The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

주 : 사용 데이터 시트가 프로토콜의 모든 단계를 추적하는 단계; 예를 들어, 데이터 시트는 보충 자료 테이블 S2-S4에 제시되어있다. 1. 표준 곡선 준비 <ol><li> (예를 들어, 장갑 RNA EPA-1615) 2.5 × 108 입자 / ㎖ (2.5 × 10 8 GC / ㎖) TSM의 사용 농도로 제조자에 의해 공급되는 농도로 희석하여 표준 곡선 시약 작업 스톡을 제조 III 버퍼입니다. -20 ℃에서 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브 및 저장소를 사용하여 250 μL 분취 액으로 작업 주식을 나눈다. 참고 : 다른 표준 곡선 시약으로 사용하기위한 준비 작업 바이러스의 주식과 플라스미드에 대한 지침은 보충 자료 프로토콜 단계 (S1)를 참조하십시오. </li><li> 작업 스톡 분취 량 중 하나 이상을 해동. 2.5 × 10 (7)의 농도를 제공, 2.5 × 10 (6), 2.5 × 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 이용하여 5 ~ 10 배 연속 희석을 준비105, 2.5 × 104, 2.5 × 103 GC / ㎖. <ol><li> TSM III 버퍼 225 μL에 2.5 × 10 8 GC / ㎖ 작업 주식의 25 μl를 추가하여 최초의 희석을 준비합니다. 볼텍스 혼합기를 사용하여 5 ~ 15 초 동안 혼합한다. </li><li> TSM III 완충액 225 μL 단계 1.2.1에서 제조 한 희석액 25 μl를 첨가하여 희석 다음을 준비한다. 다시 혼합하고, 다음 세 10 배 희석액을 조제 유사한 과정을 계속한다. </li></ol></li><li> 표준 곡선 작업 재고에서 RNA와 바로 제 3의 절차를 사용하여 다섯 희석의 압축을 풉니 다. </li></ol> 2. 고등 농도 <ol><li> 상부 샘플 챔버로 1X PBS 중 적어도 10 ㎖, 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 첨가하여 각각의 샘플 채취 용 원심 농축기 (30,000 분자량 컷)을 준비한다. 이 솔루션은 얇은 채널 농도 챔버를 채운 확인하고 4 ℃에서 O / N을 누릅니다. <ol><li&gt; 유체를 폐기하십시오. 과량의 BSA를 제거하고 물을 폐기 멸균 시약 등급 이상의 물 10 mL로 농축 한 번 씻어. </li></ol></li><li> S, 원심 분리 농축기로 상기 분석 샘플 량과 동일한 각 시험 샘플로부터 이차 물 농축액의 양을 추가한다. <ol><li> 식 (1) 사용 (S)를 계산, <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> D는있는 분석 원래 물 샘플의 볼륨 인 경우, TSV는 전체 샘플 볼륨과 FCSV는 최종 농축 샘플 볼륨입니다. S.의 계산의 예를 들면 기업 재료 S2보기 </li></ol></li><li> 원심 분리기 (20)에 대한 스윙 버킷 회에서 4 ° C에서 3,000~6,000 XG에 각각의 테스트 샘플 - 30 분. 얇은 채널 농도 챔버에서 볼륨을 확인합니다. <ol><li> 볼륨이 20 분 이상 다시보다 400 μL, 원심 분리기 인 경우. 일의 샘플까지 원심 계속전자 얇은 채널 농도 실 미만 400 μL로 감소되었다. 상층 액을 제거하지 마십시오. </li></ol></li><li> 바이러스의 회수를 증가시키기 위해 멸균 0.15 M 인산 나트륨 1 ㎖, pH를 7-7.5로 원심 농축기의 측면을 세척한다. 원심 분리기는 다시 3,000~6,000 XG, 4 ° C에서 샘플 미만 400 μL로 감소 될 때까지. 이 세척 단계를 하나의 추가 시간을 반복합니다. </li><li> , 100-200 μL의 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 측정하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (즉, 마이크로 원심 튜브에 200 μL를 전송하고 나머지 유체가 완전히 인출 될 때까지 다음, 마이크로 피펫을 조정함으로써, 농축 잔액을 측정하기 위해 각각의 농축 시료를 전송할 ) 피펫 팁으로. 400 ± 2 μL에 최종 볼륨을 조정, 0.15 M 인산 나트륨, pH를 7-7.5을 추가합니다. </li><li> 즉시 3. processe 수없는 농축 샘플을 잡고 단계로 진행하여 핵산을 추출d를 즉시 이하 24 시간 동안 4 ° C에서. </li></ol> 3. 핵산 분리 <ol><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 라벨 분리하는 단계 1.3 단계 2.5 표준 곡선 희석에서 각각의 시료에서 단계에 차 농축액 3.3 200 μl를 기술 된 바와 같이 제조 된 추출 버퍼 200 μl를 추가합니다. 또는 -70 ℃ 이하 차 농축 나머지 동결. 다음을 제외 혈액 샘플 스핀 프로토콜 핵산 추출 키트 제조자의 지시에 따라 각 시료로부터 핵산을 추출한다. </li><li> 물 샘플에 단백질 분해 효소를 추가하거나 핵산 추출 키트와 함께 제공되는 추출 버퍼를 사용하지 마십시오. </li><li> 캐리어 RNA로 추출 버퍼를 준비 <ol><li> 캐리어 RNA의 310 μg의 들어있는 유리 병에 캐리어 RNA 희석 버퍼의 310 μl를 추가합니다. 용해 후 50 μl를 포함하는 6 분취 량으로 나누어 섞는다. -20에서 보관기음. </li><li> 0.027 μg의 / μL의 캐리어 RNA 농도를 얻기 위해 추출 완충액 1 ㎖ 당 해동 캐리어 RNA의 28 μL를 추가한다. 추출 키트와 함께 제공하는 대신에, 캐리어 - 개정 RNA 추출 완충액을 사용한다. </li></ol></li><li> 리보 뉴 클레아 제를 첨가하여 용출 완충제 마스터 용액을 조제 (의 RNase) 억제제 추출 키트와 함께 공급 된 용출 버퍼 400 단위 / ml의 최종 농도. <ol><li> 컬럼으로의 RNase 억제제 용출 완충액 50 μl를 배치하여 스핀 컬럼 바인딩에서 용출 된 핵산 RNA. 1 분 동안 기다린 후 실온에서 1 분 동안 6,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 단계를 반복 3.4.1 다음 제거하고 열을 버린다. </li></ol></li><li> 단계 3.4.2에서 RNA 추출물의 분취 량을 준비합니다. (6) 표준 곡선 작업 주식의 분취 적어도 15 μL를 각각 포함하는 각 표준 곡선의 희석을 준비합니다. 적어도 포함하는 모든 다른 RNA 샘플 4 분취 준비22 μL 각. 이들은 4 시간 이내에 역전사에 의해 처리 될 수있는 경우에 4 ° C에서 각각의 시료와 표준 곡선 분취 컨트롤 중 하나를 저장; 그렇지 않으면, 또는 -70 ℃ 이하 모든 분취를 저장합니다. </li></ol> 4. 역전사 (RT) <ol><li> 열 번 같음 (마이크로 리터 단위) 존재 올리고 뉴클레오티드 nanomoles (nmol의) 개수를 양을 사용하여 각 바이알 PCR 등급 물의 부피를 첨가하여 표 1에 나열된 각 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 100 μM 스톡 용액을 제조 유리 병 라벨에 또는 예를 들어 제조업체의 사양서 (에서와 같이 바이알 (,) 363 μL에서 36.3 nmol의 포함하는 프라이머를 재현 탁. 용해 섞는다. <ol><li> 솔루션을 작업 10 μm의를 준비하는 PCR 등급 물 100 μm의 해결책 1:10 희석. </li></ol></li><li> 2. 피펫을 표 가이드를 사용하여 클린 룸에서 RT Maste의 16.5 μl를 RT 마스터 믹스 1과 2를 준비각 PCR 플레이트 R 믹스 1은 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여. </li><li> 해동, 냉동 경우, 각 필드의 샘플 및 실험실 강화 샘플 매트릭스에서 핵산 추출물 (LFSM, 즉, 시드 물 매트릭스 샘플). <ol><li> RNA 분해 효소 억제제의 400 단위 / ㎖를 함유하는 용출 완충액으로 5 1시 25분 : 각 필드 LFSM 샘플 1 희석. </li><li> 실험실 시약 블랭크 (LRB; 즉, 시약 등급의 물을 사용하여 음의 품질 관리), 성능 평가 (PE, 해동, 냉동되었지만 랩 요새 빈 (즉, 시딩 된 시약 등급의 물을 사용하여 긍정적 인 품질 관리 LFB)를 희석하지 ; 즉, 시드 시약 등급의 물 샘플은 연구 시작에 앞서 실험 성능), 성능 시험 (PT를 평가하는 데, 즉, 연구 기간 동안 실험실 성능을 평가하는 데 사용되는 분석이 알려지지 역가 시드 시약 등급의 물 샘플 ), NA 배치 부정적인 추출 제어, 또는 표준 곡선 세트에서 추출 된 RNA. </li></ol&gt; </li><li> 별도의 PCR 판 우물에 모든 테스트 샘플, 제어 및 표준 곡선에서 RNA의 6.7 μl를 놓고 테스트 샘플과 컨트롤에 대한 세중의 우물을 사용하여 표준 곡선 (RT 플레이트, 예를 들어 그림 S1 참조) 우물을 복제. <ol><li> 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대해 별도의 PCR 판 우물에 용출 버퍼의 6.7 μl를 놓습니다. 첫 번째 샘플에 대한이 모든 네 번째 추가 샘플에 대한 다음 두 가지 이상을 사용하여 RT 접시 당 2-8 NTC를 포함합니다. </li><li> 판 전체에 부정적인 추출 및 NTC 컨트롤을 배포합니다. </li></ol></li><li> 내열 접시 실러와 PCR 플레이트를 밀봉합니다. 5 ~ 10 초 동안 샘플을 혼합 한 후 ≥ 500 XG 간단히 원심 분리기. </li><li> 99 ° C에서 4 분의 판을 품어 후 열 자전거 타는 4 ℃로 급속 냉각. 원심 분리기 다시 ≥ 500 XG 간단히에서. </li><li> 조심스럽게 플레이트 씰을 제거하고 각 웰에 RT 마스터 믹스 2의 16.8 μl를 추가합니다. 괜찮다알 혼합하여 내열성 플레이트 실러 다시 판 및 ≥ 500 X g에서 간단한 원심 분리. </li><li> 4 ° C 유지주기에 의해 다음 열 자전거 타는 사람에 접시를 놓고 99 ° C에서 42 ° C에서 60 분 다음 25 ℃에서 15 분, 5 분을 실행합니다. </li><li> 프로세스를 즉시 또는 qPCR에 (5 단계), 또는 저장 샘플 8 시간 내에서 이하는 -70 ° C 그들은 처리 할 수​​있을 때까지. 4 ° C에서 8 시간 내에 처리 할 수​​있는 저장 샘플. </li></ol> 5. 실시간 정량 PCR (qPCR에) <ol><li> 이전의 모든 테스트 샘플을 실행하기 간염 G 시약의 각 로트의 평균 간염 G 된 CQ 값을 결정합니다. <ol><li> NTC 제어한다 (단계 4.1.1)에서 기술 한 바와 같이 제조하여 10 회 반복을 RT 분석을 실행. (5.5.3 5.2 단계) 아래에 설명 된대로 간염 G qPCR에 분석을 실행합니다. 10 복제의 평균 된 CQ 값을 계산합니다. </li><li> RT 마스터 믹스 1 간염 G 시약의 양 (표 2를 조정), 필요한 경우, 32 대 (25)와 사이의 평균 된 CQ 값을 얻었다. 물의 양을 변화시킴으로써 승강 량을 보상하여 분석 당 16.5 μL에서 RT 마스터 믹스 한 최종 용적을 유지했다. </li><li> 조정 된 수량을 반영하기 위해 5.1.2 및 변경 테이블 2 단계 5.1.1를 반복하여 모든 조정을 확인합니다. </li></ol></li><li> 장내 표 3에서 가이드를 사용하여 클린 룸에서 qPCR에 마스터 믹스를 준비, 간염 표 4 쥐 노로 바이러스 (노로 바이러스의 유전자형의 V)에 대한 노로 바이러스의 유전자형 II, 표 7에 대한 노로 바이러스 유전자형 I, ​​표 6 표 5, 표 8 G. 믹스는 각 마스터 믹스 한 다음 ≥ 500 XG 간단히 원심 분리기. </li><li> 각 qPCR에 분석을 위해 잘 분리 판 당 14 μl를 사용하여 표시 광 반응 판의 해당 우물에 PCR 마스터 믹스를 추가 (그림 S2 </stronG&gt; 그림 (S1)에서 RT 레이아웃에 따라 qPCR에 분석)에 대한 가능한 레이아웃. </li><li> 냉동 경우, 실온에서 단계 4.8에서 RT 판을 녹여. 접시 믹서를 사용하여 혼합 한 후 ≥ 500 XG 간단히 원심 분리기. </li><li> 광 반응 판의 적당한 웰에 해당하는 cDNA 6 μL 분주. ≥ 500 XG 잠깐의 광 반응 플레이트와 원심 분리기에서 샘플을 섞는다. <ol><li> 다른 모든 qPCR에 분석을 실행하기 전에 원액 희석 필드와 LFSM 샘플에 간염 G qPCR에 분석을 실행합니다. 필드 또는이다 LFSM 샘플 &lt;장내 바이러스와 노로 바이러스 qPCR에 분석의 의미 간염 G 된 CQ 값보다 큰 1 된 CQ 값의 가장 낮은 희석을 사용합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 정량적 PCR 열 순환기 소프트웨어를 설정한다. 표준으로 표준 곡선 샘플을 확인하고 각각의 표준 곡선의 희석, 표 9의 게놈 복사 값을 입력합니다. </li><l난&gt; 95 ℃, 60 ℃에서 1 분 15 초로 45 사이클,이어서 95 ° C에서 10 분 동안 정량적 PCR 열 순환기 판을 실행. </li></ol></li><li> 각각의 표준 곡선은 표 10에 주어진 허용 값을 충족하는지 여부를 결정합니다. 예제 보충 자료 섹션 (S3)를 참조하십시오. <ol><li> 수학 식 2를 사용하여 표준 곡선에 대한 전체 표준 편차 (STDDEV)을 계산, <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> Cq와 각 표준 곡선 복제에 대해보고 된 값이고, Cq와는 복제의 각 세트에 대한 평균 값이 #Cq는 총 양의 값 (즉, 미결정 생략) 모두 표준 제어 복제 용 된 CQ 값의 개수, 및 #입니다 성병은 양의 값을 가지고 표준 컨트롤 수있다. </li><li> 정량적 PCR 열 순환기 소프트웨어는 각각의 표준 곡선에 대한 기울기를 산출하지 않는 경우, 수학 식 3을 이용하여 기울기 계산(60); <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> Cq와 사용 된 최고 및 최저 희석 평균값이며 로그 여기서 GC는 표 9에서 사용 된 최고 및 최저 희석을위한 게놈 사본의 로그 값이다. </li><li> 식 4를 사용하여 R 2 값을 계산합니다. <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> Cq와 모든 된 CQ 값의 평균이며 로그 GC 각 복제에 대한 평균 GC 로그 값이다. </li><li> 식 (5)를 사용하여 %의 효율을 계산한다 : <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> 표 10에 명시된 기준 및 각 샘플에 대한 평균 값을 GC 충족 표준 곡선에 기초하여 모든 테스트 샘플에 대한 열 순환기 소프트웨어 GC에 의해 산출 된 값을 기록한다. 의 기준에 맞지 않는 표준 곡선과 어떤 샘플을 다시 실행 <strong&gt; 표 10 또는 부정적인 컨트롤 (LRB, NA 배치 부정적인 추출 제어, 또는 NTC)는 긍정적이다. 다시 실행 중 기준을 충족하지 못하는 거짓 양성 대조군을 가지고있는 샘플을 다시 처리합니다. </li><li> 수학 식 (6) 이용하여 각 시료에 대한 GC 리터당 (GC에 L)을 결정 : <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> GC는 단계 570에서 평균 게놈 카피 수이고, 요소 &#39;199&#39;급 농도 중에 발생하는 부피 감소를위한 총 희석 인자, RNA를 추출하고 RT-qPCR의 단계, DF는 억제 보상 희석 인자 , D는 리터에있는 분석 원래 물 샘플의 볼륨입니다. GC (L)의 계산의 예에 대한 보충 자료 부 S4 참조. </li><li> 단계 (199)에 의해 5.5에서 GC 평균 값을 0.3로 승산 나누어 총 LFB의 GC 및 LRB 샘플을 계산한다. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+enteroviruses+and+hepatitis+A+virus+in+environmental+samples+by+gene+probes+and+polymerase+chain+reaction.">Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction.</a> Proc. Water Qual. Technol. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment,+using+real-time+reverse+transcription-PCR:+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II.">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li><li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus.">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li><li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish.">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li><li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure.">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li><li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay,+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR.">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li><li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples.">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li><li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR.">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li><li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria,+MS2+and+murine+norovirus.">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , (1996).</li><li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR.">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li><li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+of+enteroviruses,+adenoviruses,+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters.">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li><li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters.">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li><li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples.">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li><li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water,+using+Salmonella+as+a+model+organism.">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li><li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt,+humic+acid,+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters.">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

소스 마시는 물의 바이러스 오염의 대규모 국가 연구는 여러 분석 실험실의 사용을 필요로한다. 이러한 조건 하에서 표준 방법은 여러 실험실에서 생성 된 데이터가 비교 될 수 있도록 요구된다. 바이러스 검출을위한 많은 출판 분자 방법,하지만 거의 표준화 된 분자 방법이 있습니다. EPA 방법 1615 구체적으로 RT-qPCR에 의한 물 행렬에 장내 바이러스와 노로 바이러스의 검출을 위해 설계된 표준화 된 방법이다. 표준화 된 분자 방법은 식품에서 바이러스 탐지에 사용할 수있는, 16, 17 (15216-2 CEN / ISO TS 15216-1 및 CEN / ISO TS 2013년 4월 7일) 및 간염의 검출 바이러스와 노로 바이러스 봄에 적용된 물 (16). 모든 표준 방법은 품질 성능 제어 및 기준 상호 최소화하고 내 실험실 변화 인해 실험실 오염 거짓 긍정적 인 데이터를 포함해야합니다. 또한, 전자를 거짓 데이터를 줄이기 위해PA 방법 1,615 처리 한 방법 워크 플로우 동안 작업의 분리를 규정 분자 방법에 대한 EPA의 지침, (18)을 따른다. 그것은 형 간염 G에게 1,19 내부 통제 인한 RT-qPCR에 (15)의 억제제 거짓 부정적인 결과를 최소화하기위한 절차를 포함한다. 이는 모든 필드 데이터의 필드 리터 또​​는 마시는 물 샘플 당 게놈 사본에서 발현되도록 ​​분석 모두 샘플링 물과의 표준화 된 볼륨과 함께 정량 분석​​법을 사용한다. 효율적인 단일 튜브 (원스텝) RT-PCR 분석은 시판되고 있지만, 본 방법은 의도적으로 분리 된 분석법을 사용한다. 이는 각 반응에서 분석 될 수있는 샘플들의 양을 최소화하는 단점이 있지만, 다중 프라이머 세트의 사용에 더 많은 유연성을 제공한다. 프라이머 및 프로브를 사용하고 가능성이 더 프라이머 세트는 그룹 내의 모든 바이러스 변종을 감지하지 않습니다으로 RT-qPCR의 분석에 의해 만 좋은 제한됩니다. 장내 프라이머 세트가 있기 때문에 선택되었다이는 (20, 21)이 장내 바이러스 혈청 형의 다양한 검출 보존 5&#39;- 비 코딩 영역을 표적으로하고, 그것에 의해 검출 된 바이러스는 미처리 한 지하수의 소비에서 건강에 미치는 영향과 관련된다. 두 프라이머 세트는 내가 22, 23을 noroviruses 유전자형의 검출에 사용된다. 첫 번째는 어린 아이들의 건강에 미치는 영향 사이의 강한 상관 관계로 인해 선택 및 바이러스 1 검출되었다. 그들은 균주 (24, 25)의 폭 넓은 다양성을 감지하기 때문에 설정 프라이머 두 번째 유전자형과 유전자형 II noroviruses에 사용되는 프라이머 세트가 선택되었다. 물에서 바이러스 성 RNA를 검출 qPCR에와 RT-qPCR에 절차의 주요 장점에도 불구하고, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 제, 소독제 불 활성화를 포함하여 모두 감염성 및 비 감염성 바이러스 입자는, 이러한 절차에 의해 증폭 될 수있다. Borchardt의 결과는 이것이 미처리 지하수 f를위한 문제의 적은 것을 제안지역 사회에서 유사한 롬 대수층은 소독 지표수 1보다 공부했다. 배양 바이러스 예방 프로그램으로이 문제는 문화 (26, 27)와 함께 PCR을 이용하여 극복 될 수있다. 문제는 또한 핵산 가교제 28 내지 30의 이용을 통해 몇몇 바이러스 해결되었다. 이 후자의 방법은 바이러스 차아 염소산에 의해 불 활성화 및 자외선에 의해 불 활성화에게는 효과적이지 더 효과적입니다. 이들 분자 절차 번째 제한은 통상적으로 분석 할 수있다 농축 샘플의 부피는 배양 과정 6,31 위해 사용 된 것보다 훨씬 더 작다는 것이다. 이 문제는 종종 어느 샘플이 작은 부피에 재현 탁하고, 또는 삼차 시료 농도 단계 6,32,33을 첨가 할 수 있도록 유기 응집에 의한 표준 이차 농도에 대한 폴리에틸렌 글리콜 기반의 절차를 치환하여 취급 . 방법 1615 centrif를 사용ugal 한외 여과는 차의 농도를 제공합니다. 원심 한외 여과 물 및 시료의 모든 바이러스의 양 농도 및 분자 분석의 작은 분자량 억제제의 감소의 결과로 이하의 성분을 제거 30,000 달톤. 물에 존재했던 어떤 바이러스&gt; 10 (5)의 전체 집중 계수에이 차 농축 단계의 결과는 테스트되고. 세 번째 제한은 환경 시료에서 분자 절차의 억제제의 존재이다. 억제제를 제거하기 위해 다양한 방법이 개발되었지만, 어떠한 방식은 필수적 억제의 레벨을 추정하기위한 내부 제어의 활용, 모든 물 행렬 및 바이러스 유형 6,34,35 효과적 없다. 이 방법에 사용 간염 G는 모든 시약 및 반응 억제를 추정하기위한 RT-qPCR의 분석에서 바이러스 RNA의 일정한 레벨을 제공함으로써 이러한 요구를 만족시킨다. 때 T의 최고그 시료를 농축 한 바이러스 농도가 억제제 농도 14,15 이상만큼 희석 될 수 있고, 제거 접근법 억제가 제거되지 억제제. 본원에 기술 된 표준 곡선 절차 주요 장점과 한계를 모두 갖는다. 장점은 시약이 단일 제어가 모든 분석에 사용될 수 있도록, 하나의 시약의 공급 모든 필요한 부품을 사용한다는 것이다. 이 시약은 특히 노로 바이러스 시험 법에 대한 장점이다. 노로 바이러스 입자는 단지 매우 어려운 기준으로 사용하기 위해 바이러스 입자를 얻을 수있다 감염된 개체로부터 얻어 질 수있다. 더 중요한 장점은 RNA 표준 RNA (36)의 정확한 정량을 위해 필수적이다 갖는 것으로는, 하나의 시약의 모든 표적 RNA 바이러스에 대한 RNA 표준을 제공한다는 것이다. 그러나, 바이러스를 정확하게 계량하는 능력은 매트릭스 효과가 고려되지 않는다는 사실에 의해 제한된다. 이것은 그 게놈 사본을 의미합니다숫자 값은 절대 간주 될 수없고 단지 상대적인 관점에서 고려되어야한다. 그것은 표준 곡선 작업입니다 씩 충분한 수의가 (1.2 단계) 완료 연구를 충당하기 위해 준비하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 각각의 250 μL 분취 6 RT 플레이트 충분한 시약을 제공한다. 이 연구는 500 샘플의 분석을 필요로하는 것이 공지되어있는 경우, 12 분취 량의 최소값 (500 샘플 RT 플레이트 당 / 7의 샘플 / RT 분취 량 당 6 판)을 필요로 할 것이다. EPA 방법 1615은 성능 기반 방법입니다. 많은 제조업 자들은 여기에 명시 동등한 시약을 이들 시약만큼 성능 기준을 충족으로 치환 될 수있다. 또한 긍정적 인 RT-qPCR의 제어 역할을 표준 곡선은 성능 문제를 해결 가치이다. 성능으로 인해 RNA의 분해, 시약의 유효 기간, 냉동고의 고장, 장비 교정 및 기술 오류로 거부 할 수 있습니다. 성능 문제가 의심해야그들은 표준 곡선에 대한 성능 규격을 만족하지 않는 경우는 ED 표준 곡선은도 4에 도시 된 것과 다를 경우 나. RT-qPCR의 분석은 매우 강력합니다; 완전한 실패로 인해 RNA 또는 기술적 오류 (예를 들어, 누락 된 시약)의 부적절한 취급에 가능성이있다. 세심 추출 및 리보 뉴 클레아로부터 RNA의 분해를 감소시키는 단계 사이 RT RNA 샘플을 처리에주의해야한다. 지상 및 시약 등급의 물과 지하수에서 쥐 노로 바이러스의 회복에서 소아마비 바이러스의 회복은 EPA 방법 1,615 성능 허용 기준 (표 11)를 만나 다른 33,37,38에 의해보고 된 것과 유사하다. LFB 샘플에서 쥐 노로 바이러스 회복은 소아마비 바이러스보다 훨씬 낮았다과 소아마비 바이러스 별 허용 기준을 충족하지 않을 것입니다. 시약 등급의 물에서 낮은 쥐 노로 바이러스 복구하는 이유는 알려져 있지 않다. 여기에 결과와 유사하게, 카림과 collea에는 동급 수돗물 39에서 4 %의 노로 바이러스의 GI.1에 대한 복구를보고했다. 리 등. 37 뮤린 노로 18 %의 인간의 GII.4 노로 각각 디스크 필터를 사용하여 증류수에 대한 평균 26 % 회수율을보고했다. 리와 동료에게 유사한 조건을 사용하여, 김과 코는 각각 38,이 바이러스를 46 %와 43 %의 회수율을 관찰했다. 기븐스 외. (40)는 해수로부터 인간 노로 바이러스의 GII.4 100 % 회수 주위 수득하지만 김과 코 (38)의 농도와 유사한 또는 쥐 바이러스 상당히 감소 회수율 해수 이상과 증류수로 염의 첨가를 초래한다는 발견 GII.4 복구 약 두 배 감소.

정량 PCR (qPCR에,이 논문에서 사용하는 용어의 정의에 대한 보충 자료 참조) 전사-qPCR에 (RT-qPCR에) 물을 검출하는 환경에서 인간의 장내 바이러스를 정량화 및 음주에 대한 가치있는 도구이며, 특히 이렇게 많은 바이러스에 대한 역 복제 또는 세포 배양 시스템에서 복제하지 저조한. 두 도구는 많은 바이러스 종류는 세계 1-6에 걸쳐 환경 마시는 물에 존재하는 것을 증명하고있다. 그들이 마시는 물에서 발견 된 바이러스가 발병 환자 7-10에 의한 창고 동일 것으로 나타났습니다로 질병 발생을 조사하는 동안 증폭 된 유전자 단편의 염기 서열과 결합 된 이들의 사용은 수 인성 바이러스 전송에 대한 증거를 제공하고 있습니다. qPCR에와 RT-qPCR에 모두 유용 공중 보건의 도구입니다. 예를 들어, 미국 환경 보호국 (EPA)에 의해 수행 연구의 데이터는 강한 관계가 될 수 있었다qPCR에 레크리에이션 바다에서 건강에 미치는 영향에 의해 트윈 지표 측정. 그 결과, EPA의 최종 2,012 레크리에이션 수질 기준 오락 해변 (11, 12)를 모니터링하기위한 qPCR의 방법을 포함한다. RT-qPCR에 1로 측정 Borchardt와 동료들은 또한 지하수에서 처리되지 않은 지하수 및 바이러스를 사용하여 지역 사회에서 급성 위장염 사이에 강한 관계를 발견했다. 이 논문의 목적은 EPA 방법 1615 13, 14의 분자 분석 구성 요소를 설명하는 것입니다. 이 분석은 전기 양성 필터를 통해 장내 바이러스와 전달 된 환경이나 식수의 원래 볼륨에 따라 리터당 노로 바이러스 게놈 사본 (GC)의 정량적 추정치를 제공하기 위해 RT-qPCR에 사용합니다. 분자 절차의 개요는 표준 곡선을 준비 1. 프로토콜 부분을 그림 1 세부 절차를 나타낸다. 이 기준은 RN이 포함 된 시약에서 준비모든 프라이머 / 프로브 세트의 표적 서열의 카피. 제 2 차 농도 절차를 설명합니다. 섹션 3은 농축 및 제어 샘플로부터 RNA를 추출하기위한 절차를 제공한다. 각각의 시료에서 RNA를 역 세중 분석 및 주요 전사 (4 절)에 임의의 프라이머를 사용하여 전사한다. (도 2 제 5 항) 각 역전사 반응에서 cDNA를 qPCR에 의해 중으로 분석 다섯 별도의 바이러스 별 분석으로 분할된다. 분석은 여러 엔테로 바이러스 및 noroviruses 및 RT-qPCR에 15 저해되어 시료를 식별 간염 G RNA를 함유하는 시약을 검출하도록 설계 과학 문헌 (표 1)에서의 프라이머 및 프로브를 사용한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#176;C cool brick</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BRIK-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N8080130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td>Must be a manual defrost freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70 &#176;C or colder freezer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MBF700LSAO-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA EPA-1615</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Used for quantifying the RT-qPCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA Hepatitis G virus</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>42024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Steris</td>
			<td>Amsco Lab Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>NuAir Laboratory Equipment Supply</td>
			<td>Labgard 437 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10856</td>
			<td>Crystalline grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026956</td>
			<td>Carrier RNA dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19073</td>
			<td>Extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier RNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Use carrier RNA supplied with Buffer AVL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-23 or 05-562-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotors</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339080, 336380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool safe box</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CSF-BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 Probes Master kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>4707494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td>Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcide III</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>99R-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSA5001</td>
			<td>Heat resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;F&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSA1001</td>
			<td>Freezer resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-plate spinner</td>
			<td>Labnet International</td>
			<td>MPS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical reaction plate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR nucleotide mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3315932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>D9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>MicroPlate Genie</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-381-27E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>367501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515 or N2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II or III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18064-022 or 18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-058-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator units</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>VS2022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. part iii. virus detection by rt-qpcr

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K 조회수.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

비디오: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

연구

환경과학

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

우라늄에서 구리 산화물 나노 입자에 의한 미량 원소의 제거<em&gt; 현장에서</em&gt; 복구 블리드 물과 세포 생존에 미치는 영향

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, 개선 INEX 방법에 대한<em&gt; 현장에서</em&gt; 미립자의 측정 및 용존 화합물은 액티브 서스펜션 피더에 의해 처리

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

소형 인 결정 방법을 사용 하 여 세분화 된 제 2 철 수산화에 Phosphonates의 흡착을 결정 하기 위한 최적화 된 절차

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15개의질소 분석을 위한 마이크로플롯 설계 및 식물 및 토양 샘플 준비

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

토양에서 미립자 유기물을 제거하는 정전기 방법

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

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