4ミリリットルのコールドMACS分離バッファーで洗浄した後、ペレットを80マイクロリットルのコールドMACS分離バッファーに再懸濁します。5 x 10あたり20マイクロリットルの冷たい抗ビオチンマイクロビーズを6番目の細胞に加え、細胞懸濁液を穏やかに混合してから、氷上で10分間インキュベートします。
サンプルのインキュベーション中に、30マイクロメートルの予備分離フィルターを取り付けたポジティブデプレッションカラムをMACSセパレーターに配置し、ラベルの付いた15ミリリットルの収集チューブをカラムの下に置きます。次に、各カラムに3ミリリットルのコールドMACS分離バッファーをプライミングします。抗体処理した細胞懸濁液を2ミリリットルのMACS分離バッファーと混合し、カラムに加えます。
各カラムに2ミリリットルのMACS分離バッファーを加え、12ミリリットルのフロースルー心筋細胞懸濁液を回収します。心筋細胞を遠心分離し、上清を廃棄してから、心筋細胞を1ミリリットルのメッキ培地に再懸濁します。濃度を決定するには、細胞をカウントし、精製心筋細胞をMECM 96ウェルプレートにプレーティングする前に、容量を目的の播種密度に調整します。
心筋細胞維持培地を吸引し、96ウェルプレートのウェルあたり100マイクロリットルの電位感受性色素(VSD)またはカルシウム感受性蛍光色素(CSF)で交換します。30分間のインキュベーション後、色素をアッセイ培地またはHBSSと交換します。高スループット光学マッピングデバイスを使用してベースラインデータの光学マッピングを取得する前に、摂氏37度でセルを平衡化します。
急性暴露試験用の薬物で細胞を処理するか、目的の薬物に慢性的に曝露された細胞をマッピングするには、薬物をジメチルスルホキシドまたはDMSOで希釈し、ストック溶液として摂氏20度で保存してから、HBSSで目的の濃度に希釈します。96ウェルプレートでの心毒性試験では、1用量あたり少なくとも8ウェルの化合物を4回投与します。有効用量を含む、臨床的に有効な治療血漿濃度の下から上の範囲の用量を使用してください。.
薬物適用前のベースライン電気生理学測定と同様に、慢性研究のために薬物治療の少なくとも30分後に電気生理学の記録をキャプチャします。ベースライン記録後、GCaMP6mを発現する成熟hiPSC-CM単層に各薬剤を少なくとも4回投与し、1用量あたり少なくとも8ウェルを適用します。細胞上の薬を30分間平衡化し、データ取得の前と最中に細胞を摂氏37度に温めます。
プレート全体のベースライン記録に続いて、500ナノモルのイソプロテレノールをすべてのウェルに追加して、堅牢な薬物反応データを可能にし、単層の拍動速度、収縮振幅、およびカルシウム過渡持続時間に対するイソプロテレノールの効果を定量化します。光学マッピングデータを取得するには、フロントドロワーを開き、プレートヒーターにプレートを配置します。集録ソフトウェアを開き、ソフトウェアでファイルの保存場所を決定したら、時間分解能を上げるために10〜30秒の収集時間とフレームレートを選択し、[集録の開始]をクリックします。
解析ソフトウェアを開き、[インポート フィルタ]タブで、[単一ファイルを参照]または[複数タイル]を選択してプレートを再構築します。ファイルを選択し、行数と列数を入力して、[自動]を選択します。次に、[ピクセルサイズを更新]を選択し、ピクセルあたりの距離を入力し、ウェルウィザードを使用して画像内のウェルの位置を確認してから、[プロセス保存]をクリックして次のタブに移動します。
ROIまたは関心領域タブを開き、ROIを手動で描画するか、自動的に描画するか、プレート全体の分析で考慮されるROIをまったく使用しないかを選択します。ウェルで領域を選択したら、[保存の処理]ボタンをクリックして次のステップに進みます。[ウェルを非表示にする] ボックスと [フィルターされたみを表示] チェックボックスをオンにして、ROI を視覚化します。
[分析]タブを開き、各ウェルまたはROIを選択して、自動ビート検出の精度を確認します。トレースに拍を追加または削除するには、個々の拍を選択し、キーボードの Delete キーを押します。完了したら、[保存]をクリックします。
次に、[分析]タブの[時空間プロット]ボタンをクリックし、各井戸のデータまたはROIを視覚化するための時空間プロットを決定する線を追加します。水平線または垂直線を選択したら、[プロットの生成]をクリックします。正確なビート検出を確認したら、[エクスポート]タブに進み、[ファイル形式]を選択し、[エクスポート]をクリックする前に[ビート統計]オプションを入力します。
エクスポートしたら、データファイルを開き、選択した統計分析ルーチンを実行します。位相差イメージングは、MECMにメッキされたhiPSC-CMが成熟し、マウスECMに再メッキされたhiPSC-CMの同じバッチと構造的に異なることを示しました。成熟細胞は棒状になり、未熟細胞は円形を保った。
α-アクチニン抗体で染色された心筋細胞は、各ECM条件で培養した細胞の典型的な形状を示した。TnI染色と一致して、α-アクチニン染色は、MECM上で成熟したhiPSC-CMが棒状の成熟表現型を促進し、より大きなサルコメア組織を誘導することを示しました。ミトコンドリア含量および活性は、マウスECM上で培養された細胞とMECMで異なっていた。
VSDと光学マッピングシステムを使用して記録された活動電位の電気生理学的データは、心房特異的細胞が心室特異的細胞よりも有意に速い自発拍動速度と短い活動電位持続時間(APD80)を有することを示した。APD80などのパラメータのプレート全体のヒートマップにより、プレート内の特定のパラメータの再現性が明らかになりました。成熟hiPSC-CM単層の典型的な活動電位は、単離および試験された成体心筋細胞の活動電位形態を示した。
典型的な活動電位自発リズムも表示された。イソプロテレノールに応答して、β-1-アドレナリン作動性受容体の活性化は、正の変時変化、正の変力、および正のルシトロピーを引き起こした。E-4031、ドンペリドン、バンデタニブ、ソタロールなどのヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子(hERG)チャネル遮断薬に対するHiPSC-CM応答を、GCaMP6mカルシウム蛍光を用いて研究し、リズムをモニターしました。
この研究は、E-4031 hERGチャネル遮断によって引き起こされる早期の脱分極後の検出を示しました。懸濁液中の細胞で迅速に作業し、細胞を穏やかにピペッティングすることでせん断応力を回避します。また、hiPSシンシチウムの損傷を防ぐため、メディア交換を慎重に行ってください。
この手順に続いて、細胞は研究者のお気に入りの技術で分析するためのタンパク質、RNA、DNA、および脂質の収集に適しています。この技術により、研究者は成人様心筋細胞を使用して疾患を調査し、新薬の心毒性を試験することができます。
