著者は、蚊の繁殖のためのミリアムエステルに感謝したいと思います。この作品は、研究センターBorstelから、社内の資金によってサポートされ、ライプニッツセンター感染によって資金調達に参加しました。

<ol>
	<li>Mueller, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model.">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110 (2012).</li><li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+tuberculosis:+myths+and+truth.">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li><li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. 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著者らは、開示することは何もありません。

私たちは、マウスが生産的にマウンテンバイクやPで感染させることができる方法を説明しました感染の彼らの自然な経路を介してベルゲイ 。我々は実験的結核13やマラリア12を研究する感染プロトコルを確立し、最近ではマウスモデル1にマウンテンバイクとマラリア間の同時感染を研究するためにそれらを採用して適用します。 成功の感染症のための最も重要な工程は、所望の数字の両病原体の伝播である。彼らは時間をかけて生存能力を失うことになる、との株式もともと決定力価が最も可能性の高い、もはや正確でなくなるので、マイコバクテリア株は2歳以上であってはならない。その結果、感染用量は予想よりはるかに低いだろう。そのため、保存培養のCFU力価は数カ月ごとに決定されるべきである。同様に重要なのは最初の場所で標準化された栽培やマウンテンバイクの在庫の発生がある。このような培養条件媒体、補助剤、時間、容積がMtbの異なる株を用いた実験からのデータを比較できるようにするために標準化されるべきである。マイコバクテリアの培養中に凝集する傾向があり、従ってそれは同じ成長期に、標準化さ収穫細菌を培養条件を維持し、分注中に頻繁に再懸濁することが重要である。そうでなければ、CFU力価および感染の結果に大きなばらつきがある場合もあります。 均質に感染した蚊のバッチの生成は、別の重要なステップです。別の蚊は、個々のマウスを餌にするので、一つの感染実験に使用される蚊の全てが同じバッチから来て、蚊の90％以上が感染しているだけのバッチが使用されることが重要である。 現在のモデルは、単一の感染した宿主における免疫応答と比較することによって、重複感染宿主における免疫応答および免疫モジュレーションを分析するために使用することができる。我々はVAを適用することができますいろいろな読み取り方法は、よくこのような目的の組織または体液のサイトカインやケモカインを検出するための組織学、免疫組織化学、免疫細胞集団のフローサイトメトリー解析、またはPCRおよびELISAなどの方法論を確立しました。このようなマウスモデルは、特定の制限があることに留意すべきである。 マウンテンバイクに感染した人の大半は臨床症状の兆候の潜伏感染を開発する一方で、マウスは、進行性の肺の病理に慢性疾患を発症する。それでも、C57BL / 6マウスのMtb感染に対して比較的抵抗性であり、ヒト結核患者で観察されるような古典的な肉芽腫を発症しない。その結果、マウスでの免疫病理学的反応が適切でもない潜在も活性ヒト結核疾患を反映しない。ヒトおよびマウスでの潜伏と慢性疾患との間の不一致にもかかわらず、マウスは広範囲のMtb感染を制御し、調査する価値があり、必要不可欠なツールである宿主因子を同定し、研究するために使用されてきた感染症における免疫応答。重要なことに、Mtbの感染に対する感受性は、一般的に使用される近交系マウス系統間でかなり変動し、DBAまたはC3Hなどのより感受性系統共、単一の感染の研究に含めることができる。また、離れて本明細書に記載の病原体種から、関心のある任意の他のマイコバクテリウム種 （ 例えば、臨床分離株）を使用することができる。単一のマラリアモデルは、ヒトの疾患のあらゆる側面を複製しない間も同様に、様々なマウスモデルは密接に自然に獲得した人間のマラリア感染のさまざまな側面に似ているん。例えば、P.ベルゲイ ANKAとP.ヨエリ YM/17XLは広くPで、ヒト（ 熱帯熱マラリア原虫によって誘発される）重症マラリアのモデルを研究しているベルゲイ ANKAは、人間の脳malari S 14,15のための優れたモデルとみなされている。 P.ベルゲイ NK65はhyperparasitaemia急性マラリア、貧血のための優れたモデルであり、最近でてきたマラリア関連急性呼吸窮迫症候群（ARDS MA-16）のための実験モデルとして記述。記載され共感染モデルを用いて、我々は最近、同時P.ことを示すことができたベルグヘイ NK65感染は、慢性結核1を悪化させる。 離れて別のげっ歯類のマラリア原虫を使用してから、感染イベントの順序やタイミングは、基礎となる研究課題に応じて適用することができる。フィールドに、併用プラスモディウム感染症は、Mtbの感染または後発の時点で存在してもよい。いずれのシナリオでもマウンテンバイクやマラリアに対する免疫応答が異なる影響を受ける可能性があります。そのため、マウスはマウンテンバイクの感染の前または後のいずれか原虫スポロゾイトを感染させることができる。さらに、マウスは、異なる時間に挑戦することができる急性、慢性対上のマラリア誘発性免疫応答の影響を評価するためのMtb感染後結核。マラリア、結核の重複感染を研究するためのマラリア原虫を選択する際に重要なのは、一つは、いくつかの齧歯類マラリア原虫株は、特定のマウス系統の急性疾患を引き起こすとマウンテンバイクが免疫応答性の慢性および長期的な感染症を引き起こす間だけ数日から数週間以内に、感染に屈することに注意する必要がありますマウス。従って、重複感染のタイミングは、実験動物の早期死亡を回避するために重要である。 複数の病原体種との同時感染による宿主免疫の変調はよくわかっていないままです。重複感染宿主の免疫系との相互作用がマラリアと同時感染が病因、疾患の結果、ワクチン接種、免疫診断、および治療 ​​をどのように影響するかの理解に貢献していきます-我々の実験共感染モデルは、マイコバクテリウムを調査するための強力なツールが用意されています。

