著者は、撮影し、編集したビデオで彼の援助のエリック Fishback (デ モイン大学, デモイン、アイオワ州、米国) を感謝したいです。安定表現 NHE3 wt や NHE3 YRK PS120 線維芽細胞のような細胞は、博士マーク Donowitz (ジョンズ ・ ホプキンス大学医学、ボルティモア、MD、米国) によって提供された親切。

注: 2 つのアンプ、クランプ、全体セル構成と高 impendence アンプ (細胞を維持するためにパッチ クランプ アンプ パッチと組み合わせて自己参照伊勢で electroneutral 運送者の活動を記録するために必要です電位計)、伊勢経由で輸送活動を記録する (材料の表を参照してください)。パッチ クランプ アンプは、集録ボードの端子に直接接続されます。電位計を利用してフィルター処理し、信号を増幅する差動増幅器に接続されます。差動増幅器は、集録ボードの端子に接続されます。Capmeter、セル容量を監視するパッチ クランプ ソフトウェアは、以前の研究20で使用されています (材料の表を参照してください)。録音室と灌流ソリューションが 37 ° C で維持されます。
1. 天気予報のピペットの準備
<ol><li>ピペット ホウケイ酸塩のガラス管から 1.2 mm の外径を引く (材料の表を参照してください)2ピペットの引き手を使用して。</li>
	<li>使用して、マイクロフォージ ピペットを磨きます。ピペット先端の直径は、2-3 μ m にする必要があります。</li>
	<li>(材料の表を参照) を向いてピペット チップ ピペット用の瓶ホルダーで、ピペットを配置します。 注意: 換気の化学発煙のフード 1.4-1.6 の手順に従います。</li>
	<li>ビス (ジメチルアミノ) ジメチル シランと四塩化炭素の 10 滴 1 滴 (~ 150 μ L) で構成される製造混合物のミックス (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>瓶にケイの混合物を注ぎ、ふたをしっかり締めて。</li>
	<li>混合物が完全に蒸発するまでは、24-48 時間室温での化学発煙のフード製造混合物と jar を孵化させなさい。</li>
	<li>バックフィル適切なイオン選択性樹脂を用いるピペット約 2-4 mm の列を作成します。 注: 水素イオノフォア私カクテル B は、NHE アクティビティの使用記録をすることができます (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>先端部にイオン選択性樹脂を配布するピペットの先端をタップし、ダウン ピペット ピペット チップの瓶ホルダー内で縦方向に配置します。</li>
	<li>Checkunder 樹脂カクテルがヒントの最後に達したこと解剖顕微鏡。必要な場合は、最後に樹脂をプッシュする肯定的な圧力を適用します。</li>
	<li>適切なソリューションとバックフィル半分ピペット (~ 100 μ L)。イオノフォアを使用している場合ここでは、pH 7.0 で 100 mM KCl と 10 mM HEPES を使用私カクテル b.</li>
	<li>電位計に ISE を接続し、記録用風呂のソリューションに、伊勢の先端を配置します。電位計はゼロします。</li>
	<li>試験 H+-バス溶液の pH を変更することで選択的な伊勢の応答。平均 H+-伊勢の選択的な応答は 〜 58 単位 pH の mV。</li>
	<li>伊勢レスポンス校正を定期的に評価します。</li>
</ol>2. パッチク ランプの準備記録用ピペットします。
メモ: 単一チャネル記録21ドナルド ・ Hilgemann によって彼の記事で説明した方法をお勧めします。
<ol><li>ホウケイ酸ガラス管から巨大なパッチ用ピペットを引く (2.0 mmOD/1.5 mm ID) ピペット引き手2,22,23。</li>
	<li>広いピペット チップ (10-22 μ m)23をするために逆にされた顕微鏡のステージ上を使用して、マイクロフォージ マウント。ビーズを溶かす (〜 0.5 mL)、マイクロフォージの厚い白金線に軟質のガラス。 注: 比較的厚い白金細線が必要 (~0.5 mm) 巨大なパッチ ピペットを作製します。</li>
	<li>軟質ガラス ビーズに近いパッチ ピペットを置き、先端が後退を開始するまでの完全な熱を適用します。白金細線加熱配属されていますに向かって少し移動します。</li>
	<li>熱の電源を切り、軟化したガラス ビーズにピペット チップをプッシュします。冷却のワイヤー工具はリトラクトし、ピペット チップを破る。</li>
	<li>ピペット チップを滑らかに必要な径のピペット チップを作成し熱を再適用します。先端の直径が依存するセルのサイズ パッチ (本研究では 8-10 μ m)。</li>
</ol>3. 細胞の調製
<ol><li>ウォーム アップ リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) Ca2 + Mg2 +、トリプシン EDTA 溶液、37 ° C で中長期成長なし</li>
	<li>洗浄のセル PBS で 2 回。35 mm 直径細胞培養プレートに 1 mL のバッファーを使用します。</li>
	<li>トリプシンの 0.5 mL を 35 mm 直径細胞培養プレートのセルに追加します。 注: セル起動するとラウンド アップ、セルをアタッチ解除するプレートを振るとき。</li>
	<li>10% 牛胎児血清を添加した完全な成長培地 5 mL (35 mm 径細胞培養プレートの量) を追加することによってトリプシンのアクションを停止します。 注: トリプシンの反応時間は、細胞型依存。</li>
	<li>塊の形成を防ぐためにロッキング シェーカーにセルを配置します。</li>
	<li>Trypsinization 後 2 h までのセルを使用します。 注: セルの行によって時間が異なります。</li>
</ol>4. ピペット内灌流システムの準備
