この作品は、自然科学とカナダの工学研究会（NSERC）ディスカバリーグラント＃40352でサポートされていた、キャンパスMHMにイノベーションプログラム委員長、アルバータアルツハイマー研究プログラムのためのアルバータ州、およびNSERCはMKにBIFの博士フェローシップとAIHS大学院の交わりに、CREATE。私たちは、このプロトコルの開発のため、手術の訓練のためにプルトニウムミン・ワング感謝し、そしてベアルー・ミアッサアガーとディ少飼育のために。

<html>以下のプロトコルは、レスブリッジ大学の動物実験委員会（ACC）のガイドラインに従い、動物ケアのカナダ・カウンシル（CCAC）の基準に準拠して実施されます。 1.準備<ol><li>長期の研究期間については、開いているすべての手術用品をオートクレーブし、その無菌性が手術を通して維持されていることを確認。複数の手術が必要な場合は、手術の間にオートクレーブ。 </li><li>一方で脳バッファ（少なくとも50 mL）中の十分にあることを確認します。溶液は、134 mM塩化ナトリウム、5.4 mMのカリウム、1mMの塩化マグネシウム六水和物、1.8mMの塩化カルシウム二水和物、および5mM HEPESナトリウム、5Mの塩化水素で7.4に平衡pH値で構成されています。 </li><li>誘導チャンバ内にマウスを置き、3で麻酔 - 4％イソフルラン。手術中のメンテナンスのために2.0％イソフルラン - 1.0に従ってください。撮像中に0.8％ - さらにとして低い0.4に下げますSは= &quot;XREF&quot;&gt; 5、13、14、15、適切な麻酔を維持しました。麻酔のこれらの低いレベルは、それが痛みを伴う刺激に対するareflexicまま確実にするために、マウス（約5分毎）の警戒及び頻繁なモニタリングを必要とします。 注：脱水は、マウスの体積比に高い面に問題となるとイソフルランの長期間の使用によって悪化することができます。 <ol><li> 2時間 - 生理食塩水の皮下注射、体重10g当たり0.1mLの、すべて1を使用します。 2時間 - 十分に水和すると、マウスは、一度1に排尿します。 </li></ol></li><li>密接に手術や画像全体で一貫性のある麻酔を確保するために、マウスを監視します。無人のマウスを残し、それが意識を取り戻すことはありませんことを世話をしないでください。 </li><li> 37°Cに設定し、熱調節加熱パッド上のヘッドホルダーセットアップと場所に麻酔をかけたマウスを転送します。上位teetを確保hを歯のホルダーに入れます。 </li><li>マウスの頭を左に約30°回転させて、頭の右側面を露出させ、マウスの頭を耳の鈍い端で固定します（ 図1A ）。 </li><li>角膜乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布する。 </li><li>脳浮腫を軽減するために、デキサメタゾン（4mg / kg）を筋肉内に注射する。 </li><li> 4％クロルヘキシジン（3回）と70％エタノール（3回）に浸した綿棒で外科領域を覆って皮膚を拭きます。各綿棒は一度だけ使用してください。 </li><li>外科用手袋を着用し、粘着性プラスチックラップで動物を覆う。開頭手術部位の皮下にリドカイン（8-10mg / kg; 2％エピネフリン）を注射することにより、局所麻酔薬を投与する。薬物が組織に吸収されるまで3〜5分間待ちます。 </li></ol> 2.スキンの取り外しとスカルからのマッスルの引き込み<ol><li>頭蓋骨を下に見ながらこれらの手順のほとんどすべてを実行してください解剖顕微鏡（ 例えば、0.7 - 4.5倍のパワー、状況に応じて）。 </li><li>鉗子で（ちょうど耳の後ろ）正中線の左皮膚1ミリメートルを持ち上げ、手術ハサミで小さな水平方向の切開部を作ります。 </li><li>右耳に向かって6ミリメートル横カットし、次にヘッドの吻側端部に向かって切断 - 5を作ります。 </li><li>最初の切開の時点では、はさみを挿入し、吻側10ミリメートルを切りました。 </li><li>右耳の周りの皮膚をカットし、右目の近くに頭蓋骨と頭筋の右側を公開します。露出された領域の最も広い部分は、少なくとも7 mmであることを確認してください。手術領域を拡張する必要がある場合は、さらに皮膚をトリミング。 </li><li>頭蓋骨と皮膚との間ブチルシアノアクリレート接着剤を数滴入れて切開部の周りの皮膚を修正。組織が以前に接着剤の効力を増加させるために、綿アプリケータ先端又は圧延組織で乾燥されていることを確認。 </li><li>綿棒を使用して、表面をこすります頭蓋骨から骨膜を除去するために円運動で頭蓋骨を摘出する。頭蓋骨を完全に乾燥させることによって、何も残らないようにしてください。 </li><li>春のはさみと鉗子を使用して、頭蓋骨から側頭筋を分離します。頬骨骨に達するまで筋肉を横方向に切断し、収縮させる（ 図1C ）。目の近くの頬骨骨のレベルに沿って走る表面的な側頭静脈に損傷を与えないように注意してください。そうでなければ出血が起こる可能性があります。 </li><li>脳緩衝液中に予め浸したゲルフォームで出血をコントロールする。重度の出血の場合は、熱焼灼器を使用してください。熱焼灼剤で処理した後、ブチルシアノアクリレート接着剤を出血部位に滴下する。接着剤の有効性を高めるために、綿でチップを塗布したアプリケータまたはロール状のティッシュを使用して、あらかじめ乾燥させておいてください。 </li></ol> 3.頭蓋切開術注：外科医は頭蓋骨の除去中に勤勉にしなければならず、不要な合併症を回避するために硬膜。合併症が発生しなければならないトラブルシューティングのステップが含まれています。 <ol><li>根底にある脳領域を配向するマークブレグマの位置微細先端マーカーと、又は小三角片テープを切断し、ブレグマでコーナー点のいずれか（ 図2A）。 </li><li>ヘッドプレートを貼付する前に、頭蓋骨が完全に乾燥していることを確認してください。頭蓋骨は、より多くの乾燥が必要な場合、脳のバッファーに浸したゲルフォームの適用後に素早く空気乾燥し、綿棒綿棒を使用しています。このステップは、ヘッドプレート固定（ 図1B）のために重要です。 注：骨膜がある場合には頭蓋骨に残された、または頭蓋骨はヘッドプレートに接着する前に乾燥していない場合、それはおそらく切り離します。この問題が発生した場合は、そっとヘッドプレートを削除して最初からやり直します。出血は、このプロセスの間に発生する可能性があります。それが凝固するために数分を許可した後、そっと取り外します。このプロセスは、二回以上繰り返すことが推奨されていません。 </li> &lt;Liが&gt;ヘッドプレート16の底部エッジの周りエチルシアノアクリレート接着剤を適用し、そして開頭術領域（ 図1Dおよび図2A）を介してヘッドプレートを接着します。 </li><li>暴露のみ開頭エリアを離れる歯科用セメントで頭蓋骨とヘッドプレートとの間の開口スペースを埋めます。乾燥及び硬化する歯科用セメントを待ち、典型的には5から10分（ 図2B）。 <ol><li>セメントが設定されると、簡単に脳緩衝液で十分に記入し、3浸漬することができます - 5分。 （ 図2C）を掘削する前に脳のバッファを削除するには、圧延組織を使用してください。 </li></ol></li><li>軽く歯科用ドリルで頭蓋骨の表面を採点することによって手術領域の概要を説明します。 FG¼バリと、（20 PSIの最大値に設定される）空気圧ドリルを使用し、可変速度フットペダルを用いて制御されます。 </li><li>静かにそれを深めるために、元のスコアリングに沿ってドリルをトレースし、電子ドリルが頭蓋骨を貫通して脳内に侵入していないことを確認します（ 図2D ）。訓練と湿った圧延組織で頭蓋骨の表面をダビングする間に、数分ごとに交代してください。これは、機械的摩擦と長期間の暴露から頭蓋骨の加熱と乾燥を減少させる。 注：湿ったゲルフォームの適用後、頭蓋骨は急速に乾燥します。乾燥がさらに必要な場合は、綿棒を使用してください。 注意：頭蓋骨の厚さは不均一です。例えば、頭頂 - 側隆起は最も厚い領域であり、正中線付近の頭蓋領域および足蹠領域は比較的薄い。 </li><li>穿孔中に、鉗子または動かないドリルビットで静かに頭蓋骨を押すことによって頭蓋骨の座屈を定期的にチェックします。骨が座屈し始めると、穿孔をやめ、窓全体を脳の緩衝液に浸します。 注：血液がある領域から流出すると、硬膜が損傷している可能性があります。このような場合は、semI-濡れ面積でゲルフォーム、ゆっくり綿棒綿棒でゲルフォームに圧力をかけながら血液を吸収してみてください。 </li><li>骨を柔らかくすると簡単に頭蓋骨の除去プロセスを作り、骨に付着する硬膜の機会を減らすために頭蓋骨の除去の前に少なくとも5分間待ちます。 </li><li>頭蓋骨は脳のバッファに沈めている間に、頭蓋骨の除去プロセスを実行します。 注：頭蓋骨の一部が頑固に付着したままである場合、＃11手術用メスの刃を穏やかに頭蓋骨をスコアするために使用することができます。頭蓋骨を貫通して脳に刃に穴を開けないように細心の注意を払ってください。 </li><li>前縁から始まる、優しく鉗子を用いて硬膜から緩い頭蓋骨をてこ。 注：出血少量の頭蓋骨の除去プロセス中に発生した場合、転送ピペットまたは注射器でバッファを削除し、新しいバッファーと交換してください。 </li><li>骨が緩んでいるとしたらピンセットで骨、硬膜にしっかりとグリップを「フローティング」とから骨を持ち上げます硬膜。骨を確認し脳に浸透することはありません。 </li><li>出血を制御するには、ポイントへの組織のコーナーを展開し、頭蓋井戸からバッファの大部分を除去します。綿チップ綿棒で非常に軽い圧力を加えながら急速出血領域に、緩衝液に予め浸したゲルフォームを、適用します。 注：出血は通常、骨や硬膜の表面の端から来ています。どちらの場合は正常であり、重大な血管が損傷されていない場合、出血はすぐに停止します。出血が続く場合、血液は、撮像領域上血餅シートを形成し、ウィンドウ全体を埋めることができます。 <ol><li>破裂した血管の源の周りに完全な血餅を残して血餅シートを除去するために、慎重に撮像領域から凝固した血液の部分を拾います。これはさらに多くの血液の損失を引き起こす可能性がブリードソースから血塊を削除しないように注意してください。すべての血液を洗い流すために脳の緩衝液で脳の表面を灌漑。 </li><li>触れないように注意してください繊細な脳組織または脳に異物を追加します。 5分（ 図2E） -出血が約2ため、停止するまで繰り返します。 注：この時点では、開頭は（ステップ5を参照）頭蓋窓を製造するための準備ができています。必要な場合は、（ステップ4を参照）頭蓋窓を注入する前に硬膜を削除します。 </li></ol></li></ol> 4.デュラの取り外し注：デュラ除去は細心の注意を必要とし、15分かけてかかる場合があります。 <ol><li>開頭手術から余分なバッファを離れて描画します。湿った表面を維持しながら、鉗子で硬膜の小片を取得し、穏やかに硬膜を引き裂きます。 </li><li>そっと涙と硬膜を切り取るために鉗子や春のはさみを使用してください。 </li><li>硬膜を浮遊し、それが脳から分離を助けるために、脳の表面に多くの脳のバッファをドロップします。すべての硬膜は頭蓋窓サイトから削除されるまで続けます。正しく実行すると脳が明確なBLと非常にきれいなように見えますOOD容器とない傷（2Fと図2Eを比較）。 注意：硬膜の一部の地域では、（頭頂連合野に正中近位の近くで、 例えば ）は、脳の表面に小さな細動脈に添付されており、このようなの除去は、動脈を破裂することができます。このような場合には、動脈の上に無傷の硬膜の小部分を残すように、より良いかもしれません。 VSDは、その小領域に浸透しないことがあり、これは大出血を有することが好ましいです。 </li><li> （ステップ5を参照）とすぐに脈動からの移動を最小限に抑え、さらに膨潤を防止することができるようにアガロース中脳表面に固定します。 </li></ol>頭蓋窓の準備5. <ol><li> 70％エタノールを用いてカバーガラスをスプレーし、穏やかに乾燥するために空気ボンベを使用。ガラスは無スポットやほこりの存在と完全にクリーンであることを確認してください。 </li><li>脳バッファー15mLに溶解したアガロース粉末200mgのを加熱することにより、1.3％のアガロースを調製。マイクロWを設定します。全ての寒天が溶解するまで、穏やか間における攪拌、一度に15秒 - 10に対する高いと熱aveの。 注：これらの撮像を妨害するように、気泡または粒子が存在しないことを確認します。 </li><li>ホットアガロース中に温度計を置き、までアガロースを冷却するだけで温度を凝固させる上記（〜40°C）。 注：アガロース容器の外側の上に冷たい水を実行するには、冷却プロセスを加速します。穏やかに気泡または粒子が存在しないことを確認するために連続的に攪拌します。 </li><li>すぐに寒天を適用する前に、頭蓋井戸から脳のバッファを削除します。トランスファーピペットを用いてアガロースを策定し、脳に直接アガロースをドロップします。素早く表面にカバースリップを置き、四隅にアガロースドロップでカバースリップを固定します。 </li></ol> 6.安楽死注：私たちの経験では、この手順は経験のテイク外科医少なくとも3から4の練習手術は90％以上を達成するために、成功率。経験の少ない外科医はもっと練習が必要な場合があります。開頭術またはdurotomyの間に、脳は、脳内への骨ドリルスルーパンチかのようにダメージを、維持することがあります。開頭の端にいくつかのマイナーなダメージが許されることがあります。脳が真っ赤な損傷を受けていない血管や白皮質と「クリーン」を見ていない場合は、実験が終了する必要があるかもしれません。貧しい製剤の例としては、死んだ血管を有するものを含む、または皮質が破れたり損傷した血管でマークされたとき。これらの兆候のいずれかが存在する場合、実験はそう、高品質なデータが得られます。手術/実験が成功したかどうかは、人道的に、実験の終了時にマウスを安楽死させます。 <ol><li>深く少なくとも3.5％イソフルランで麻酔。次いで、300mgの/ kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射を与えます。針は、肝臓内に挿入された場合、理想的には、死は非常に迅速（&lt;1分）であろう。 </li><li>灌流が必要な場合は、動物が深く（ステップ1.3を参照）に進む前に麻酔をかけていることを確認します。 </li><li>灌流が必要とされない場合あるいは、最低5分間待ってから、マウスが死んでいることを確認してください。呼吸、心拍の欠如だけでなく、痛みの撤退と角膜反射の欠如を確認してください。また、皮質の上に血管の淡い青/白四肢の着色や暗さのために観察します。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

