This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1.イオン選択自己参照微小電極作製<ol><li>イオン選択性微小電極の作製<ol><li>熱は微小電極プラーを使用してフィラメント（1.5ミリメートル外径、1.12ミリメートル内径）を使用せずに薄い壁ホウケイ酸毛細血管を引き出します。 注：これは、先端に直径3-4ミクロンを提供します。小さいヒントは、電子ノイズの微小電極受けやすく、また、イオン濃度の変化に遅く応答と関連する、より高い抵抗性を有します。有用な情報は、Smith らによって発表された論文に記載されています。26。 </li><li>親油性イオノフォアカクテルの保持を補助するための内側表面を疎水性にするために電極をSilanize。それらを乾燥させるために&gt; 100℃のオーブンで金属ラックおよび熱O / Nで微小電極を配置します。ラックは、直径2mmの孔を有する金属板を介して方法の一部を掘削します。 250ミリリットルgの上向きの穴先端に電極を配置しますその上小娘ビーカー。 </li><li>午前中は、オーブンをオフにして、絶縁手袋を着用し、慎重に所定の位置に電極を、ビーカーの金属ラックを削除します。熱を保持するためにオーブンのドアを閉じます。 </li><li>ラテックスまたはニトリル手袋、白衣と目の保護具を着用します。プラスチック製パスツールピペットで、私は、各電極の基部にシラン化溶液の液滴を配置（場所にビーカーを保つ、ピペットアクセスのための注ぎリップを使用します）。シラン化ソリューションは、ホットプレートで気化して、電極の内部をsilanizesれます。この段階での化学抽出ヒュームフードを使用してください。数時間は残りのシラン化液が蒸発することを可能にするために高温のオーブンでラック/ビーカー/電極を裏面に配置します。 注意：安全のため、背面にオーブンの電源を入れないでください。それは有害で可燃性蒸気を含んでいてもよいように、それがオンにされてはならない示すオーブンのラベルを配置します。 </li><li>冷却後、微小電極の保存瓶INSIに微小電極を保存乾燥剤400gでガラスデシケーターをデ。微小電極は、何週間もこのようにして保存することができます。 注意：代替のシラン化方法は、Smith らに記載されている26。 </li><li>測定されるべきイオンの100mMの（ 表1及び図1Bを参照）を含む溶液の50〜100μlの微小電極（約1cmの長さ）をバックフィル。細かいフィラメントにブンゼンバーナーに引っ張ら使い捨てのプラスチック製パスツールピペットの熱を使用してください。閉塞を防止するために、その後のdH 2 Oでピペットを洗浄します。 代替的に、外部溶液27中のイオンの濃度に一致するように埋め戻し液のイオン濃度を調整注：。 </li><li>気泡が存在しないことを保証するために、解剖顕微鏡下で微小電極を観察します。 <ol><li>垂直方向に電極を保持しながら気泡が指の爪で軽く微小電極存在タップしている場合（先端を下に）および/または泡をプッシュ針を交換するシリコーンチューブで修飾された注射器を使用して、背圧を適用することにより、先端をね。 </li></ol></li><li>イオン固有のイオノフォアカクテルの15〜20 NL（30〜50ミクロンの長さ）で微小電極をヒントフィル（ 表1参照）。顕微鏡スライドの短辺にイオノフォアカクテルの小液滴を配置します。解剖顕微鏡下で微小電極の先端部を観察し、微小電極の先端が約半分しか秒間イオノフォアカクテルに接触するまで、顕微鏡スライドに向かって移動します。毛細管圧力によって微小電極にイオノフォアカクテルを描画します。 注意：これは、電子干渉（ノイズ）にそれが影響を受けやすくすることができ、プローブの電気抵抗が増加し、また、応答時間を遅くするようイオノフォアカクテルの長い列を避けてください。 </li><li>金1ミリメートルオスコネクタとのAgCl（銀+）線（ 図1B）でストレート微小電極ホルダーに微小電極をマウントします。&lt;/ LI&gt; <li> 3次元コンピュータ制御の電子マイクロポジショナー（ 図1A）に搭載されたヘッドステージに微小電極ホルダーを取り付けます。 </li><li>サンプルを測定するための適切なソリューションを測定する微小電極の先端を配置し（生理食塩水、培地など ）微小電極が時間または2つ、あるいは一晩安定化することを可能にします。 </li></ol></li><li>参照電極の作製<ol><li>参照電極（ 図1C）は 、上記と同様の毛細血管です。 5cmの長さにダイヤモンド鉛筆でキャピラリをカットし、ブンゼン火炎中1-2秒間の各端部での火災は、研磨。 </li><li> 2％アガロースでのNaClの3M溶液、CH 3 CO 2 K（酢酸カリウム）またはKClを〜200μlでこれらの電極を埋めます。