<ol><li>石英管の適切なサイズをカット (150 μ m OD/75 μ m ID) 内ピペット灌流線を準備します。</li>
	<li>200 μ L ピペット チップ石英管の片側に挿入します。先端に石英管を接着し、鋭いかみそりの刃と先端の端をカットします。</li>
	<li>ピペット内灌流液の貯留層となるシリコン チューブの小片に灌流線 (石英チューブ先端に接着) を接続します。</li>
	<li>肯定的な圧力を作成する注射器にシリコン チューブを接続します。</li>
	<li>挿入側灌流のピペット ホルダーのポリエチレン管を通って石英チューブのポート (材料の表を参照)。</li>
	<li>ピペット ソリューションと灌流線を評価します。</li>
</ol>5. 溶液の調製
<ol><li>NHE (115 mM カリウム アスパラギン酸 (KAsp) 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、MgCl20.5 mM、10 mM Mg-ATP、HEPES が 12.5 mM、12.5 mM パイプ、12.5 mM モップ 12.5 mM MES の pH 6.0 アスパラギン酸で調整) を記録するため重くバッファー ピペット ソリューションを準備します。 注: は、ストック ピペット ソリューションとフィルターを準備します。録音の前に Mg ATP を追加します。</li>
	<li>(140 mM の NaCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、および 0.1 mM トリス塩酸 pH 8.2) するたびに新鮮なバス ソリューションを準備します。</li>
</ol>6. 輸送活動の記録
<ol><li>トランスポーターの活動は温度依存するので、録音室と 37 ° C ですべてのソリューションを維持します。</li>
	<li>記録室にセルを配置します。彼らはチャンバーの下部にドロップしますが、チャンバーに接続させていない場合まで待ちます。</li>
	<li>適切なセルを選択します。眼のマイクロメータとセルの直径を測定します。同じような直径を持つセルを選択します。 注: 一般的に、大細胞がありより細胞表面おそらくよりトランスポーター従ってより多くのトランスポーター活性を有するも、その膜に発現します。ただし、トランスポーターの活性によって異なります特定のトランスポーターと検討中細胞型、これは必ずしも正しくではないです。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターにイオン選択性電極のピペットをマウント、バックフィル細胞内のソリューションでは、パッチ用ピペット ピペット2のヒントを解決策に到達を確認してください。 注: それはピペットの先端で気泡を除去するためにいくつかの穏やかなタップを必要があります。</li>
	<li>設定2,22,23電気生理学の頭の段階にパッチ用ピペットをマウントします。 これにより、強いシールの形成に適しているピペットの入口角度としてメモ: 水平軸に約 45 度の角度でヘッドのステージを保つために重要です。</li>
	<li>小さく肯定的な圧力を適用 (~ 5 cm H2O) パッチ ピペット先端をブロックする可能性を削減し、お風呂のソリューションに配置します。</li>
	<li>パッチ クランプ ピペットの先端がセルの近くに移動を停止します。</li>
	<li>ピペットに触れるセル間に肯定的な圧力を緩和し、わずかな否定的な圧力を適用 (~ 5 cm H2O) を取得する、> 1000 パッチで細胞膜上の MΩ (ギガ ω) シール ピペット23。</li>
	<li>伊勢市と同じ焦点面でセルとパッチ ピペットを置き、パッチ ピペット、伊勢への近さ内のセルを移動 (~ 5-10 μ m)2,5が回避する (図 1 a) 伊勢にお問い合わせください。</li>
	<li>潜在的な保有が 0 であることを保証する mV。</li>
	<li>シリーズでは全細胞構成を取得する短い吸引のシールを破裂します。</li>
	<li>伊勢 (またはパッチ クランプ ピペット) 移動ゆっくりと左右または上下トランスポーター (図 1 b) の活動を記録します。</li>
	<li>少なくとも 5-8 ピークを記録 (図 1、A から B に)。</li>
	<li>シールと細胞膜容量 (図 1) の品質を監視する記録中に方形波の摂動を適用します。</li>
	<li>H+フラックスの推定 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) 細胞表面とバルク ソリューション (ΔH+) 無料 H+の濃度の違いから <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> 注:<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg">と<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg">H+は、それぞれ、拡散係数をバッファー BTがバッファーの合計濃度、 KDはバッファーの解離定数、 rはセル半径、および<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg">無料 H+の小さな変化のため連結 H+の濃度の定常状態の変化を決定します。H+は、ソリューションの無料プロトンを示します。先行研究と一致する H+フラックス、フラックスの現在の同等物を計算して電気生理学的磁束の単位に変換されます (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) pA3,5]。</li>
	<li>携帯サイズから計算することができます細胞表面に膜容量陽子のフラックスを正規化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. 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著者はある利益相反を開示します。