ヒト集団はほとんど唯一の病原体にさらされていない。特に、サハラ以南のアフリカなどの感染症の発生率が高いとの地域では、同時感染は、プライムが、非常に過小な公衆衛生上の問題を表している。結核、マラリア、それぞれ、ヒトにおいて最も一般的な細菌や寄生虫感染であり、熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主な原因であり続けている。結核、マラリアとの重複感染のリスクのある多数の個人間の広い地理的なオーバーラップにもかかわらず、非常に少ないが、様々な、多くの場合、同時に重複感染個体ではマラリア原虫と結核菌に対して惹起される免疫調節因子およびエフェクターを打ち消すの間の相互作用について知られている。 混合感染の齧歯類モデルは、このように相互インフルに光を流して、1ホスト内の異なる病原体に対する差分免疫反応を特徴づけることができまた、治療と予防のための新しい提案を識別するのに役立ちます変調病理及び個々の疾患の臨床結果を、ences。私たちは、同じホスト1内の結核菌（MTB）との同時感染によって引き起こされる波及効果やげっ歯類のマラリア原虫種を調査することを可能に実験用マウスモデルを確立している。重要なのは、可能な限り厳密に自然に獲得したヒトの感染をエミュレートするために、我々のモデルは、両方の病原体によって使用される感染の自然経路を実装しています。結核は、したがって、主に肺に現れる空気感染、です。それらは咳やくしゃみの間に感染性エアロゾル小滴を放出するとき原因物質は、Mtbのエアロゾル経路を介して活動性疾患を持つ人々によって送信される。従って、エアロゾル感染は自然感染を模倣するために選択される方法である。 マウンテンバイクを含有する浮遊粒子の発生を使用することによって達成することができる吸入暴露システムの。この全身曝露室は、感染が2開始され、肺の肺胞に吸入されるMTB-含む感染性エアロゾル液滴（ 図1）に実験動物を暴露できます。 一方、マラリア原虫は、自然に女性ハマダラカ蚊に刺さによって送信されたアピコンプレックス寄生原虫によって引き起こされる媒介疾患である。血粉中に、感染スポロゾイトは、ホストの皮膚の下に寄託され、その後、血流を通して肝臓に達する。肝細胞の中に彼らは開発し、急速に肝臓段階のシゾントに掛けます。最終的には、成熟したシゾントは破裂し、それらが赤血球侵入、複製、赤血球破裂、およびreinvasion 3の進行サイクルを開始する場合、血流への病原性の第一世代のメロゾイトの数千人を解放します。 マラリア原虫のライフサイクルコンチン一部のメロゾイトなどのUEは、性的寄生虫段階に血食事中に蚊によって撮影することができます男性と女性の生殖母細胞を、開発しています。蚊では、 マラリア原虫スポロゾイトは蚊の中腸内に存在するオーシスト以内に発症し、最終的に別のホスト3,4に前方送信のための唾液腺に移行する。 実験動物モデルにおいてエアロゾル、したがって、最も関連性の高い経路を介したMtbの送達は非常に一般的であるが、マラリア、結核重複感染5-7研究を含む多くの実験齧歯類マラリア感染の研究は生じさせ、寄生さ赤血球をマウスに感染させることによって実施されている臨床的にサイレント肝臓段階のフェーズを排除しながら血液段階のマラリア感染へ。しかし、肝臓期は、抗マラリア原虫の免疫8月11日のための感染症と関連する時に必須のステップです。我々は、肝のpHを含めるようにしてそれはそれゆえ重要と考えるそれぞれマラリアやマラリア、結核の同時感染は、両方の研究において、マラリア伝染とメンテナンスのASE。また、天然に送信されたスポロゾイトではなく、単離された唾液腺由来のスポロゾイトを注入するの蚊によってマラリア感染を確立することを促し、針感染12、を介して送信されるものよりも感染性であることが示されている。マラリア原虫の天然の送信のための感染性の蚊を得るための唯一の方法は、脊椎動物宿主（ここではマウス）および蚊ベクターの両方において寄生虫のライフサイクル全体を維持することである。従って、寄生虫メンテナンスのための昆虫館へのアクセスは、 咬合天然伝送を行うために不可欠である。 ここに記載さ我々のプロトコルは、 マラリアとの同時感染は、慢性結核1への影響をスポロゾイトか調査するために開発されました。そうするために、マウスをエアロゾルM.に感染している結核および40日後、ときM.結核感染は、慢性期に到達した、マウスマラリア感染蚊に曝される。重複感染動物におけるマラリア、結核の両方の結果はそれぞれ、組織中の血液寄生虫及び細菌負荷を監視することによって追跡することができる。我々のプロトコルでは、我々は彼らの自然感染ルートとどのように成功し、病原体の伝達を確認するために経由して、両方の病原体をマウスに感染させる方法を詳しく説明します。我々の手では、両方の実験的な感染のために一般的に達成感染率は100％である。これらのプロトコルは、最も挑戦的な人間の感染症の2間の重複感染をモデル化し、研究するために、我々がそうであるように、別々に感染または、両方の研究に適用することができます。このモデルは、このプロトコルに記載されているもの以外の他のマイコバクテリウムおよび齧歯類マラリア原虫種に適用可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

同時感染は自然に病原性生物の別個のタイプの地理的なオーバーラップのために発生します。同時感染はほとんどの場合、各単一病原体に対するそれぞれの免疫応答を調節することにより、病因および疾患の転帰に影響を及ぼし得る。重複感染患者は、抗感染介入に示差的に応答することができる。サハラ以南のアフリカの多くの地域でcoendemicが、どちらもマイコバクテリア、マラリア原虫マラリア原虫によって引き起こされるように結核の間の同時感染は、詳細に研究されていない。マラリア結核の同時感染は宿主免疫し、各疾患の経過を調節する方法に挑戦が、科学的、臨床的に関連性の高い質問にアプローチするために、我々は、私たちは共感染宿主内で両方の病原体に対する誘発される免疫応答を分析することを可能にする実験的なマウスモデルを確立。注目すべきは、最も正確に模倣自然に獲得したヒト感染するために、我々は実験的な実行それぞれ感染の彼らの自然なルート、 すなわちエアロゾルおよび蚊に刺され、両方によって病原体によるマウスの感染。

マウンテンバイクとP.によるマウスの感染それぞれ自然な経路を介してベルゲイ 、 すなわちエアロゾルや蚊に刺され、すべての動物の一貫性と再現性の感染の結果（ 表1）1。我々は最初の発生（prepatency）及び血液中の寄生虫の数（P.ベルゲイ寄生虫 ）と異なる器官でのマウンテンバイクの負担を、決定することによって、成功した感染症やマラリア、結核の両方の経過をモニターすることができます。感染性の蚊に刺されによる成功したマラリア原虫の伝送の例を表1及び図3に示されている。 4-5日後（ 表1及び図3A）血液段階の寄生虫の存在によって確認されるように、各マウスに10スポロゾイト感染蚊の供給は100％の感染率となった。重要なのは、我々は同じ実験GRの個々のマウスの血液中に、同様の寄生虫番号を検索OUP、一貫した再現感染蚊に刺された結果によってそのスポロゾイト送信を示す。 MTB-重複感染した動物のそれとナイーブ対照マウスにおけるprepatencyを比較することで、我々はそのprepatency若干マウンテンバイク （ 表1、図3B）でpreinfectedされていたマウスでは遅延している見ることができます1。我々は以前に1を報告しているように、我々は、図3（b）に示すように、毎日ギムザ染色した血液塗抹標本に寄生虫を監視することにより、マラリアのコース上のMtb同時感染の影響を判断することができます。 個々のマウス（ 図4A）との間の比較的低い変動と肺の中の細菌の成功沈着吸入暴露システムの結果を利用してマウンテンバイクによるマウスの感染。我々は、肺およびCFU決定により経時的に関心のある他の臓器中のマイコバクテリアの負荷に追従することができる。の肺におけるマイコバクテリア負荷例マウンテンバイクは、P.の非存在下または存在下でC57BL / 6マウスを感染させベルゲイは、 図4Bに示されている。 表1。蚊に刺されによるスポロゾイト送信後Prepatency。すべてのマウスがPの自然送信後血液段階の感染症を開発蚊に刺さでスポロゾイトをベルゲイ 。 1 PLoSのONEの許可を得て7（10）、e48110から適応。 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 実験マウス群（C57BL / 6） </td><td> 10感染蚊に刺されによる挑戦 </td><td> グループあたりの動物の血液段階陽性動物/番号の番号 </td><td> 平均prepatency [D] </td></tr><tr><td>ナイーブ</td><td> P.ベルゲイ </td><td> 7月7日</td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> MTBは、感染した</td><td> P.ベルゲイ </td><td> 7月7日</td><td> 5,5 </t<html> D&gt; </tr></tbody></table><img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> 図1。実験手順の全体的なスキーム。C57BL / 6マウスを、グラス-コルエアロゾルチャンバ内のMtb含有エアロゾル液滴に晒されている。一日のエアロゾル感染後のMtbの取り込みは、肺のCFU分析によって検証する。 40日（結核感染マウスでは慢性的になっています） マウンテンバイクチャレンジ後、動物をPにさらされているベルゲイは蚊を感 ​​染させた。成功したスポロゾイトの送信を確認し、 マラリア原虫感染の経過をたどるために、寄生虫は蚊に刺された後の3日間を開始ギムザ染色した血液塗抹標本で毎日監視されている。 / files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。蚊のケージのスケッチは、感染性の蚊は、ハーフパイントのアイスクリームのカートンとしてカートンの内部に収容されている。小さな開口部は、カートンの側面に切断し、蚊のための安全な入り口を作成するには、それぞれの作品に切ったスリットとラテックスの二重の層で覆われている。濾紙片を垂れを吸収するためにカートンの内底にテープで固定されている。アイスクリームのカップはテープとゴムバンドでカートンに固定されている（ナイロンメッシュ）ネッティングで閉鎖されています。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> 図3。寄生された赤血球（スケールバー、20＆＃を示すライトの`sのステンド血液塗抹標本の血液寄生虫。a）実施例181;。マウス血液中のm）B）寄生虫を毎日ギムザ染色血液塗抹標本を分析することによってモニターした。重複感染マウスは、 マラリア原虫単独感染マウス（n = 10）に比べて減少寄生虫を持っています。結果は、平均±SDとして示されているが、*** P &lt;0.001。 1 PLoSのONEの許可を得て7（10）、e48110より転載。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> 図4。肺内のマウンテンバイクの検出。C57BL / 6マウスを、エアロゾルマウンテンバイクの100 CFUでチャレンジし、40日後に、Pとの共感染された蚊に刺されによるベルゲイ 。A）ある日のエアロゾル感染後マウンテンバイク 、所望の数の取り込みは、CFU決定のために全肺ホモジネートをメッキすることにより確認した。B）細菌同時感染時のLの負荷は、CFU分析（d40/d0 のMtb）を介して3匹のマウスの肺溶解物において測定した。 12日の同時感染した後、肺溶解物を MTBコントロールのマラリアの重複感染の影響を判断するためにCFU分析に播種した。肺の中のMtb番号は、P.との同時感染の間に増加していることに注意してくださいベルグヘイ NK65。 X軸ラベル：同時感染後のMtb -infection/time後の時間。 1 PLoSのONEの許可を得て7（10）、e48110から適応。

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

結核、マラリア、人間と熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主要な原因の中で最も流行している感染症の2つです。我々は、感染の彼らの自然な経路を経て、両方の病原体攻撃後のマウスにおけるマラリア結核の重複感染の結果を研究するための実験的なモデルシステムを確立した。

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K ビュー.  University Hospital Heidelberg. 結核、マラリア、人間と熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主要な原因の中で最も流行している感染症の2つです。我々は、感染の彼らの自然な経路を経て、両方の病原体攻撃後のマウスにおけるマラリア結核の重複感染の結果を研究するための実験的なモデルシステムを確立した。 

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

免疫・感染学

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

の成長結核バイオフィルム

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

多剤耐性を実証<em&gt;結核菌</em&gt;増幅マイクロアレイ

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

回復への新規マイクロダイセクションアプローチ<em&gt;結核菌</em肺肉芽腫、ホルマリン固定パラフィン包埋から&gt;特異的転写

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...