大きな頭蓋窓のためのこの革新的なプロトコルは、大脳皮質の時間と頭頂領域の上に同時イメージングを可能にします。光学イメージングと組み合わせることで、それが自発的かつ刺激によって誘発される活動中の皮質領域内の神経ダイナミクスを明らかにすることができます。この膨張開頭術はまた、血流および虚血モデルの横方向の血管の直接操作のインビボイメージングに有効に、中大脳動脈（MCA）の近位端を含む皮質血管網の大きな拡張を公開します。この技術は、電圧とカルシウム指示薬タンパク質23を発現するマウスの最近開発されたラインに対して非常に有用であろう。これらのマウスは、皮質に電位感受性色素をインキュベートするための必要性をバイパスの実用的な利点を提供します。これらの外因性色素は、適切に脳組織に浸透するには時間がかかる（〜60から90分）し、その穏やかな毒性によって制限されています。大きな開頭術も持っています以前VSDI 11を使用した開発ラットの脳を研究するために利用されて。新生児ラットは、はるかに大きな頭を持っており、成体マウスと同等のサイズのです。これは、トランスジェニックマウスではないとはいえ、神経科学における発達障害を研究するユニークな機会を研究者に提供します。 この方法の主な制限は、慢性実験のためにできないことです。頭蓋骨の曲率は、ドリル加工がより困難になり、時間が少ない開頭術よりも消費します。この大きな開頭術のためには、レンズの焦点面と平行になるように、中央縫合squamosal目印でヘッドを位置決めするために重要です。脳の一部の歪みが脳の曲率から予想されるが、これらは、皮質の表層に焦点を合わせることによって克服されます。この問題は、さらなる刺激と平均の多数の繰り返しを取得することによって軽減されます。要約すると、私たちの大きな開頭技術が広くアプリです神経生物学における現在の問題の研究のためlicable。