トランスポーターの重要な機能、にもかかわらず彼らの活動を研究するメソッドがないと不十分です。1 つの制限は、使用可能なメソッドが実験4細胞内イオン組成の変動を考慮することがなくトランスポーター活性化イオンの動きを測定することです。提案手法により、細胞内外のイオン組成を正確に制御し、細胞内イオン、タンパク質と脂質組成3,</s...

イオンとプラズマ膜における溶質の輸送は細胞のと、それゆえ、生物1の生存に不可欠です。溶質とイオンの選択的輸送は専門にされたチャネルおよび蛋白質の配列によって実現されます。さまざまな病態、薬物治療1のチャネルやトランスポーター蛋白質の潜在的なターゲットをレンダリングしばしばこれらの蛋白質の突然変異の結果します。残念ながら、チャネルやトランスポーターの機能と制御機構の解明は、しばしば制限のアクティビティ2,3、4を研究するのにアプローチで。
具体的には、トランスポーターがサブに分けることが彼らは溶質の輸送中における細胞膜電位を変更するかどうかに応じて 2 つの大規模なグループ: 無k イオン変更 [例えばナトリウム ・ リン酸輸送体共輸送体 2 a (NaPi2a)、ナトリウム カルシウム交換体 (NCX) など]。または非変更 electroneutral イオン運送者 [例えば、ナトリウム プロトン交換 (NHE)、塩化ナトリウム共輸送体、NaPi2c、等です。]。膜側の透過物の蛍光染料2やトランスポーターの両方のクラスの活動は広範囲の放射性同位体の取り込みを使用して検討されています。両方のアプローチは、特定の細胞質のイオンのバルク濃度の変化を測定することによってトランスポーターの活性を推定し、両者適度な感度と時間分解能と細胞内の管理不十分などの制限があります。環境。確かに、多くのトランスポーターの活性は細胞質 (例えばNHE3、NCX)、運ばれたイオン濃度に依存して、これらのイオン濃度の変化が輸送活動2の調節に重要な役割を果たすことが期待,3,5します。 これらの調節のメカニズムの正確な測定は古典的な方法を使用して制限されます。
これらの制限を克服するために、パッチ クランプ方法トランスポーター活性2,6が検討されます。具体的には、クランピング システム パッチ併用自己参照型イオン選択性電極 (ISEs)7,8は最近 electroneutral トランスポーター アクティビティ3,4の測定を許可しています。,5。 天気予報がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。移動し、細胞膜の繰り返しから伊勢、振動のファッションは、電圧差 (μ V) を記録します。電圧の違いは、拡散2,9の Fick の最初の法律を適用する校正法を用いたイオン流束の値に変換できます。天気予報が使用されている間のうち移動イオンのフラックスを検出する細胞、両方の全細胞のパッチ クランプ法またはインサイド アウト構成膜電位および細胞内のイオン組成を制御するために使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質とタンパク質の3、5の細胞内構成の変更ができます。
要約すると、パッチ クランプ法の汎用性は研究する他の方法の輸送活動が行ったことパッチはこれらの他のメソッドの一般的な制限事項を克服するために適切なクランプと比較されます。自己参照を示さなかったし、パッチク ランプ法の組み合わせが厳しく制御された実験環境における electroneutral トランスポーターの活性を測定して小説生物物理・分子を発見するユニークな可能性を提供しています細胞膜の性質は、3,4,5を転送します。このアプローチは、NHE の活動を研究する正常に使用されています。哺乳類 NHE タンパク質ファミリーは、内側の Na+グラデーションを利用した細胞内のプロトン (H+)10,11細胞外ナトリウム (Na+) の electroneutral ネット交換を触媒します。哺乳類で、NHE タンパク質ファミリーには、11 の関連蛋白質 (NHE1 9 および NHA1 2) と精子固有の NHE10,12,13が含まれています。
NHEs (SLC9a 族) 単純な原核生物から高等真核生物にほとんど生物で普遍的に発見され、さまざまな重要な細胞機能10,11で細胞の塩分防御を制御に関与しています。原核生物、酸基盤ホメオスタティス、細胞量を維持し、様々 な特殊な上皮10,12,14,15の塩と水の吸収を調節します。NHEs の重要な生物学的役割とその機能の重要性がいくつかの研究によって決定されています。ただし、いくつかの研究は、方法論の限界4のための哺乳類 NHEs 生物物理・分子特性を検討しました。最近では、自己細胞パッチク中に天気予報を参照するアプリケーションはイオン、タンパク質やリン脂質で3の細胞内濃度の変化によって規制されての NHE アイソ フォームの分子機構を明らかにしました。 4。
