Name: encapsulation thermogenic preadipocytes for transplantation into adipose tissue depots
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
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私たちは社説助けをジェニファーPetrosinoのとDavid DiSilvestroに感謝したいと思います。本研究では、アメリカの卵会およびノボノルディスクファーマから賞番号10040042からだけでなく、OSUでの食品イノベーションセンター、オフィス国際のための、高度な機能性食品研究センター、および起業家精神によってだけでなく、受賞番号20020728でサポートされていました全米科学財団は、EEC-0914790（LJL）を付与します。このプロジェクトは、ディレクターのオフィスによって資金を供給、研究資源のための国立センターから賞数R21OD017244（OZ）とUL1RR025755（OSUCCC）でサポートされている国立衛生研究所（OD）と医学研究のためのNIHロードマップによってサポートされていました説明とNCI P30CA16058。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも研究資源のための国立センターや国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

研究プロトコルは、オハイオ州立大学の倫理委員会によって承認されました。動物実験は、IACUCプロトコルによって承認されました。すべての手順は、層流とレベル2生物学的安全キャビネットの下で行いました。我々は、すべての標準的な安全要件と手順に従いました。 17、18に記載されているように、マイクロカプセルの製造のためのマイクロカプセル化技術が行われています。 材料の1の準備<ol><li>オートクレーブ処理生理食塩水（水中の0.9％NaCl）で2％アルギン酸ナトリウム溶液10mlを準備します。生理食塩水中の0.05％PLL溶液を調製します。前日これらのソリューションを用意し、一晩攪拌します。使用前に0.22μmフィルターでソリューションをフィルタリングします。 </li><li> 0.9％NaCl溶液に50 mMのクエン酸ナトリウム及び100mMのCaCl 2を用意し、それらをオートクレーブ。 </li><li>すべてのソリューション、針、電極、およびビーカーをオートクレーブ。目詰まりを回避するために、ワイヤで十分にきれいな針。 </li><li> （102マイクロカプセルがよく毎cm 2のために必要とされており、カプセル18あたり約500個の細胞がある）カプセルに使用する細胞の適切な量を決定します。 200万細胞あたりアルギン酸ナトリウムの1ミリリットルを使用してください。 </li><li> 「線維芽細胞増殖培地は、「10％ウシ血清を含む用意し、高グルコースで100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン（4,500 mg / Lのグルコース）ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）。 <ol><li> DMEM、10％ウシ胎児血清、10μg/ mlインスリン、1μMのデキサメタゾン、0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン、および100 U / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含有する「分化培地I &#39;を準備します。 </li><li> DMEM中で「分化培地II &#39;を含む10％ウシ胎児血清、10μg/ mlのインスリン、および100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシンを準備します。 </li></ol></li><li> 10ミリリットルラジオ免疫沈降アッセイバッファごとにプロテアーゼ阻害剤錠剤を含む溶解緩衝液を調製する（RIPA緩衝液）。 </li></ol> 2.アルギン酸マイクロビーズの調製（図1A） <ol><li>細胞培養フラスコから古い培地を除去します。 10mlのPBSで細胞を洗浄します。 0.25％トリプシン-EDTA（1コンフルエントのT175フラスコ当たり2ml）で懸濁液中の細胞を持参してください。 </li><li>血球計数器を用いて細胞懸濁液中の細胞をカウントします。細胞懸濁液から10ミリリットルのアリコートを使用し、製造業者の説明書に従って細胞をカウントします。室温で5分間480×gの遠心分離培地中に残存する細胞を遠心します。 </li><li>ステップ1.4で説明したようにアルギン酸ナトリウムで細胞ペレットを一時停止します。 5ミリリットル注射器にアルギン酸ナトリウム - 細胞溶液を移します。 </li><li> 23ゲージの針を追加し、溶液中の気泡を除去し、空気1mlのポケットを作成するための注射器を反転。 </li><li>カプセル化の針注ぎ口の下の100mMのCaCl 2溶液144ミリリットルを含む小さなビーカー（180ミリリットル）を配置します。先端approximでカプセル化に電極を取り付けately 2.5センチメートルの100mMのCaCl 2溶液の表面の上。 </li><li>しっかりとシリンジポンプでのアルギン酸ナトリウム - 細胞溶液を含む注射器を置きます。注射器の開口部にゴムチューブを取り付けます。アルギン酸ナトリウム - 細胞溶液がチューブの途中に入るまで、プランジャーを押してください。 5.4 kVのに電圧を調整します。シリンジポンプの12.06ミリメートルの直径を設定します。 3ミリリットル/時の速度を調整します。ポンプを起動します。カプセル化をオンにして、5.4 kVの電圧を維持します。 </li><li>フードのウィンドウを閉じ、アルギン酸マイクロビーズの形成が終了するまで、不要な振動を避けることができます。すべてのソリューションは、針を通過した後、PLLでコーティングする前に、追加の20分間の100mMのCaCl 2溶液中のアルギン酸ボール状のマイクロビーズを固めます。 </li></ol> PLL 3.コーティングマイクロビーズ（図1B） <ol><li>アルギン酸ナトリウムセルボール状のマイクロビーズを含むビーカーを削除し、これらがMicroBを転送50ミリリットルの遠心チューブにEADS。マイクロビーズペレットからのCaCl 2溶液を除去します。 </li><li> 0.9％NaClを30mlのを追加することにより、アルギン酸セルボール状のマイクロビーズを洗ってください。そっと手でチューブを振ります。マイクロビーズは、重力によって沈殿させた後、25ミリリットルピペットで0.9％のNaClを削除します。合計3回の洗浄のためにさらに2回繰り返します。 </li><li>アルギン酸ナトリウム溶液の各1ミリリットルのための0.05％PLL溶液10mlを使用してください。 10分間分1,000回転で0.05％のPLLと渦を追加します。 注意：通常、10分PLLコーティングのために十分です。 </li><li> PLLコートを形成した後、PLL溶液を除去し、3.2に記載したように、カプセルを3回洗浄します。 </li></ol>アルギン酸コアの4除去（図1C） <ol><li> 50mMのクエン酸ナトリウム溶液30mlを加えます。 5分またはすべてのアルギン酸ナトリウムが溶解するまで待ってください。ステップ3.1.1で説明したように洗浄を3回カプセル。 </li><li> 0.9％のNaClを削除し、50mlチューブに培養液の20ミリリットルを追加します細胞培養フラスコに細胞を含むすべてのカプセルを転送します。標準的な細胞培養条件18歳未満のカプセル化された細胞を処理します。 </li></ol>異種移植と細胞間の代謝物の流入/流出の宿主細胞間相互作用やキネティクス（図2）を研究するためのインビトロ適用5. <ol><li>共培養のためにコンフルエントになるまで24ウェルプレート上で培養された宿主細胞。脂肪前駆細胞を培養するため「線維芽細胞増殖培地 &#39;を使用します。 </li><li>コンフルエント宿主細胞を含む24ウェルプレートにマイクロカプセルを転送します。単層（ウェルの102マイクロカプセル/ cm 2の ） を達成するために、マイクロカプセルを追加します。 </li><li> 6日間分化培地IIへの前脂肪分化培地Iと分化48時間ごとに、変化媒体を誘導します。 RIPA緩衝液中で細胞を溶解します。ウエスタンブロットを用いて、タンパク質の発現を分析するために条件当たり50μgのタンパク質を使用してください。 </li></ol> Treatmためのインビボ応用6.肥満のENT（図3） <ol><li>麻酔の麻酔の導入および維持のための酸素と2％のイソフルランのための酸素と4％のイソフルランを混ぜます。つま先のピンチにより十分な麻酔深度を確認してください。 <ol><li>乾燥から角膜を保護するために、目のかゆみ止め軟膏を適用します。 </li></ol></li><li>このような緑色蛍光タンパク質（GFP）のような恒久的に人工蛍光タンパク質で標識されたカプセル化細胞を使用します。 </li><li>カプセル化された細胞を注入するために3ミリリットルの注射器と20ゲージの針を使用してください。 <ol><li> 図3に示すように、生殖腺と腎臓の間腹腔内領域に配置されている各IAB脂肪デポに0.2mlのPBSに懸濁し、0.5×10 6個の細胞を注入します。の平均重量を有するマウスは、このPBSの容量とセル数を使用します40g添加しました。異なる重量または用量依存効果の決意のために持っているマウスでは細胞数と音量を調整します。 </li></ol></li></ol>

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種々の方法は、乾燥、押出し、および乳剤19を含む細胞をカプセル化するために使用されてきました。この方法では、アルギネートビーズをPLLでコーティングし、アルギン酸塩コアをカプセル化を完了するために溶解され、針を通して押し出されます。この方法は、長年使用されているが、所望のサイズおよび形状の球形ビーズの形成は依然として困難です。カプセルのサイズは、ア...

慢性疾患の発生増加1は、治療用細胞集団2の移植に関する研究を刺激してきました。同系または同種異系幹細胞は、これらのアプリケーション2のために最も一般的に使用される細胞型です。しかし、これらの治療は、移植後の幹細胞の分化と移動の制御を可能にしないと、効率的なコストされていません。有益な機能を有する遺伝的に改変された細胞の移植は多くの疾患の治療を改善すると予想しています。しかし、遺伝子の細胞改変は宿主の免疫系によって認識され、したがって、これらの治療は、免疫抑制3が必要です。インスリン産生細胞のカプセル化は、チャン博士4によって開発されました。技術は、塩化カルシウム溶液中に浸漬されたアルギン酸塩の液滴中の細胞のカプセル化に基づいています。アルギン酸分子は、（M）マンヌロンとグルロン酸（G）で ​​構成され、CAによって接続することができ2+。ゲル化後、ビーズを、ポリ-L-リジン（PLL）溶液に懸濁させます。このステップの間、PLLは、カプセルの膜を確立アルギン酸分子中のGとMに結合します。カプセルの膜の多孔度は、MとPLLの濃度、インキュベーション時間、温度を変化させることによって調節することができます。 PLLの結合はまた、アルギン酸塩の種類と濃度に依存します。のCa 2+イオンで ​​架橋されたアルギン酸塩マトリックスは、生理的環境中またはリン酸とクエン酸イオン濃度の高い共通の緩衝溶液中で不安定です。これらのバッファは、アルギン酸からのCa 2+を抽出し、コアを液化することができます。アルギン酸塩コアの液状化は、細胞の移動および増殖のためのカプセルの内部の空間を提供します。ポリカチオン性ポリ-L-リジン（APL）とポリアニオンのアルギン酸に封入された細胞は、免疫グロブリンのために不浸透性であるが、毒素の栄養素の流入と流出を持っています。これらのAPLの特性は、長期のsuを有効に遺伝的に異なるホストへの移植後にカプセル化された細胞のrvival。エリオットらは、9年後の移植5人の患者にカプセル化されたブタの膵臓細胞を機能の生存を報告しました。 カプセル化技術は、マイクロカプセル化（3-800ミクロン）およびマクロカプセル（千ミクロンよりも大きい）に分類することができます。マイクロカプセルは、マクロカプセル6よりも耐久性があります。 1964年のチャン博士らによるその発見以来、マイクロカプセル化は広く、インスリン、他のホルモン、および生理活性分子7を製造同化細胞のカプセル化のために使用されてきました。これらの治療は、線維症、免疫応答8を含む宿主組織内のいくつかの課題に直面していました。最初は、バイオポリマーの品質に関連する副作用が解決されました。しかし、同化細胞の移植は、依然としてホルモンの結果として、そのような線維症などの副作用を開始overpr特殊な腺の外側oduction。 ここ数十年では、肥満や2型糖尿病は、大流行9に達しています。大人の人の30％以上は、世界中の過体重および肥満である10。増加腹腔内（IAB）脂肪形成は、慢性炎症の発生率を増加させ、2型糖尿病、心血管疾患、特定の癌および他の病的状態11-13を促進します。いくつかの証拠は、IABの脂肪に関連する病因が特定の脂肪細胞によって回避することができることを示唆しました。最近の研究では、IAB領域への皮下の脂肪細胞の移植は、代謝を改善し、インビボで 14げっ歯類の肥満およびインスリン抵抗性を減少させることができることを示しました。肥満とインスリン抵抗性の効果的な低減は、熱15,16の形でエネルギーを放散することが可能な熱発生、脂肪細胞と関連しています。脂肪細胞の産熱変性は、安定なトランスフェクションによって達成することができますこのような脱共役タンパク質1（UCP1）またはUCP1および他サーモ15,16遺伝子の発現を調節する遺伝子のミトコンドリアのプロトン脱共役に関与する遺伝子の。我々の最近の研究では、アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠乏1 A1（ALDH1A1）が 17,18、これらのマウスにおいて、肥満およびインスリン抵抗性を減少させるIAB脂肪の熱発生リモデリングをもたらすことを示しました。なお、熱発生ALDH1A1欠損（ALDH1A1 - / - ）のカプセル化前脂肪細胞は、IAB脂肪18の治療のための新規治療機会を示唆し、肥満の野生型マウスでIAB脂肪の同じ治療効果を媒介します。実験的な設定では、カプセル化された細胞は、費用対効果の高い方法19内の特定の細胞集団の効果を研究するために研究者を可能にします。ここでは、熱発生異化細胞株とその研究室のカプセル化と肥満のマウスモデルにおける治療的適用の方法について説明します。プロトコルは、Tを説明しますマイクロカプセルの製造（ 図1）のためのHREE相：アルギン酸ビーズ（ 図1A）、ポリカチオン性ポリ-L-リジン（PLL）マイクロビーズの表面（ 図1B）上の膜の形成および除去の形成アルギン酸コア（ 図1C）。

<table><tbody><tr><td>Encapsulation device (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>None</td></tr><tr><td>KD scientific syringe pump</td><td>KD scientific</td><td>780100Y</td><td>None</td></tr><tr><td>Olympus microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>None</td></tr><tr><td>Sodium alginate</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>None</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide (PLL)</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>None</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>None</td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>None</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>None</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>None</td></tr><tr><td>ATGL primary antibody (from rabbit)</td><td>Cell Signaling</td><td>2138S</td><td>None</td></tr><tr><td>Secondary anti body (anti rabbit)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>None</td></tr><tr><td>Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>None</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>None</td></tr><tr><td>Cortizone 10 anti-itch ointment</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>None</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>None</td></tr><tr><td>Newborn calf serum (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>None</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>None</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>None</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>None</td></tr><tr><td>Insulin (bovine)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>None</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>None</td></tr></tbody></table>

encapsulation thermogenic preadipocytes for transplantation into adipose tissue depots

細胞カプセル化は、半透過性膜内に生存細胞を捕捉するために開発されました。移植カプセル化細胞は、長期生存を達成するために、処置される宿主の組織中に低分子量の代謝産物を交換することができます。半透膜は、移植されたカプセル化された細胞は、免疫系による拒絶反応を回避することができます。カプセル化手順は、例えば、インスリン、他のホルモン、およびサイトカインなどの生物活性化合物の制御放出を可能にするように設計されました。ここでは、肥満マウスの腹腔内脂肪組織における熱産生及びエネルギー散逸のための脂質を消費異化細胞、（熱発生）のカプセル化のための方法を説明します。サーモ異化細胞のカプセル化は、肥満の予防と治療に潜在的に適用可能であること、および2型糖尿病があります。異化細胞の別の潜在的なアプリケーションは、アルコールまたは他の毒性代謝物および環境汚染物質の解毒を含むことができます。

図1は、マイクロビーズの生産の各ステップは、顕微鏡下で制御することができたことを示している。 図2（a）は、共培養する方法脂肪細胞をカプセル化された細胞の単層で示している。 図2Bは、脂肪細胞/マイクロカプセルの共培養を用いた定量的研究の代表例であること脂肪細胞の前記溶解物を、ウェスタンブロットを用いて分析したセクションで説?...

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Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

encapsulation-thermogenic-preadipocytes-for-transplantation-into

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K ビュー.  The Ohio State University. Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

ビデオ: Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health. Still, there are significant limitations to available primary culture models, all of which have failed to faithfully recapitulate the adipose microenvironment or extend WAT viability beyond two weeks. The lack of a reliable primary culture model severely impedes research in WAT metabolism and drug development. To this end we have utilized NIH's standards of a microphysiologic system to develop a novel platform for WAT primary culture called 'SWAT' (sandwiched white adipose tissue). We overcome the natural buoyancy of adipocytes by sandwiching minced WAT clusters between sheets of adipose-derived stromal cells. In this construct, WAT samples are viable over eight weeks in culture. SWAT maintains the intact ECM, cell-to-cell contacts, and physical pressures of in vivo WAT conditions; additionally, SWAT maintains a robust transcriptional profile, sensitivity to exogenous chemical signaling, and whole tissue function. SWAT represents a simple, reproducible, and effective method of primary adipose culture. Potentially, it is a broadly applicable platform for research in WAT physiology, pathophysiology, metabolism, and pharmaceutical development.

White adipose tissue (WAT) has critical deficiencies in its current primary culture models, hindering pharmacological development and metabolic studies. Here, we present a protocol to produce an adipose microphysiological system by sandwiching WAT between sheets of stromal cells. This construct provides a stable and adaptable platform for primary WAT culture.

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

行動学

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

免疫・感染学

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

ベージュ/ブライト細胞間質血管細胞の単離と分化

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

生物学

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

生物工学

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

医学

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

<meta charset="utf8"></head><body>ヒトSATMVECs:単離と脂肪細胞クロストーク研究

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:皮下脂肪組織微小血管系研究による心血管代謝疾患への洞察

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

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人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

ベージュ/ブライト細胞間質血管細胞の単離と分化

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究