開頭術は、脳の一部を明らかにするために神経科学者が使用する標準的な手順です。電気生理学の始まり以来、開頭術は神経科学の分野で未曾有のブレークスルーを可能にしました。大脳皮質と電極との密なマッピングは、これらのマップに基づいて仮説と理論を試験する実験につながった。我々は最近、皮質血流1,2,3および神経血管構造4の インビボイメージングのために開頭術が利用される新しい時代に入り、露出領域5,6,7内の皮質活動のリアルタイム視覚化を可能にする。多くの研究が、皮質ニューロン、グリア、およびコルの構造および機能を研究するために、 インビボ光学イメージング技術と組み合わせた頭蓋切開術を使用するがTICAL血管系8、9、さらなる調査が露出皮質の小領域によって制限され（ただし、10を参照）されています。 このプロトコルの目的は、大きな横方向の開頭術を作成squamosal骨に正中線から大脳皮質を露出し、ブレグマとラムダを超えて拡張するための方法を提供することです。この大きな開頭術は、関連皮質（retrosplenial、帯状、及び頭頂部）、第一級および第二モータ、体性感覚、視覚、及び聴覚皮質の同時観察を可能にします。この方法は、以前に皮質領域は、自発的及び刺激誘発性の皮質活動5、11、12の間に互いに相互作用する方法を複数調査する電圧感受性色素イメージング（VSDI）と結合されています。この手順の最も挑戦的な側面は、ヘッドの位置決めが含ま動物の、ヘッドプレートを固定し、頭頂骨から頭筋を分離しながら出血を回避することができます。ケアはまた、斜めの角度で頭蓋骨曲線として掘削および頭蓋骨除去プロセス中に撮影されなければなりません。