具体的には、この原稿の提供されるプロトコル概要方法や勉強活動と NHE アイソ フォーム 3 の規則 (NHE3) Na+、Cl-、HCO3- 、液の吸収の主要なプレーヤーのためのアプローチ、腎と小腸上皮14,16の刷子縁膜。細胞内イノシトールリン脂質 NHE3 活動の感度の違いに新しい洞察力 (phosphatidylinositide 4, 5-ビスリン酸 [PI (4, 5) P2] と phosphatidylinositide 3,4,5 三リン酸 [PI(3,4,5]P3]) が報告されます。チャンネルやトランスポーターなどの細胞輸送蛋白質はイノシトールリン脂質17、によって調整されるし、NHE3 は直接 PI (4, 5) P2 と P3 PI (3,4,5)18をバインドします。現在の文献に基づいて、いずれかのイノシトールリン脂質 NHE35,18,19の生理や病態生理学的規制に関連する可能性があります。我々 の調査結果は、PI (4, 5) P2 の PI (3,4,5) P3 NHE3 活性の調節の別のロールをサポートします。この区別は、全細胞パッチク ランプとの組み合わせで伊勢の技術の適用のため可能だった。この技法は、NHE3 活性の測定中に異なるイノシトールリン脂質の細胞内血流を介してホスホイノシチド携帯電話コンテンツのコントロールもできます。

<table><tbody><tr><td>Patch clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Differential Amplifier (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Software Based on MatLab</td><td>MatLab with acquisition toolbox</td><td></td><td>The capmeter software is recommended</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Temperature Control System</td><td>&amp;nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>In-line heater</td></tr><tr><td>Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Used for ion selective electrodes</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tetrachloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen ionophore I - cocktail B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Tubing</td><td>&amp;nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Used for patch clamp pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Used for intra-pipette perfusion system</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium aspartate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

細胞膜中のイオン輸送は細胞の生存に不可欠な細胞内外のイオン濃度の微調整を保証します。これらの転送機構は、専門にされた蛋白質の活動によって仲介されます。具体的には、pH の動態は、原形質膜プロトン (H+) 押出シ ステ ム、ナ+などによって制御される細かく/H+交換 (NHE) 蛋白質家族。NHE の調節機構を研究するための広範な努力にもかかわらず NHE 族の生物物理・分子の性質の私達の現在の理解は、NHE 活動を効果的に測定する方法の限られた供給のためは十分ではないです。.本稿では、我々 は H+を使用-全体セル中に電極パッチ クランプ記録 NHE 誘起 H+フラックスを測定します。提案した通常のいくつかの制限を克服するためにこのアプローチは、放射性の取り込みなど蛍光膜定性、NHE の利用状況を測定するためのメソッドを使用します。記述法を用いた NHE 活性の測定により、細胞内の H+濃度のより効率的なコントロールと時間分解能高感度。H+-電極がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。H+-への移行と繰り返し、振動方法で細胞膜から離れた電極記録電圧差 h+に依存しています。一方、H+-H+フラックス全体セル構成でパッチ クランプ メソッドを使用して、細胞内のイオン組成を制御する、セルの外に移動を検出する電極を使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質の細胞内構成の変更ができます。NHE アイソ フォーム 3 (NHE3) の輸送活動はイノシトールリン脂質により NHE3 調節の分子基盤の研究にこの技術的なアプローチを使用して測定しました。

全細胞のパッチ ・ クランプ記録の中に自己参照の伊勢は、イノシトールリン脂質によって NHE3 活性の調節を研究に適用されました。PS120 線維芽細胞様細胞の24、内因性膜 NHEs の表現が不足しているが使用されました。NHE3 野生型 (NHE3 wt) または NHE3 変異しないバインド イノシトールリン脂質 [チロシン 501、503 アルギニンとリジン 505 はアラニン、Y501...

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Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

本稿では、プロトン電極やパッチク メソッドのプロトン輸送システムのアクティビティを計測への応用について説明します。これらのメソッドは、一般的に中等度の感度、時間分解能が不足して細胞内環境制御などのプロトン輸送活性を研究する使用される技術のいくつかの制限を克服します。

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K ビュー.  Des Moines University. 本稿では、プロトン電極やパッチク メソッドのプロトン輸送システムのアクティビティを計測への応用について説明します。これらのメソッドは、一般的に中等度の感度、時間分解能が不足して細胞内環境制御などのプロトン輸送活性を研究する使用される技術のいくつかの制限を克服します。

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Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

生物学

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

生化学

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

神経科学

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

脳組織における測定細胞外イオンの信号のための、二連と同心微小電極

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of membrane carrier proteins reconstituted in lipid bilayer membranes is a powerful but delicate method for the assessment of their physicochemical and pharmacological properties. The substrate turnover number is a unique parameter that allows the comparison of the activity of different membrane proteins. In an electrogenic transport, the gradient of the translocated substrate creates a membrane potential that directly correlates to the substrate turnover rate of the protein. By using silver chloride electrodes, a diffusion potential, also called liquid junction potential, is induced, which alters electrode potential and significantly disturbs precise membrane potential measurements. Diffusion potential can be minimized by a salt bridge, which balances electrode potential. In this article, a micro-agar salt bridge is designed to improve the electrophysiological set-up, which uses micropipettes for the membrane formation. The salt solution is filled into a microcapillary pipette tip, stabilized by the addition of agarose, and can be easily mounted to a standard electrode. The electrode potential of a micro-salt bridge electrode is more stable compared to a standard electrode. The implementation of this system stabilizes electrode potential and allows more precise measurements of membrane potential generated by a pH gradient. Using this system, the proton turnover rates of the mitochondrial carriers UCP1 and UCP3 are reinvestigated and compared to earlier measurements.

In electrophysiological measurements, the presence of a diffusion potential disturbs the precise measurement of the reverse potential by altering the electrode potential. Using a micro-agar salt bridge, the impact of the diffusion potential is minimized, which allows a more precise measurement of substrate turnover numbers of reconstituted recombinant membrane proteins.

組換え膜蛋白質のプロトンの回転率を分析するためのマイクロ寒天塩橋電極

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

電気生理学基づき固体支持された膜の概要

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

<meta charset="utf8"></head><body>遺伝子改変スパイキングHEK細胞に対するエレクトロポレーション効果の評価

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be affected by electric pulses even in therapies where they are not the primary targets, and this can cause adverse side effects. Therefore, to optimize the electroporation-based treatments of excitable and non-excitable tissues, there is a need to study the effects of electric pulses on excitable cells, their ion channels, and excitability in vitro. For this purpose, a protocol was developed for optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells. With the use of a fluorescent potentiometric dye, the changes in transmembrane voltage were monitored under a fluorescence microscope, and relevant parameters of cell responses were extracted automatically with a MATLAB application. This way, the excitable cell responses to different electric pulses and the interplay between excitation and electroporation could&#160;be efficiently evaluated.

<meta charset="utf8"></head><body>遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

For studying responses of excitable cells in vitro, the protocol describes optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells as well as changes in transmembrane voltage with automated extraction of relevant parameters.

遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

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ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

脳組織における測定細胞外イオンの信号のための、二連と同心微小電極

組換え膜蛋白質のプロトンの回転率を分析するためのマイクロ寒天塩橋電極

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する

電気生理学基づき固体支持された膜の概要

遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング