XHPは、国立老化研究所（NIHK01AG024496）と母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所（NIHR21HD056530）から健康（NIH）助成金の国立研究所によってサポートされています。

1。ソリューションとメディアの準備<ol><li>ゼラチンコーティング溶液：4で0.1％（w / v）ののddH 2 O、オートクレーブでゼラチンと店舗℃の</li><li>マトリゲルコーティングソリューション。ストック溶液：° C一晩、10mlの氷冷DMEMまたはDMEM/F12を追加、よく混ぜて、アリコートを1ml /滅菌組織培養フードの下にチューブ、-20℃で保存します。4でゆっくりと解凍マトリゲル（10ml）をワーキングソリューション：遅い雪解け4で1ミリリットルマトリゲルのアリコート° C DMEMまたはDMEM/F12を冷やして14ミリリットルまで1-2時間、転送およびコーティングの直前に滅菌組織培養フードの下によく混ぜる。 </li><li>人間のラミニンコーティング溶液：希釈1ミリリットルのヒトラミニン溶液を氷冷DMEMまたはDMEM/F12へと（トリスでは0.5 mg / mlの-80店舗、NaClをバッファ° C、1〜2時間、4℃でゆっくりと解凍） 12.5ミリリットルワーキング溶液（40μg/ ml）を滅菌​​組織培養フードの下にすぐにコーティングの前に。 </li><li>成長因子のストック溶液（500 - 1000X）：10μgのに成長因子を溶かす滅菌緩衝液に/ mlの（0.5％BSA、1.0mMのDTT、10％グリセロール、1XPBS）と-80℃で50〜100μL/チューブアリコートなどの店舗℃まで</li><li> hESCのメディア：DMEM/F12またはKO - DMEM（80％）、KO血清の交換（20％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MEM非必須アミノ酸（MNAA、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）、フィルタリングして4℃で保存、使用前に20 ng / mlのbFGFを補充したC、。 DMEM/F12またはKO - DMEM（100％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MNAA（1X）、MEM必須アミノ酸（MEAA：または定義されたコンポーネントを使用して&quot;KO血清代替物を&quot;交換、1X）、およびβ-メル​​カプトエタノール（100μM）、濾過し、4で店のbFGF（20 ng / ml）を補充した° C、、ヒトインスリン（20μg/ ml）を、アスコルビン酸（50μg/ ml）を、人間使用前にアクチビンA（50 ng / ml）を、（10 mg / ml）をAlbumax /ヒトアルブミン、およびヒトトランスフェリン（8μg/ mlの）。 </li><li>ヒトES細胞心筋分化メディア：DMEM/F12（90％）、定義されたFBS（10％）、およびL -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を。 </li><li>メディアを含むニコチンアミド（NAM）：追加N準備の2週間以内にフィルタリングされた最終濃度10 mMにhESCのメディアまたはhESCの心臓分化の媒体、4℃で保存し、使用午前。 </li></ol> 2。プレートコーティング<ol><li>ゼラチンでコートプレートは6ウェルプレートにゼラチン溶液を2.5ml /ウェルを追加し、37℃の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。 </li><li>コー​​トのラミニンとプレート：チルゼラチンコートプレートとゼラチン削除は、2.5 mlを追加/予備冷却にもマトリゲルまたはヒトラミニンコーティングワーキングソリューションは、4℃で一晩6ウェルプレートとインキュベートしてゲル化。 </li></ol> 3。定義された条件の下で未分化ヒトES細胞を継代し、シーディング<ol><li>ヒトES細胞のコロニー5-7日齢に成長できるように、と解剖顕微鏡（プリウォーム37に段階を解剖° C）滅菌フードを解剖下にヒトES細胞培養プレートを取る。 </li><li>ヒトES細胞のコロニーを分割する]を選択します。形態学的に、これらのコロニーは（SM&gt; 75％未分化ヒトES細胞が必要です解剖顕微鏡下に定義されたエッジと、通常わずかに不透明すべてのコンパクトセル）、（ではない白積み重ねられた細胞ではなく、明確な分化細胞）。慎重に選択したコロニーを概説し、コロニーと、すべての差別化された部品をP2滅菌ピペットチップのエッジを持つコロニーの（もしあれば）またはガラスキャピラリーを引っ張っ周囲の差別化された線維芽細胞の層を取り除く。 </li><li>吸引することで、浮動戸分化細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェル20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアを追加します。 </li><li>小片に未分化ヒトES細胞のコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。 </li><li> 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。を1ml /一緒に20 ng / mlのbFGFおよびプールを含むだけでなくhESCのメディアで一回プレートを洗浄してください。 </li><li>コー​​ティングされた新鮮なプレートからマトリゲルまたはヒトラミニン液を吸引除去する。分注し4ミリリットル/ウェルHESCメディアは、6ウェルプレートにコロニーの部分を含む。静かに振盪せずに培養器にプレートを転送し、5％CO 2の雰囲気で加湿37℃のインキュベーターを乱すことなく一晩コロニーピースシードを許可する。 </li></ol> 4。ニコチンで定義された培養システムの下でヒトESの心臓の誘導<ol><li>播種後3日目に、プレートの各ウェルから古いメディアのほとんどを削除し、ヒトES細胞のコロニーは、（ヒトES細胞が乾燥しても決して許さない）浸水することを許可するのに十分なメディアを残す。 20 ng / mlのbFGFおよび10mMのニコチンアミド（NAM）を含む4ミリリットル/よく新鮮なhESCのメディアと交換してください。 </li><li>一日おきに20 ng / mlのbFGFおよび10mMのNAMを含む新鮮なhESCのメディアと古いメディアを交換し、そして心臓の誘発性hESCのコロニーが一日8-10に成長することができます。 NAMに公開する際に、コロニー内のすべてのセルは、乗算を続ける大規模な分化細胞に形態変化を受けることになる。コロニーは、大きさで、一日8-10増加するD細胞はコロニーのいくつかの分野で積み上げを開始します。 </li></ol> 5。浮遊培養での継続的な心臓分化<ol><li>滅菌フードを解剖下に解剖顕微鏡（37〜プリ暖かい解剖段階° C）へのヒトES細胞培養プレートを取る。慎重にコロニーを概説し、P2滅菌ピペットチップのエッジでコロニーを取り巻く線維芽細胞の層（分化した細胞がコロニー外に移行）を削除したり、ガラスが管を引っ張った。 </li><li>吸引することで、浮動戸線維芽細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェルの新鮮なhESCのメディア（bFGFをせずに）を追加します。 </li><li>小片に心臓誘導hESCのコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。 </li><li> 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。一緒に1ミリリットル/ウェルhESCのメディア（bFGFを除く）と、プールで一回プレートを洗浄してください。 </li><li>分注し4メートル4〜5日間を形成する浮遊細胞のクラスターを（cardioblasts）できるように、37℃加湿インキュベーター中、6ウェル超低取付板とインキュベートしてコロニーの部分を含むL /ウェル無血清hESCのメディア。 </li></ol> 6。接着培養における心筋細胞表現型の成熟を打っ<ol><li> 50 mlコニカルチューブに一緒にフローティングcardioblastsを含むメディアプール。 5分、1400 rpmで遠心する。あなたができる限り古い培地を吸引除去し、10mMのNAMを含む新鮮なhESCの心臓分化のメディアの同量を追加します。 </li><li> 4ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートにフローティングcardioblasts、アリコートを混在させる上下にピペッティングし。 cardioblastsが一晩アタッチできるように37℃の加湿インキュベーターにプレートを転送する。 </li><li>一日おきに10 mMのNAMを含むhESCの心臓分化のメディアを交換してください。 </li><li> 8日目で、NAMなしhESCの心臓分化のメディアと交換して、ヒトES細胞心筋分化メディア電子を交換し続ける非常に他の日。拍動心筋細胞は、NAMの撤退後の連続培養の約1〜2週間で現れると、時間と数字で増加し始めるでしょう、そして3ヶ月以上のための強力でリズミカルな収縮を維持することができます。 </li></ol> 7。代表的な結果： ニコチンアミド（NAM）は、多能性を排他的にからcardiomesodermal表現型（ 図2B）に移行するために定義された培養系で維持ヒトES細胞を誘導するのに十分レンダリングされます。 