<table><tbody><tr><td>Heating Pad</td><td>FHC</td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2 or more pairs are recommended</td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00, 15000-10</td><td>1 pair should be designated for dura removal&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Jet tooth shade powder</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Powder</td><td>to be mixed with the Jet Liquid</td></tr><tr><td>Jet tooth shade liquid</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Liquid</td><td>to be mixed wihth the Jet Powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389</td><td>Midwest Dental</td><td>385201</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Sinclair Dental Canada</td><td>Pfizer Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>124125</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine 2% Epinephrine</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125299</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethazone 5&amp;nbsp;mg/mL</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>Butyl cyanoacrylate glue (VetBond)</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

a large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity

開頭術は、in vivo実験のために脳を露出させるために一般的に実行される手順です。マウスの研究では、ほとんどのラボは、小さな開頭、典型的には3ミリメートル×3ミリメートルを利用します。このプロトコルは、マウスの時間と頭頂皮質上大脳半球の大部分を露出させ、実質的により大きな7ミリメートルX 6ミリメートル頭蓋窓を作成する方法を紹介（ -横4.5ミリメートル0 - 6ミリメートル、例えば、2.5をブレグマ）。この手術を行うために、ヘッドは約30°傾斜しなければならないと頭筋の多くが後退しなければなりません。骨の除去を大量に、この手順は、手術や実験を通して麻酔した動物と急性実験のために意図されます。 この革新的な大きな横頭蓋窓の主な利点は、皮質の両方の内側と外側の領域への同時アクセスを提供することです。この大規模な一方的な頭蓋窓は、細胞間の神経ダイナミクスを研究するために使用することができ、多電極電気生理学的記録、ニューロン活動（ 例えば、内因性または外因性のイメージング）の画像化、および光発生刺激を組み合わせることによって、異なる皮質領域の間で行うことができる。さらに、この大きな開頭術は皮質血管の広い領域を露出させ、側皮皮質脈管構造の直接操作を可能にする。

