The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

<ol>
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The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

ヒトでは、感染症、組織炎症、細胞の動員、組織リモデリングおよび組織の恒常性の調節に応答が異なる細胞型が関与する複雑な事象です。したがって、これらの方法は、最高の局所組織環境において研究されています。以前は、これは、主に実験動物モデルを使用して可能でした。彼らはしばしば、人間とは異なる方法で病原体に対応し、また、疾患1の別のコースを表示しかし、広く使用されている実験動物は、多くの制限を保持します。 インビトロの肺組織モデル中のヒトはヒト肺で特異的免疫応答を研究するための可能性を保持しています。 ヒト結核感染（TB）は、主に肺に影響を与える病気である。 結核菌 （ 結核菌 ）、結核の原因物質は、細菌が肺dendriに飲み込まれている肺胞腔に輸送されるエアロゾル液滴を経由して肺に達します感染2,3に対する自然免疫応答の一部として、チック細胞や肺胞マクロファージ。病原体の食作用はファゴソーム内のバグの区画化につながる、理想的には食細胞による中和および病原体を死滅させることになります。 Mに曝露された個体の50％まで結核は、先天性免疫応答4を介して感染をクリアすることができると考えられています。感染の他の結果は後の段階で適応免疫系によるクリアランス、潜伏感染またはアクティブな疾患5慢性最悪のケースです。 以前は人間の結核の研究のために何のインビトロ組織モデルは存在していません。ヒトマクロファージまたは他の末梢血細胞の単一細胞培養物は、多くの場合、6,7を使用されています。このアプローチの欠点は、Mに露出し、肺組織内で一緒に動作して、異なる細胞型の動態を反映することができないことです結核 </eM&gt;。したがって、TB上の機能とメカニズムの研究を行うことができるようにするインビトロモデルが必要とされています。セル・ベースのここで説明する体外ヒト肺組織モデルでは、もともとの樹状細胞の機能8の研究のために私たちのグループによって設立されました。私たちは、結核の研究のために、この方法を適応しています。 ここに提示されたヒト肺組織モデルは、組織特異的な上皮細胞および線維芽細胞8から成ります。これらの細胞は、トランスウェルインサート中の多孔質膜の上に、コラーゲンマトリックス中で培養され、フォーム構造は、正常なヒトの肺組織（ 図1）に似ています。空気にさらされると細胞は頂端側8に粘液を分泌し始めます。 M.に感染したヒト初代マクロファージを注入することにより、モデルへの結核 、我々は、免疫細胞が組織に移行し、結核性肉芽腫9の初期段階を形成する方法を観察しています。これは最初のヒト組織モデルDESCRです結核ibed、それが結核と肺の他の疾患に対する自然免疫応答を研究するための有望なツールをもたらします。これまでに、我々は、モデルにおいて免疫細胞としてのみ単球およびマクロファージを使用しているが、複雑さのレベルは、追加の関連する細胞型を含めることによって増加させることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> 肺組織モデルの概略1.概略図。 （A）モデルM.、ヒト肺特異的上皮細胞で構成されています結核は、初代マクロファージをに感染し、赤色の色素ラベルされた単球をトランスウェルフィルター上に作製したコラーゲン埋め込 ​​まれた線維芽細胞上に播種。空気への組織モデルの露出は、上皮によって細胞外マトリックスタンパク質の産生、粘液分泌と層化を開始します。こうして開発された3次元組織モデルは 、M を研究するための便利なツールですCLO環境における結核感染SELYヒトの肺。（B）組織モデルの製造における様々なステップの代表的な顕微鏡像。（C）肺モデル組織切片の完全な構造に似ています。スケール- 。100ミクロン<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

結核（TB）は依然として世界の人々の健康に大きな脅威を保持し、私たちは病気のメカニズムを理解し、新たな治療選択肢の発見を進める手助けするためのコスト効率に優れたが、信頼性の高いモデルの必要性がある。単層のインビトロ細胞培養または共培養は、三次元（3D）環境および組織応答を欠いています。ここで、我々は結核菌 （ 結核菌 ）の感染の間に起こる複雑な事象を研究するための有効なツールであることが期待されているヒト肺組織のインビトロモデルで革新的なについて説明します。 3次元組織モデルは、多孔質膜の上に、コラーゲンマトリックス中で培養された組織特異的上皮細胞および線維芽細胞からなります。空気暴露されると、上皮細胞層別化し、頂端側の粘液を分泌します。 M.に感染したヒト初代マクロファージを導入することにより組織モードに結核lは、我々は、免疫細胞が感染組織中に移動し、TBの肉芽腫の初期段階を形成することが示されています。これらの構造は根本的に異なるか、一般的に広く使用されている実験動物モデルにおいて観察されていない人間の結核、肉芽腫の明確な特徴を再現。この器官培養法は、宿主細胞病原体相互作用の空間的および時間的機能に関する重要な情報を提供する3次元可視化と堅牢な定量分析を可能にします。まとめると、肺組織モデルは、結核の研究のための生理学的に関連する組織の微小環境を提供します。従って、肺組織モデルは、基本的な機構的および応用研究の両方のための潜在的な意味を持ちます。重要なことには、モデルは、それによって、肺に影響を与える感染症の様々なモデル化するためのその使用が広がり、個々の細胞型の添加または操作を可能にします。

ヒトの結核のための3D肺組織モデルは、効果的にMの宿主-病原体相互作用を研究するために使用することができ結核感染 。この方法の基本的な手順は、異なるステップ及び組織切片の全体的な微細構造の代表的な顕微鏡写真を図1に概説されている。このモデルは肺線維芽細胞、気管支上皮細胞および初代単球/マクロファージを含むヒト肺組織のいくつかの構成要素を有しています3D組織環境内に埋め込まれました。ヒト肺組織の構成要素を組み込むだけでなく、モデルは、生理的条件に上皮および粘液分泌のすなわち成層に似ています。 TB感染の監視に肺組織モデルの使用の例は、図2に示されている。M.を視覚化するため結核 -immune細胞遊走との相互作用は、我々 は 、Mに感染したマクロファージを導入しましたGFPを発現する結核組織モデル（核について染色ブルー、DAPI）に合わせて新たに単離したPKH26標識単球（赤）と（緑）。 Mの 7日後の追加について組織モデルに結核に感染した細胞は、共焦点顕微鏡は、人間の結核9の特徴的な病変を模倣感染（緑）のサイト（ 図2）、で赤単球のクラスターを明らかにしています。 Mの 3次元可視化のための代表的な一連の画像結核は、細胞クラスターの組織モデルと定量化は、図3に示されているに感染し。3Dビジュアライゼーションは、3D画像にいくつかの機能を、対話調べ、定量化するため、ユーザーの柔軟性を提供します。 M.部位で単球のクラスターを明らかに図3Bに示すように、緑と赤の細菌単球クラスタの空間的配置は、頂端の回転及び側面図から分かるよう結核。クラスター OBませんでした感染していない組織 （ 図3A）で提供しています。個々の単球の数がMに（p &lt;0.01）減少し、我々は、単球細胞集団のサイズと数を定量した （p &lt;0.001）、細胞塊の大きさ（体積）が増強されることを見出しました結核は感染していない組織モデル（ 図3Cおよび3D）と比較して組織を感染させました。このデータは、Mの初期の肉芽腫形成の我々の以前の発見を検証します結核感染は、2D組織切片9で分析肺組織モデルで観察しました。 我々のデータは、組織モデルは、M細胞-複雑なホストを調査するために自然な立体生息地を提供していることを示唆しています結核の通信ネットワーク。また、3次元可視化と定量分析は、組織モデル（ 図3）の機能を研究するための優れたツールであることがわかりました。細胞塊の定量化（例えば、肉芽腫）、多くの場合、ストレッチ<html>いくつかの細胞層のHESとは完全に3次元定量分析によって捕捉することができます。また、モデル内の個々の細胞や細菌の正確な空間的および時間的特徴の可視化は、指定された実験室でのライブイメージング、移動および追跡調査を可能にします。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> 病原性M.周囲の組織モデルクラスター図2.単球結核。感染していないと、Mの代表的な共焦点画像結核に感染した組織モデルが提示されています。感染していない組織と比較して、パネルの緑色から（M. tuberculosis- GFP）、赤（PKH26標識単球）、青（DAPI染色核）と合併チャネルが感染組織における単球の動員を示します。スケール - 100μmです。large.jpg &quot;スタイル=&quot;フォントサイズ：14px;行の高さ：28px; &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> 図3. 3次元可視化と組織モデルの定量分析は、有用な情報を提供しています。全体の組織モデル（A）非感染組織の3次元可視化の代表的な画像、（B）に感染したM.結核、IMARIS画像処理ソフトウェア（バージョン7.6.8）によりツァイスLSM700共焦点顕微鏡および定量分析を用いた光学セクショニングを介し。これらの画像は20X倍率で取得された、頂端、回転水平、回転、垂直および側面図（AとB）からの可視化を可能にする、1.5μmの間隔で19.5ミクロンの組織の厚さをカバーする14のzスタック。（C）QUA単球細胞クラスターのntitative分析はM.後早期肉芽腫クラスタの増強した（p &lt;0.0001）のサイズを明らかに感染組織で複数のクラスタを繰り返し強調、感染していない組織と比較して、感染の不在に比べ結核感染 。（D）単球数の定量は、感染組織の減少した（p &lt;0.01）を示しました。グリーン- M.結核 -GFP、レッド- PKH26標識単球、ブルー-細胞核、スケール- 。100ミクロン<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

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Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

18.7K ビュー.  Linköping University. Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.