NAMへの未分化ヒトES細胞の露光時に、コロニー内のすべての細胞はOCT - 4の発現をダウンレギュレートし、心臓特異的転写因子（CSX）Nkx2.5とα-を表現するために始めることが大きな分化細胞に形態変化を受けることになるcardiomesodermの表現型（ 図2B）と一致してアクチニン、。これらの分化した細胞は、乗算していきますし、コロニーのサイズが大きくなっています。 Nkx2.5の増加強度なります通常、細胞は（ 図2B）積み上げを開始コロニーの領域で観察される。取り外した後は、NAM -扱わヒトES細胞は、心臓分化のプロセスを続行するには懸濁培養でのフローティング細胞のクラスターを（cardioblasts）形成されます。の自発的な多系統分化と比較して添付するcardioblastsを許可し、1週間のためにNAMを治療するために継続した後、拍動心筋細胞は、効率の大幅な増加とNAMの撤退後の連続培養の約1-2週間で表示されるようになります同期間（ 図2C）以上治療せずにヒトES細胞。拍動心筋細胞のクラスター内のセルは、Nkx2.5とα-アクチニン（ 図2C）を含む、心筋細胞の特徴的なマーカーを発現するであろう。拍動心筋細胞の収縮は、pを連想させる定期的な衝動と、強力な、リズミカルな、よく調整された、とよく連行される電気のプロファイルにより確認された臨床心電図の体表面電極から見た- QRS - T -複合体（ 図2C、またビデオを参照）。心筋細胞は、3ヶ月以上のための彼らの強力な収縮性を保持することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> 図1。専門の機能性細胞へのヒト多能性幹細胞の分化のための小分子誘導アプローチに対する従来のアプローチの全体的なスキーム。 （A）自発胚葉の分化を介してヒト多能性幹細胞の多系統傾きを用いて、従来のアプローチの概略を。排他的に小分子の単純な提供により、特定の臨床的に意義のある系統のヒト多能性幹細胞のよく制御された効率的な誘導の（B）の回路図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> 図2。 ニコチンアミドは、定義された条件と心筋細胞の拍動に向かって進行の下で多能性の直接の心臓系統の仕様を誘導する。 （A）回路図は、ヒトES細胞の指示心臓分化のプロトコルのタイムラインを描いた。 （B）定義された培養システムの下でニコチンアミド（NAM）の未分化ヒトES細胞の曝露時には、コロニー内の大規模差別OCT - 4（赤）陰性細胞は、対照として、模擬処理（DMSO）ヒトES細胞に比べて、現れ始めた。 NAM -誘導OCT - 4陰性細胞は、早期の心臓分化と一貫性、速達Nkx2.5（緑）とα-アクチニン（赤）を始めた。 Nkx2.5の徐々に増加強度は通常の細胞を蓄積し始めた植民地の地域で観察された。すべての細胞はその核のDAPI染色（青色）で示されます。 （C）NAM誘発性心筋コミットヒトES細胞は、細胞のCLUSによって評価される、効率の大幅な増加に拍動心筋細胞が得られたリズミカルな収縮（電気生理学的特徴と動画を参照）、およびNkx2.5（緑）とα-アクチニン（赤）に対して免疫を表示TERS。代表的な大規模な暴行心筋細胞クラスターと心臓の筋肉を収縮代表的なのより高い電力の画像の位相画像は、（また、対応するビデオを参照）が表示されます。矢印は、電気生理学的記録のために使用される大規模な拍動心筋細胞のクラスターを示している。拍動心筋細胞の電気生理学的特徴は、臨床心電図に見られるP - QRS - T -複合体を連想させる定期的に、連行、リズミカルな衝動を示しています。スケールバーは0.1ミリメートル。 動画：NAM誘発ヒトESから分化した心筋細胞を締約。ビデオ1と2のショーの代表的な大規模な添付ファイルの後に約1から3ヶ月で心筋細胞のクラスターを破って。 ビデオ3以上のパワーで心臓の筋肉を収縮4は担当者。 ビデオ5ティピカを示しています。リットル小さな鼓動の心筋細胞のクラスターが自発的にコントロールとしてNAMの治療なしでヒトESから分化した。 <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">ビデオ1を見るにはここをクリック。</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">ビデオ2を見るにはここをクリック。</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">ビデオを見たい方はここをクリックしてください。</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">ビデオ4を見るにはここをクリック。</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">ビデオ5を見るにはここをクリック。</a>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

著者らは、競合する利害を宣言する。 XHPはXceltheraの創設者です。 XHPとEYSは、ヒトES細胞に関連する知的財産を持っている。

発達研究と臨床の翻訳の両方の主要な課題の一つは、効率的かつ予測可能所望の表現型に多能性ヒト幹細胞の広範な分化能をチャネルする方法をされています。このような細胞は、自発的にヒトES細胞由来の多系統凝集体（胚様体）、細胞の唯一のごく一部（&lt;2％）で、多系統の集約の段階を経由して、すべての胚葉の細胞に試験管内で自発的に区別することができますが、心筋細胞13から15（ 図1A）に分化する。以下の免疫選択、心筋細胞の濃縮された集団は、動物モデル13の中心に注入後、機械的および電子的に損傷した心筋の機能を救出するために生物学的ペースメーカーとして機能することができた。齧歯類梗塞モデルでは、移植されたヒトES細胞由来心筋子孫は生き残り、12週間まで成熟することができた、と部分的にremuscular傷ついた心をIZEと収縮機能14,15を改善する。しかし、移植後の多能性細胞と腫瘍形成のリスクが高いの多系統分化を通じて、人間の心臓、コミットされた細胞の生成の非効率性は、さらなる臨床の翻訳を妨げている。心臓の表現型への排他的かつ予測多能性ヒトES細胞の広い分化能を流すための戦略を開発することを活用心臓場でヒトES細胞の生物学の力に不可欠です。一様に特定の系統のヒト多能性幹細胞の変換を達成するために、我々は特定の臨床的に意義のある系統に独占的に多能性ヒトES細胞の十分に制御された効率的な誘導のための条件を識別するために、未分化ヒトES細胞の増殖を保証することのできる定義された培養系を採用小分子のシンプルなプロビジョニング（ 図1Bの ）で。我々は、ニコチンアミドは、pから直接心臓系統コミットメントを誘導することを発見さらなる高効率（ 図2）で拍動心筋細胞に進んで定義された文化の下でluripotentヒトES細胞。 Nkx2.5は、人間の先天性心疾患（CHD）、最も一般的な人間の先天性欠損症16に関連している遺伝子の正常な心臓の開発と変異のために不可欠な進化的に保存されたホメオボックス転写因子です。 Nkx2.5の発現は、これまで検討すべての脊椎動物における心臓前駆細胞の最も早いマーカーであり、適切な心臓の中隔および形成/電気伝導系16の成熟に必須である。脊椎動物では、初期のNkx2.5発現の発症とパターンはほぼ初期胚発生における心臓仕様のタイミングと面積と一致し、Nkx2.5遺伝子は、心臓16の開発によって表現され続けている。私たちのhESCのモデルでは、NAMは心臓特異transcriの発現を促進することにより、多能性ヒトES細胞から直接心臓の誘導を引き起こすように見えたヒト胚心臓発生における多能性胚盤葉上層からcardiomesodermの仕様をエミュレートする可能性があるプロセスでption因子Nkx2.5。今後の研究は再生治療のために臨床的に意義のある系統を派生させる場合にhESCの多能性の運命の小分子を介した直接制御と変調のための道を開く可能性がある、代替案として、人間の心の発達に遺伝的およびエピジェネティックな制御分子を明らかにする。 NAMの治療がなければ、&lt;2％のヒトESは、心筋細胞12-15破っに自発的な分化を受けることになる。 NAMの治療では、我々は、ヒト胚心臓の開発12をエミュレートする可能性があるプロセスで定義する文化の下で保持ヒトES細胞から&gt; 95％胚心臓の前駆体と&gt; 50％の鼓動の心筋細胞を生成することができた。最近、知られている心臓の運命を決定する遺伝子は、&lt;0.5％17、18の低効率と出生後の拍動心筋細胞にマウスの線維芽細胞の分化形質転換するために使用されている&lt;/&gt;のSup。しかし、再プログラム体細胞は、歴史的に異常な遺伝子発現および障害の治療ユーティリティ19から21までの加速老化と関連している。最後に、我々はここで確立されたプロトコルは、内部細胞塊（ICM）または4,5人間の胚盤胞の胚盤葉上層に由来する多能性ヒトES細胞に限定される以前の桑実胚に由来する動物起源のESCは、ES細胞を含む他の多能性細胞、に適用されない場合があります（8細胞）ステージの胚22、および人工的に再プログラム細胞23。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>バイオサイエンスBD </td><td> 356231 </td><td>成長因子は減少</td></tr><tr><td>人間のラミニン</td><td>シグマ</td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ</td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM - KO </td><td>インビトロジェン</td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸溶液（MNAA、100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEMアミノ酸溶液（MEAA、100X） </td&gt; <td>インビトロジェン</td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td>インビトロジェン</td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトトランスフェリン</td><td>シグマ</td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトbFGF </td><td>ぺプロ</td><td> AF - 100 - 18B </td><td></td></tr><tr><td>人間のインスリン</td><td>インビトロジェン</td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td>人間のアクチビン</td><td>ぺプロ</td><td> 120 - 14E </td><td></td></tr><tr><td>定義されたFBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073 - 03 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェル超低取付板</td><td>コー​​ニング</td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

日付に、適切なヒト心筋細胞源の欠如は、セルベースの移植によって、または心臓組織工学,1 - 3で、人間の心筋を再生させるの大きな後退要因となっている。心筋細胞は生後間もなく終末分化と増殖する能力を失うとなる。このような骨髄や臍帯血などの他のソースから派生した幹細胞/前駆細胞は、1-3心臓に移植後の収縮、心臓の筋肉細胞を生じさせることができるという証拠はない。損傷した心臓の筋肉を再生または修復する必要がある内因性または1-3細胞の配信を介してのいずれか、成体幹細胞治療によって満たされていない。遺伝的に安定したヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）を必要とする系統に制限されているヒト体細胞の大規模な供給のin vitroでの導出のための多能貯水池をproffering、無制限の拡張機能と無制限の可塑性を持っている修復と再生4,5の。心血管疾患の有病率ドナー臓器の全世界と深刻な不足のために、別のアプローチとして、ヒトES細胞ベースの治療法の開発に強い関心があります。しかし、所望の表現型に効率的かつ予測可能な多能性ヒトES細胞の広い分化能をチャネルする方法を発達研究と臨床の翻訳の両方にとって大きな課題となっています。従来のアプローチは、しばしば表現型の異質性と不安定性、それゆえ、腫瘍形成6-8のハイリスク（で回路図を参照して続いている非効率的で制御不能系統コミットメントの結果として、自発的な胚層の差別化による多能性幹細胞の多系統傾きに依存しています図1A）。さらに、定義されていない外国人/動物の生物学的なサプリメントおよび/または一般的に隔離、拡張、およびヒトES細胞の分化のために使用されているフィーダは、このような細胞specialiを直接使用することがあります9月11日 、問題のある患者でZED移植。これらの障害を克服するために、我々は臨床的に適切なヒトES細胞の de novo導出するためのプラットフォームとして、ヒトES細胞の胚盤葉上層のpluripotenceを維持するために必要かつ十分な定義培養系の要素を解決し、効果的に臨床的に意義のある系統に向かって一様にそのようなヒトES細胞を演出している小分子12（ 図1Bの回路図を参照）によって。小分子や増殖因子の様々なスクリーニングした後、我々はそのような定義された条件は、レンダリングされたニコチンアミド（NAM）、さらに高効率（ 図2と人間の拍動心筋細胞を生成cardioblastsに進んだ多能性ヒトES細胞から直接cardiomesodermの仕様を誘導するのに十分を発見）。我々は十分に制御された効率的な導出を可能にする、介在する多系統胚様体ステージのない多能性ヒトES細胞から直接cardioblastsの誘導のための条件を定義細胞ベースの治療のための発達段階のスペクトルにわたってヒト心筋細胞の大量供給。

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K ビュー.  San Diego Regenerative Medicine Institute. 私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

生物学

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

ヒト胚性幹細胞を凍結融解

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...