<html> 6mmの横 - 単一の半球内皮質領域間の相互作用を研究するために、我々は、矢状静脈洞及び5を横切って延びる大きな開頭術を用います。この頭蓋窓は、一次（モータ、体性感覚、視覚、聴覚）、二次（視覚モータ）、および右の脳半球の対応付け（retrosplenial、帯状回、頭頂協会）皮質（ 図3A）を含んでいました。この作業のために、我々は3膜電位の変化を反映する電圧感受性色素（VSD）イメージングを使用しました。このプロトコルはまた、他の外因性（ 例えば 、カルシウム17およびグルタミン酸18イメージング）又は固有イメージング実験のために有用であろう。後肢、前肢、ウィスカー、視覚的、または0.5％イソフルランを用いて軽く麻酔したマウスの聴覚系を刺激する場合、我々は、（皮質脱分極のコンセンサスパターンを観察し&gt;図3B）。以前の研究5、19、20、21、22と一致して、我々は、C2のバレル皮質の簡単な触覚刺激は、一次体性感覚領域の活性化だけでなく、機能的に関連する領域内の回答の「島」につながったことがわかりました。例えば、一次運動野（M1）または体性感覚皮質の二次表現（S2; 図3Bi）。単一の1ミリ秒のトーンピップ（25 kHzの）刺激は、約20ミリ秒の聴覚刺激（ 図3Bii）の後に、一次聴覚野（A1）の活性化につながりました。今後数ミリ秒かけて、脱分極は、聴覚皮質に広がると、隣接二次体性感覚野に渡されます。約25ミリ秒のトーン発症後、二次皮質脱分極は1.0に位置し、出てくるでしょう7; 0.2ミリメートルの内側および1.9±0.1ブレグマへミリメートル後方相対（N = 9匹のマウス）。これは、約頭頂連合野（PTA）の位置です。 VSD信号は、他の皮質関連領域はretrosplenial（RS）及び帯状皮質（CG）などに配置されている正中線領域に伝播しました。したがって、聴覚刺激は、そこからVSD脱分極の広がりの進行波正中皮質内のより広い領域には2つの別々の焦点領域の活性化につながりました。 1ミリ秒の緑色と反対側の眼の焦点刺激は、パルスLED 40ミリ秒（ 図3BV）内の一次視覚野の活性化につながりました。横方向、内側に位置する隣接領域にVSD脱分極の（1）空間的拡張、および初期の活性化領域の前方;視覚皮質のこの一次活性化が続きました（2）第二中間皮質領域の脱分極は刺激後約50ミリ秒（N = 8回の実験）SAに沿って配置され<html> gittal縫合糸。これは、前肢（ 図3Biii）、後肢（ 図3Biv）、C2ウィスカー、または聴覚の感覚刺激と同様でした。刺激後40ミリ - 前肢、後肢、または聴覚の感覚刺激から誘発VSDI応答は、最初の活性の異方性拡散、ならびに20の周囲皮質の正中線の活性化に続いて、それぞれの一次感覚皮質を、活性化しました。この結果は、視覚とウィスカの刺激からの応答と同様でした。これらの正中線経路に沿って感覚誘発活動の伝播及び自発活動6による同じ領域の頻繁な活性化は、これらの領域は、感覚情報が自発的皮質活動と統合してもよいしたマウスの皮質の接続コアの中央ハブであることを示唆してもよいです。 2fig1.jpg」/&gt; 図1。 外科セットアップと準備。 （A）マウスヘッドは、洗浄、剃毛横露光に約30°回転し、耳バーの平滑末端で固定されています。イソフルラン麻酔薬は、ノーズピースと歯ホルダを介して送達されます。マウスは増加無菌性と暖かさのための自己粘着性プラスチックラップで覆われています。 （B）のクローズアップを示す皮膚と頭頂頭蓋骨プレートから除去骨膜は、頭筋はそのままです。 （C）側頭筋は、時間プレートとsquamosal骨を露出除去され、表在静脈が損傷を受けていないことに注意。固定の前に（D）は 、ヘッドプレートをワックスで正しい位置に配置されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/52642/52642fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2。 ステップバイステップの外科的処置。 （A）は 、ヘッドプレートは、前方および後方の位置でエチルシアノアクリレート接着剤で頭蓋骨に取り付けられています。ブレグマの位置（三角テープの黒い部分）に注意してください。 （B）頭蓋窓は、ヘッドプレートと頭蓋骨との間に厚く歯科用セメントを塗布することにより調製されます。そのブレグマに注意しsquamosalランドマークが表示されたまま。セメントの乾燥後（C）は 、脳のバッファは、頭蓋骨を軟化させ、硬膜の付着を防止するために添加されます。ロール組織は、掘削前に脳のバッファを削除するのに役立ちます。 （D）開頭のエッジが獲得されてきました。血管系がより簡単に歯科用セメントのエッジ付近で薄くなった骨を通して見ている注意してください。 （E）頭頂および時間頭蓋骨プレートをremovされていますEDと硬膜が表示されます。正常な小出血、硬膜からの血液の傷に注意してください。 2下の慎重な検討 - 4Xの倍率は、血管の二層、硬膜内の1とPIAの他を明らかにします。 （F）硬膜は、原始皮質を明らかに除去されます。軟膜血管系の現在無し傷と明るい赤です。頭蓋窓の縁に白色硬膜の浮遊片に留意されたいです。この例では、急速凝固頭蓋窓の後部におけるマイナー硬膜出血がありました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/52642/52642fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/52642/52642fig3.jpg" /> 図3。 感覚刺激の複数のフォーム中にユニークで合意アクティベーションパターン。 &lt;<html>画像形成された皮質領域を示す片側開頭の/強い&gt;（A）は概略。 （B）各画像に白丸で示したブレグマ広い片側開頭術の顕微鏡写真。皮質の活性化のパターンは、（i）刺激対C2ウィスカーの（STIM）、（ii）の聴覚刺激、（iii）の反対側前肢刺激、（IV）対後肢刺激及び後イソフルラン（0.5％）で麻酔したマウスに示します。 （V）、発光ダイオード（LED）と反対側の眼の視覚刺激。一次感覚皮質活性化後25秒 - 10における感覚刺激のすべての形態（白矢印）後の正中線の活性化がありました。応答は20回の試行の平均値です。第二行（II）の左からの画像は、前（A）、後方（P）、中間（M）及び横方向（L）方向を示しています。 ら、2013 Mohajeraniからの許可を得て変更されました。p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg」ターゲット= 『_空白』&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

