この方法は、慢性疾患の老化および発症時の脳血流調節に関連する脳血管生理学の分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、生理学的条件下でのネイティブな形態の脳動脈内皮の細胞内カルシウムと膜電位の同時測定を可能にすることです。マウスの脳を分離するには、顕微鏡下で頭蓋骨の上に皮膚と毛を取り除きます。
そして、冷たいカルシウムフリーPSSで過剰な血液を除去します。次に、標準的な解剖はさみの先端だけを使って切開を行います。後頭部の骨から始まり、頭蓋骨の鼻骨を通って伸びる。
その後、彼女は粗い先端の鉗子を使用して、切開に沿って慎重に頭蓋骨を開き、脳を露出させるために結合組織を分離します。分離した脳を冷たいカルシウムフリーのPSSでビーカーで静かに洗い、血液を取り除きます。脳動脈の分離のための冷たい解剖液を含むチャンバーに脳腹側を上に置きます.
脳動脈を分離するには、2本のステンレス製ピンをガラスペトリ皿の底に炭を注入したシリコンポリマーコーティングに挿入して、冷たい解剖液中の単離された脳を固定します。続いて、後部脳動脈を約0.3〜0.5センチメートルのセグメントを後部通信およびバジル動脈から外科的に隔離する。シャーレの解剖液中の分離された後脳動脈を両方確保するために、ステンレス製のピンを使用してください。
その後、鋭利な細かい先端の鉗子を使用して結合組織を除去することによって、分離された後脳動脈を慎重に清掃する。酵素消化のために無傷の動脈を1〜2ミリメートルのセグメントに切り分ける。この手順では、顕微鏡、カメラ、チャンバーとマイクロマニピュレータを保持するアルミニウム段を用いてトリチャレーション装置を準備する。
マイクロシリンジを、ステージと試料に隣接するポンプコントローラで固定します。次に、滴定ピペットに鉱物油を完全にバックフィルし、マイクロシリンジピストンの上に固定します。次に、マイクロシリンジをポンプコントローラで使用して、約130ナノリットルの解離溶液をピペットに引き出し、気泡がないことを保証します。
続いて、無傷の動脈セグメントを10ミリリットルのガラスチューブに必要な酵素濃度を含む解離液の1ミリリットルに入れる。部分的な消化のために10〜12分間摂氏34度でインキュベートします。消化後、酵素溶液を5ミリリットルの新鮮な解離液に置き換えます。
1ミリリットルのピペットを使用して、室温で解離液を含むチャンバに1つのセグメントを移す。次に、ピペットをチャンバー内の解離液に入れ、消化された容器の一端近くに置きます。穏やかなトリアーレーションのためのポンプコントローラーの毎秒2から5ナノリットルの範囲内の速度を設定しなさい。
100倍から200倍の拡大を見ながら、動脈セグメントを引き出して排出し、内皮管を産生しながら平滑筋細胞を解体する。必要に応じて、細かい先端の鉗子を慎重に使用して、分離されたアドベンチアと内部弾性薄層を内皮管から分離します。すべての平滑筋細胞が解体され、内皮細胞のみが無傷のチューブとして残っていることを確認します。
マイクロマニピュレータを使用して、重ね合うガラスピンピペットを使用して、重ね液室のガラスカバースリップ上の内皮管の両端を固定します。解離されたアドベンチシアと平滑筋細胞をチャンバーから洗い流します。そして、解離液を2モル以上塩化カルシウムPSSに交換します。
高融および実験リグの顕微鏡に固定された内皮管を備えた移動式プラットフォームを移します。その後、実験中にPSSとそれぞれの薬物溶液の連続配信のために6つのクリーン50ミリリットルの貯水池を使用してください。インラインフロー制御バルブを使用して、流量をラミナーフローと同じ一貫性に設定し、フローフィードを真空吸引に合わせるようにします。
バックグラウンドデータと染料のロードを記録する前に、少なくとも5分間、内皮管の重ね合せのためにPSSをチャンバに送ります。膜電位を細胞内カルシウム濃度と同時に測定するには、鋭利な電極を引っ張り、2つの塩化モルカリウムを埋め戻して、フラ2染料を積んだ細胞から記録します。色素移動による細胞内結合を研究するために、2つの塩化モルカリウムに溶解した0.1%のヨウ化プロピジウムを微小電極に埋め戻す。
次に、マイクロマニピュレータで固定された電気計ヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーに塩化物でコーティングされた銀線の上に電極を置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、電極の先端をチャンバー内の流れるPSSに簡単に配置し、4倍の目的を見ることができます。続いて、静設膜電位を、接地浴電位と一致するようにゼロに設定する。
必要に応じて、エレクトロメーターにリンクされた可聴ベースラインモニタを使用して、サウンドピッチと潜在的な録音を関連付けます。その後、40倍の目的を使用して倍率を400倍に増やし、電極先端を内皮管のセルの上に配置します。フォトメトリーソフトウェアを使用してフォトメトリックウィンドウを調整し、約50〜80個の内皮細胞に焦点を当てます。
次に、マイクロマニピュレータを使用して電極を内皮管のセルの1つにそっと入れ、安静時膜電位が安定するまで少なくとも2分間待ちます。静止した膜電位が期待値で安定したら、光がない場合は蛍光界面の光電子増倍管をオンにし、510ナノメートルで蛍光放射を収集しながら340ナノメートルと380ナノメートルで交互に励起フラ2により細胞内カルシウム濃度の取得を開始します。膜電位と細胞内カルシウム濃度の同時測定が確立されると、薬物の適用前に一定の層流量でPSSを有する内皮管の重ね合わせに約5分を要する。
PSSで調製した薬剤を一定の流量でスーパーフュージョンチャンバーに塗布する。薬物治療中にF340/F380比で膜電位を同時に測定します。実験が終わったら、電極をセルから引き出します。
次に、膜電位と細胞内カルシウム濃度の各記録を停止し、データ分析のためにファイルを保存します。これはマウス大脳動脈内皮管の差動干渉コントラスト画像であり、40倍の目的を用いてフォトメトリックウィンドウでの実験のために調整される。画像の上部に示すように、鋭い電極がセルに配置されます。
ここでは、100マイクロモルATPに応答してF340/F380比と膜電位を同時測定するための生のトレースの例を示します。この手順に従って、共焦点蛍光顕微鏡のような他の方法は、例として、内皮カルシウムのマイクロドメインシグナル伝達、及び活性酸素種に関する追加の質問に答えるために行うことができる。一般に、この技術は、細胞生理学の研究が血管機能を探求し、血液およびリンパ循環の老化を探求するための道を開き続けます。