イオンに応じてソリューションを測定することを選択します（参照電極は、測定されるイオンを含むべきではありません。 表1を参照）。ミックスアガロースとほぼ電子レンジで沸騰するまで溶液および熱。アガロースを溶解するために撹拌し（溶液は透明になります）。 </li><li>プラスチックパスツールピペットに参照電極を取り付け、キャピラリー内に高温の溶液を引き出します。 </li><li>使用前に密封されたチューブ内でこの3 M溶液に冷3 MのNaCl、CH 3 CO 2 KまたはKCl溶液とストアに電極をドロップします。気泡を有する任意の参照電極を捨てます。 </li><li>ストレート微小電極ホルダーに参照電極内部（事前に充填された3 M溶液を用いて）のAgCl（銀+）でペレットと金2ミリメートルオスコネクタ（ 図1C）をマウントし、手動マイクロポジショナーに電極とホルダーを取り付けます磁気スタンドに取り付けられました。 </li></ol></li></ol> 2.イオン選択自己参照微小電極のキャリブレーション<ol><li>参照溶液のように、目的のイオンを含むキャリブレーション溶液を調製します。 表1を参照してください</strオング&gt;。ブラケット溶液中での濃度は、試料（ 例えば 、培地、生理食塩水）です。つまり、1つの較正溶液は、測定溶液中のイオンのより低い濃度を含有し、そして高い方なければならないれます。 <ol><li>例えば、K + 1mMのが含まれている生理食塩水を使用しています。この濃度をブラケットに、連続希釈で10、1および0.1mMの濃度になるように脱イオン水中でのKCl粉末を溶解します。これらのキャリブレーションソリューションを使用しています。また、これらの解決策のうちの少なくとも2つを使用します。 </li></ol></li><li>それぞれの較正溶液中のイオン選択性微小電極および参照電極を浸し、電圧値が（ 表1参照）は、専用のソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に、1〜3分間安定化させ。 </li><li>ソフトウェアとしてtxtファイルとしてデータ（アンプ出力）を保存し、スプレッドシートファイルにデータをコピーします。の対数に対して微小出力（MV）をプロット分子イオン濃度（ 図2A）。 </li><li>線形回帰を適用し、ネルンストの傾き、切片およびR 2の値を計算します。ネルンスト傾斜は、二価イオンの価イオンおよび29±11 mVの/十年のための58±11 mVの/ディケード（アニオンのためにそれが否定された陽イオンのために、ネルンスト傾斜は、正である）である場合に微小電極を受け入れます。さらに、良好な微小電極は強い線形相関（; 図2B R 2&gt; 0.9）を持っている必要があります。 注：ここで使用される増幅器のMV出力はMVが10倍のゲインで読書ができます。値は、10のファクタで分割する必要があります。 </li><li>実際のイオン濃度（ 図2B）に微小電極の生のMV出力を変換するために、線形回帰式を使用してください。 </li></ol>イオン選択微小電極法の3検証<ol><li>人工光源の準備<ol><li>人工光源の毛細血管は同じ毛細血管です上記。熱は、ステップ1.1.1のように微小電極プラーを使用してキャピラリを引き出します。 </li><li>塩化ナトリウム、塩化カリウムの1 M溶液200μl、CaCl 2を 2 H 2 OまたはpH 4緩衝液を用いて、これらのキャピラリーを埋め戻します。選択イオンに応じて人工光源溶液（ 表1参照）を測定します。 注：別の方法として、大きな先端径（〜20ミクロン）で電極を引き出し、同じソリューションを、先端充填が、百分の0.5から1アガロースを含む（アガロース溶液のいずれかの大きな流れを防ぐことができます）。 </li><li>マイクロマニピュレータに人工光源キャピラリをマウントし、試料中のイオンの流れを測定するために使用される溶液中に浸します。勾配の安定化を可能にするために、1時間に30分間、溶液中の人工光源のままにしておきます。 </li></ol></li><li>イオン選択性微小電極の検証<ol><li> measuするために使用される溶液中の人工光源のキャピラリーから約1センチメートル離れたイオン選択性微小電極を浸しサンプルのイオンのフラックス再と以前のように参照電極と回路を閉じます。電圧値が1〜2分間の専用ソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に1~3分間安定させ。この値は、バッファ値に対応する（文献でも参照、背景やブランク値と呼びます）。 </li><li>人工光源から約5μmにイオン選択性微小電極を移動して、電圧値が1〜2分間のソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に1〜3分間安定化させます。 </li><li>人工光源の毛細管から離れて10、20、40、80、160、320、640と1280ミクロンでイオン選択微小電極を配置することにより、上記の手順を繰り返します。 </li><li> txtファイルなどのデータを抽出し、スプレッドシートファイルに値をコピーします。 </li></ol></li><li>校正値と同じ方法でmVの値に対応するイオン濃度を計算します。値をプロットします。 いいえTE：イオンフラックスが存在する場合、微小電極は、二つの位置（図3B）との間のイオン濃度の差を検出します。人工光源は、溶液よりも測定した種の多くのイオンが含まれている場合は、濃度が正しく、この場合には（イオン束の方向を検出するために、イオン選択微小電極の能力を検証し、遠くよりもソースに高い近くなければなりません流出;人工シンクのために、培地を測定するよりも低い特定のイオン濃度と、それが流入する必要があります）。 <ol><li> cは 、溶液中のイオン濃度（モルcm -3程度）であり、μはイオン移動度である（モルセンチN -1秒-1）J = Cμ（DC / DX）：拡散のフィックの法則を用いてイオンフラックスを計算します、およびDC距離dx（CM）（ 図2C）上の濃度差です。イオンフラックスデータは、通常、 ピコモルcm -2でSに提示されています-1またはナノモルcm -2で秒-1。 注：Smithら26によって記載されたイオンフラックス計算する別の方法を用いることができます。主な違いは、代わりに、イオン移動度の拡散係数を使用し、サンプルなしで生理食塩水溶液中のイオン流束の測定値から算出し、バックグラウンドイオンフラックス（また、電圧ドリフト又は補正係数）の減算を含みます。 </li><li>ソース（ 図2D）からの距離に対する各ステップのイオンフラックスの平均値をプロットします。源から離れた場所に移動すると、イオンフラックスの異なる大きさを検知するイオン選択性微小電極の能力を検証するフラックス値の指数関数的減少を観察します。 </li><li>大きな信号対nでの正しい方向と大きさの測定値を検証するために記録されることを意図し、各特定のイオンに対して一度人工光源の検証を行いオワーズ比。 注：サンプルを含まない緩衝液のイオンフラックス測定は、バックグラウンドレベルやノイズを示しています。典型的には、バッファは、測定変数の方向が表示され、非常に小さな束につながるイオン濃度の明確な変動を示さありません。 </li></ol></li></ol>商工会議所の測定4.準備注：実験の前に、サンプルを測定することが考慮し、サンプルがどのように実装され、微小電極の測定のために固定化します。 <ol><li> アフリカツメガエル卵母細胞のための測定は800ミクロンのナイロンメッシュ（nitexメッシュ）の1cm角にカットし、プラスチックシャーレ（ 図1E）にそれを接着ツメガエル 。 </li></ol> 5.イオンフラックス測定<ol><li>較正溶液の場合と同様に試料の測定を行うために使用される緩衝液中に存在するイオン濃度を測定する。X.ツメガエルの卵母細胞は、マークの改変リンガー（MMR）が必要です。 D（MM）の最終濃度に達するまでの脱イオン水にissolveのNaCl、KClを、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびHEPES：100のNaCl、2のKCl、2塩化カルシウム、塩化マグネシウム1及び5 HEPES。 NaOHを用いて7.5に緩衝液のpHを調整します。 </li><li>測定チャンバー内に試料を置き、微小電極（ 図3A）の近くに位置を定義するためにマイクロポジショナーを使用して（約10μm離れた）サンプルに近いイオン選択微小電極をもたらします。 </li><li>近くに位置し、専用ソフトウェアを使用して離れたサンプル（遠い）からの位置の間の微小電極の低周波数（0.3ヘルツ）エクスカーション（100μm）を起動します。微小電極の移動は、試料の表面に垂直であることを確認してください。 注：微小電極の遠足は、ソフトウェア上で設定することができます。大きな遠足は勾配がサンプリング間隔を長くし、時間分解能が低下している間、測定中の小束を容易に検出することができ読み取る増加します。見ます<st栄&gt;例えば図3A。 </li><li>ソフトウェアを使用して録画を開始します。微小電極は、それぞれの位置で一時停止し、mV単位電位がコンピューターに記録されています。信号の安定化を可能にする、少なくとも2分間の測定値を取得します。短い時間経過実験では、全体の時間のコースに興味のある位置での電位の変化を記録します。 </li><li> txtファイルなどのデータを抽出し、スプレッドシートファイルに値をコピーします。 </li><li>校正値と同じ方法でmVの値に対応するイオン濃度を計算します。値をプロットします。 注意：イオンフラックスが存在する場合、微小電極は、二つの位置（ 図3B）との間のイオン濃度の差を検出します。 </li><li> （ステップ3.3.1）以前のように、拡散のフィックの法則を用いたイオンフラックスを計算します。 </li><li>新しいサンプルを測定する前に、バッファの測定を繰り返し、すべての新しいのためのフラックス測定と計算の手順を繰り返しますサンプル。 </li></ol> 6.統計分析とデータ表示<ol><li>および/ ​​または混合効果28とANCOVAモデルを用いた制御条件でイオンフラックスの時間の位置の独立した効果をテストします。 注：共分散分析（ANCOVA）をカテゴリと連続の両方の対策が独立変数として使用することができるようにすることで、定期的なANOVAと回帰をミックス一般線形モデルです。また、個々のおよび最終的なネストされた効果につき反復測定によって誘発される相関誤差の存在下で、混合効果モデルは、両方の固定およびランダム効果の正確な推定値をモデル化するために使用されます。 </li><li>複数のテスト28ボンフェローニ補正を持つグループレベル間のスチューデントt検定を使用して対比較を計算します。 </li><li>位置や時間に応じてイオンフラックス測定を要約する箱ひげ図を生成します。記載ペアワイズスチューデントの tからp値を含みます（ 図3D）は、上記と以下のようにp値の有意水準を示す：*：P &lt;0.05; **：P &lt;0.01; ***：P &lt;0.001 29 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

in vivoでの細胞外イオンフラックスの測定に成功するために最も重要な手順は次のとおりです。ノイズの低減、イオン選択微小電極と参照電極の正確な製造、およびサンプルと両電極の配置。 ノイズを最小にするために、記録システムは、好ましくは、接地された金属張り（防振）テーブルでアース（接地）ファラデーケージにする必要があります。また、顕微鏡...

<html>全ての動物細胞は、外部環境から細胞質を分離する脂質二重膜で囲まれています。セルは、イオン1の能動輸送により、内部の電気膜電位、負を維持します。膜電位は、細胞は、膜2に、様々な分子デバイスを動作させるために利用することができる保存されたエネルギー源です。ニューロンおよび他の興奮性細胞は、大きな膜電位を有します。ナトリウムチャネルの迅速な開口部は膜電位（脱分極）の崩壊と神経2の長さ方向に沿って搬送される活動電位を生成します。別にこれらの急速な電気的変化から、多くの組織や器官が発生し、重大な長期的な電位を維持します。例えば、皮膚、角膜上皮が発生し、イオンの方向励起（主にナトリウムと塩化物）3によって経上皮電位および細胞外の電流を維持します。 10トン&quot;&gt;内因性細胞外電流の測定は微小電極システム7-10は、細胞膜および上皮細胞層の電気的パラメータの測定を可能に用いて振動プローブ4-6および膜または経上皮電位の測定値を使用している間、彼らはない与えます関与するイオン種の指標。 選択的イオノフォアと微小電極は、溶液中の特定のイオン濃度を測定することができます。イオン勾配またはフラックスは異なる位置に2つ以上の電極を用いて測定することができます。しかし、各プローブの固有の電圧ドリフトは、不正確な測定または存在しなかった勾配であっ​​ても検出を引き起こし、異なるであろう。それは2点間の低周波数で移動することにより、「自己参照」モードで使用される単一の電極は、この問題を解決します。ここで、イオンフラックスは、（ 図3B参照 ）は、比較的ゆっくりと安定した信号ドリフトの背景を見ることができます。 </P&gt; イオン感受性測定システムは、組織または単一細胞に近いイオンの小さな細胞外フラックスを検出するために、イオン選択自己参照微小電極を使用しています。システムは、微小電極からの信号を処理し、マイクロステッピングモータとドライバは、微小電極の動きを制御するための増幅器で構成されています。回路を閉じるイオン選択微小電極および参照電極をヘッドステージ前置増幅器（ 図1A）を介して増幅器に接続されています。コンピュータソフトウェアは、微小運動（周波数、距離）のパラメータを決定し、また、増幅器の出力を記録します。ステッピングモータは、三次元マイクロポジショナーを介して微小電極の移動を制御します。イオン選択性微小電極を振動、低周波は、まず、特定のカルシウム流11を測定するために1990年に開発されました。同様に、カルシウムなど、商業的にアクセス可能なイオノフォアカクテルは今MICRを作るために利用可能ですナトリウム、塩化物、カリウム、水素、マグネシウム、硝酸、アンモニウム、フッ化リチウム、水銀に敏感oelectrodes。 基本的には、自己参照イオン選択微小電極技術は、電圧計で測定することができる電位に溶液中に溶解し、特定のイオンの活性を変換します。イオノフォアカクテルは、イオン交換特性を有する非混和性液体（有機親油性）相です。イオノフォアは、選択的可逆的に（結合する）特定のイオンと錯体を形成し、微小電極（電解液）に含まれる水溶液と微小電極が浸漬させた水溶液（ 図1D）との間でそれらを転送します。このイオンの移動は、電気化学的平衡をもたらし、微小電極と参照電極との間の電位の変動を電圧計により測定されます。電圧は、ネルンストeによる特定のイオン活性の対数に比例していますイオン濃度（ 図2AおよびB）の計算を可能にするquation。 現在、いくつかのシステムでは、同様の概念や原理を用いてイオン流の測定を可能にします。例えば、走査型イオン選択電極法（SIET）12,13またはニューマンとShabala 14-16によって開発された微小電極のイオンフラックスの推定（MIFE）技術は市販されており、広く特定のイオンを決定するために、研究コミュニティによって使用されます動物、植物および単一生細胞モデルの多様にわたって細胞膜および組織で生じる磁束。マウスの骨におけるイオン選択性微小植物の根17を横切って、水素、カリウムおよびカルシウムフラックスを測定するために使用されている、塩化フラックスラット大脳動脈18と花粉管19、水素流量スケート網膜細胞20、カルシウムフラックス21、様々なイオン菌糸22であり、rでフラックス単一細胞の創傷中に角膜23、および最終的にカルシウム流で12,24治癒 。また、イオン選択自己参照微小電極25の詳細については、以下のレビューを参照してください。 次の記事では、準備し、単一細胞レベルでのイオン選択自己参照微小電極技術を用いて、内因性の細胞外イオンフラックスの測定を実行する方法を詳細に説明しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

動物、植物、単一細胞からの細胞は、外部から細胞質を分離し、細胞膜と呼ばれるバリアによって囲まれています。例えば、上皮細胞層としても外​​側または多細胞生物の異なる区画の内部を分離するバリアを形成します。これらの障害の重要な特徴は、細胞膜または細胞膜を横切るイオンの微分分布です。二つの特性は、この配布を許可する：1）膜および上皮は、特定のイオンを選択的に透過性を表示します。 2）イオンは、細胞膜および細胞膜を横切るポンプを介して輸送されます。これらの特性は、組織の生理機能の維持に重要な役割を果たし、修理の際に、損傷後の手がかりを信号として機能し、または病理学的条件の下で。イオン選択自己参照微小電極は、単一の細胞および組織レベルでのカルシウム、カリウムやナトリウムなどのイオンの特定のフラックスの測定を可能にします。微小電極は、イオノフォアのカクテルが含まれています特定のイオンを選択的に透過。内部充填溶液は、目的のイオンの設定濃度が含まれています。微小電極の電位はイオンの外濃度によって決定されます。イオン濃度が変化するように、微小電極の電位がイオン活性の対数の関数として変化します。 （これはイオン束に濃度勾配で、すなわち ）イオンのソースまたはシンクの近くに前後に移動すると微小電極電位はイオンフラックス/勾配に比例した振幅で変動します。増幅器は、微小信号を増幅し、出力は、コンピュータに記録されます。イオン束は、その後、特定のイオン移動度として、電極電位変動、微小電極の偏位、および他のパラメータを使用して拡散フィックの法則によって計算することができます。本稿では、イオン選択自己参照微小電極のANを用いて細胞外のイオンフラックスを測定するための方法論を詳細に説明しますいくつかの代表的な結果を提示するdは。

我々は以前、カルシウム流入は、単一のセルが24を負傷した後に表示されることが示されています。したがって、我々は、他のイオン束は、単一の細胞損傷の際に発生するかどうか尋ねました。我々は、Xを使用しました卵母細胞をアフリカツメガエル 、単一のセルのための十分に確立されたモデルは30〜34と電気生理学的記録24,35-39創傷治癒します</su...

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Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.9K ビュー.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

周波数成分を用いたイオンチャネルのIV曲線の要約

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...