このプロトコルは、マウス大脳皮質の時間と頭頂領域の上に大規模な一方的な開頭手術を作成するための方法を提示しています。これは、皮質半球の広大な面積でリアルタイムイメージングのために特に便利です。

脳活動のメソスケール広視野光学イメージングのために大きな横開頭術手順

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K ビュー.  University of Lethbridge. このプロトコルは、マウス大脳皮質の時間と頭頂領域の上に大規模な一方的な開頭手術を作成するための方法を提示しています。これは、皮質半球の広大な面積でリアルタイムイメージングのために特に便利です。 

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A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

生物学

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

がん研究

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

神経科学

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック<emインビボで&gt;</em&gt;光干渉断層イメージング

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

横慢性頭蓋窓の準備を有効<em&gt;インビボ</em&gt;マウスの遠位中大脳動脈閉塞後に観測

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

縦<em&gt;インビボ</em&gt;脳血管系のイメージング：中枢神経系疾患との関連

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

医学

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

覚醒マウスの海馬毛細血管の In Vivo ファイバー結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡 (pCLE)

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

頭部固定型および自由自在に動く動物におけるマイクロプリズムを用いた多層イメージング

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for studying the structure, function, and plasticity of living brain tissues. In comparison to conventional electrophysiology, fluorescence microscopy can capture the neural activity as well as the morphology of the cells, enabling long-term recordings of the identified neuron populations at single-cell or subcellular resolution. However, high-resolution imaging typically requires a stable, head-fixed setup that restricts the movement of the animal, and the preparation of a flat surface of transparent glass allows visualization of neurons at one or more horizontal planes but is limited in studying the vertical processes running across different depths. Here, we describe a procedure to combine a head plate fixation and a microprism that gives multilayer and multimodal imaging. This surgical preparation not only gives access to the entire column of the mouse visual cortex but allows two-photon imaging in a head-fixed position and one-photon imaging in a freely moving paradigm. Using this approach, one can sample identified cell populations across different cortical layers, register their responses under head-fixed and freely moving states, and track the long-term changes over months. Thus, this method provides a comprehensive assay of the microcircuits, enabling direct comparison of neural activities evoked by well-controlled stimuli and under a natural behavioral paradigm.

著者スポットライト:覚醒状態と自由運動状態における神経活動の比較イメージング

When integrated with a head-plate and an optical design compatible with both single- and two-photon microscopes, the microprism lens presents a significant advantage in measuring neural responses in a vertical column under diverse conditions, including well-controlled experiments in head-fixed states or natural behavioral tasks in freely moving animals.

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...

脳活動のメソスケール広視野光学イメージングのために大きな横開頭術手順

要約

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慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック

小脳軸索のレーザーNanosurgery

横慢性頭蓋窓の準備を有効

縦

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

覚醒マウスの海馬毛細血管の In Vivo ファイバー結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡 (pCLE)

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング