この研究は、ICTの未来計画（認可番号2013M3C8A1075908）、科学省によって資金を供給、国立研究財団（NRF）の社会のためのR＆Dプログラムによってサポートされていました。

FFPE参照標準細胞株からのDNA抽出1 注意：この手順では、DNA抽出は、以下のプロトコールに記載されているようFFPE組織のDNA単離キットを使用してFFPE参照標準細胞株（HD598、HD593、HD617、HD273および野生型（WT））から行われました。自動化されたDNAの抽出は、全DNAの単離のための製造者の指示に従うことによって達成されました。 <ol><li>ミクロトームと元のFFPEブロックを使用して、手動で確立された手順に従って、DNA抽出の前および分析に新鮮な切片を作製。組織切片（複数可）は、分析のためのサンプル入力が10μmを合わせた全体の厚さを超えると、表面積は、単一のセクションの600ミリメートル2を超えないようにしていないことを確認してください。 </li></ol> 1.2 TPSプロトコル注：表1に示す体積が48のサンプルを処理するために必要な最小値に対応し、手順TPSガイドラインに従っても示されています。実験を開始する前に自動化されたプログラム中のサンプルの損失を回避するために、600×gで遠心分離することにより、電子管で​​FFPEサンプルを落ち着きます。 <ol><li>自動化されたDNA単離楽器とコンピュータの電源を入れます。実行制御ソフトウェアを開き、TPSデッキローディングエリアに自動ロードトレイを挿入します。 </li><li> 図1に示すように、それらに対応する谷に試薬を分注します。 <ol><li>サンプルキャリアラックに4つのサンプル（BRAF WT、BRAF V600E 50％、5％、1％）を配置します。 </li><li>列2および3に谷に先端ボックスを配置し、実行を中止しますチップごとに複数のフィルタの存在のためのヒントをご確認ください。 </li><li>彼らに3〜5回反転させることによって、溶解緩衝液および洗浄緩衝液の適切な混合を確認して、列4（ 図1）内の各谷にロードします。 </li><li>数回または軽度vortのために反転した後、exing、（ 図1、表1）に示される場合、空の1スロットを残して、列5の小さな谷に溶出バッファー、磁気ビーズ、およびFFPEバッファをロードします。 </li><li>プレートキャリア（ 図1）上に2ミリリットルディープウェルプレート（DWP）をロードします。 </li></ol></li><li>実行を開始する前に、以下の最終手順を実行します。 <ol><li>すべてのチューブおよび試薬トラフをキャップを取ります。十分な容量が廃液ボトルに使用可能であることを確認してください。固形廃棄物ボトルが空とバイオハザードバッグが並んでいることを確認してください。先端イジェクトプレートは廃棄物アセンブリの中央に配置されていることを確認してください。 </li><li>フロントカバーを閉じます。 </li></ol></li><li>ソフトウェアを起動します。 NA_Prep_Main_MLSTARlet.medファイルを開きます。 </li><li> 「開始」をクリックします。機器ステータスが実行中にアイドルから切り替わります。 </li><li>この実行のためのサンプル数を入力します。このラン（DNA = 0）のための所望の方法を選択してください。第一の高容量の位置を入力してください梅先端、すべてのトレイがいっぱいであれば「1」を選択します。すべてのトレイがいっぱいであれば「1」を選択し、最初の標準ボリューム先端の位置を入力します。 注意：機器は、ユーザーの介入なしに自動化された手順を介して実行されます。詳細なワークフローが図2に示されている。実験が終了すると、試薬の無駄やヒントは、廃棄アセンブリに注入されます。 </li><li>蛍光法を用いて精製したゲノムDNAを定量化します。 注：3.3 NG /μLの最小濃度を含むDNAサンプルをddPCR分析（セクシ​​ョン2）に供されます。 </li></ol> 2. DNA変異プロファイリング：ddPCRプロトコル注：1）液滴生成、2）従来のPCR増幅、3）液滴の読み取りおよび4）のDNA変異プロファイリング：DNA変異プロファイリングのためのプロトコルは、3つの主要なステップで構成されています。 2.1。液滴発生注意：ddPCRスーパーミックスですこのミックスは、液滴の生成に必要な試薬が含まれているとして、ddPCRにお勧め。 <ol><li>汚染を避けるために、このような管を、手袋を着用してクリーンなPCRフードを使用して、きれいなピペット、低タンパク質結合などの標準予防策に従います。 </li><li>ヒトゲノムDNAサンプルの最小濃度は3.3 ngの/μlであることを確認してください。注：精製DNA試料濃度の量は％突然変異頻度検出の分析に基づいて変化するであろう。 </li><li> 96ウェルPCRプレートに反応混合物を組み立てます。解凍し、RTに反応成分を平衡化します。 （として、各精製されたDNAサンプル（66ng / 2μl）を蒸留水で20μlに構成すると2倍ddPCRスーパーミックス（10μL）および20のプライマー（フォワードおよびリバース、900 nm）をプローブ（250 nM）を組み合わせることにより、PCR反応を準備）液滴発生器プロトコルあたり</li><li>分注前にチューブの底に内容物を集めるために均質かつ短時間遠心分離を確実にするために十分に混合し、ボルテックス。ロード20＆＃181;液滴形成用カートリッジにリットル。 </li><li>製造業者の推奨するプロトコルごとに液滴発生器の動作、 <ol><li>ホルダーの左上側に位置するカートリッジのノッチ付きホルダーにカートリッジを挿入します。底のウェルに中央にサンプルを含む反応混合物20μlの、および発電機油の70μLを追加します。 </li><li>カートリッジの上部にガスケットを取り付けます。ガスケットがしっかりとホルダーの両端にフックされていることを確認してください。そうでなければ、液滴生成のための十分な圧力が得られないであろう。 </li><li>楽器の上に緑のボタンを押して、液滴発生器を開き、カートリッジを挿入します。ホルダーが正しい位置にある場合、両方の電源（右、左）とホルダー（中央右）インジケータライトが緑色です。 </li><li>ドアを閉じるにはもう一度機器の一番上のボタンを押して、液滴生成を開始。注：Bを押した後utton、液滴が生成されるマイクロ流体チャネルを介して、オイルやサンプルを描く出口井戸の上にマニホールド位置自体、。彼らが蓄積どこ液滴は、十分に液滴内に流れ込みます。 （右の）液滴インジケータライトは、液滴の生成が進行中であることを示すために、10秒後に緑点滅します。 </li><li>液滴の生成が完了すると、すべての3のインジケータランプが緑色に変化します。ボタンを押してドアを開き、ユニットからホルダーを取り外します。ホルダーから使い捨てガスケットを取り外し、それを捨てます。注：カートリッジの上部のウェルは、液滴を含み、中段、下段ウェルは、残油を少量、ほぼ空になっています。 </li></ol></li></ol> 2.2。 PCRのための準備<ol><li>メーカーの機器のプロトコルに示されているように、各サンプルについて、推奨される96ウェルPCRプレートの1ウェルにトップだけでなく、カートリッジからの液滴の内容を40μlをピペット。ノーTE：マルチチャンネルピペットを使用すると、液滴エマルジョンを転送するための理想的です。液滴のゆっくりと穏やかな吸引は、転送時に液滴の剪断を最小化することをお勧めします。 </li><li>すぐに蒸発を避けるために、液滴を移送した後、ホイルでPCRプレートをシール。 PCRプレートシーラーと液滴リーダーに針と互換性のある穿刺可能なホイルプレートシールを使用してください。 PCRプレートシーラーの取扱説明書の指示に従ってください。 </li><li> 180°Cまでのプレートシーラーの温度と5秒までの時間を設定します。 </li><li>トレイのドアを開くために矢印をタッチします。 96ウェル側を上に向けてトレイに支持ブロックを置きます。支持ブロック上に96ウェルプレートを配置し、すべてのプレートのウェルを支持ブロックの位置が合っていることを確認してください。 </li><li>穿刺可能なホイルシールの1枚で、96ウェルプレートをカバー。 96ウェルプレートを支持ブロックに固定し、穿刺可能なホイルシールで覆われると、シール]ボタンをタッチします。トレイが閉じますそして、ヒートシールが開始されます。 </li><li>ヒートシールが完了すると、ドアが自動的に開きます。熱サイクルのヒートブロックからプレートを取り外した後、ヒートブロックを削除します。 </li><li>プレートのすべてのウェルは、箔で窪みを各ウェルの上に容易に明らかであることを確認することで密封されていることを確認してください。密封した後、プレートは、熱サイクルの準備ができています。 </li><li>液滴が除去された後、それを開くために、カートリッジホルダのラッチを押してください。空のカートリッジを取り外し、それを捨てます。 </li><li> 表2に詳述したパラメータに従って、従来のPCR増幅を行います。 </li></ol> 2.3液滴読書（メーカーの推奨プロトコルに従って） 注：液滴中の核酸標的のPCR増幅に続いて、液滴リーダ装置は、2色検出システム 13 を使用して個々の液滴を分析します。当社は通常、FAM ANを検出するように設定しますD VICレポーター蛍光団。 <ol><li>プライム液滴リーダーに「フラッシュシステム」をクリックして、ddPCR分析できる状態に。 </li><li>液滴リーダーにプレートをロードし、クリックして &quot;スタート&quot;液滴リーダーは、それぞれのサンプルを吸引液滴を個別化し、2色検出器を過ぎて単一のファイルにそれらをストリーミングします。検出器は、正と負のサンプルを列挙するために液滴を読み込みます。 </li><li>液滴読み込みが完了したら、ドアを開けてユニットからプレートホルダーを取り外します。ホルダーから96ウェルPCRプレートを取り外して、それを捨てます。 </li><li>適切なメンテナンスのために、液滴リーダーオイルを交換し、必要に応じて廃棄物容器を空にします。微生物の増殖を防ぐために、廃棄物ボトルに10％漂白剤を50mlを加えます。 </li></ol> 2.4 DNA変異プロファイリング（メーカーの推奨プロトコルに従って） 注：PCR陽性およびPCR陰性液滴は絶対quantificを提供するためにカウントされますデータ分析ソフトウェアを使用してデジタル形式で標的BRAF V600E DNA変異のエーション。 <ol><li>サンプル、アッセイ、および実験に関する情報を入力するために、セットアップをクリックします。 </li><li>セットアップウィンドウでは、プレート（filename.qlp）をロードし、データを開き、分析するための分析をクリックします。結果表、まあセレクタおよび処理されたデータ/グラフィカル表示：データ解析インタフェースは3つのウィンドウに分かれています。 </li><li>処理されたデータウィンドウで、各ターゲットの濃度データは、プレートマップのウェルに表示され、結果を表にまとめました。濃度のプロット内のデータを視覚化するために濃度をクリックしてください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. 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ミョンRyuriああ、Siのウンキム、ヤングDeugキムはABION CROの従業員です。

ここでは、特定の遺伝子変異の評価のためのFFPE参照標準セルラインサンプルからddPCRの適用性とDNAの分離を強調表示します。本研究では、TPS自動DNA単離方法は、容易に、自動化された適合させることができるが使用される、より大きな規模の実験と低い変動性を考慮して、同時に48の異なるサンプルまで収容することができます。本研究におけるDNA分離の制限の1つはすべてのFFPEサンプルはユ...

重要な調節遺伝子における遺伝的変異の蓄積は、癌1に至る、細胞増殖、分化、および生存のような正常細胞のプログラミングを変更します。 RAS-RAF-MAPキナーゼ経路は、増殖シグナルに対する細胞応答を仲介します。発癌性BRAF変異は2過活動になるために腫瘍性タンパク質BRAFを引き起こす可能性があるBRAF遺伝子内のドライバの突然変異に起因することができます。 BRAF遺伝子内の変異はまた、順番に、独立して成長因子により媒介される調節4-6の過剰な細胞成長および増殖をもたらし、MEKおよびERK 3を介して過剰下流シグナル伝達をもたらします。 いくつかのツールは、そのようなddPCRにより、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株における定量的リアルタイムBRAF V600E変異として、DNA変異プロファイリングのために利用可能です。 ddPCRは絶対定量のためのPCRベースの方法であり、従来の定量的リアルタイムPCR（qPCR）7,8と比較して、より高い精度を提供しています。 ddPCRは、より有益ながん研究と診断9を可能に 、DNAテンプレートでは珍しい変異の検出のためのより高い分解能と精度を提供します。低テンプレートコピー数10-12を研究する際、従来の定量PCRを超えるddPCRのさらなる利点は、その高感度と精度が含まれます。本明細書において、自動的にddPCRによってBRAF V600E突然変異の有無を決定することにより、その後FFPE参照標準細胞株からDNAを抽出するためのプロトコルが示されています。データ分析及び結果のグラフ表示のためのソフトウェアの使用方法も記載されています。全体の手順は比較的簡単で、完全にプロファイリングするサンプルの数と使用可能な従来のPCRとddPCRマシンの数によって異なります。 以下のプロトコルは、BRのための標準的な手順を説明します<html> AF V600E陽性FFPE参照標準細胞株（HD598、HD593、HD617、HD273および野生型（WT））は、組織調製システム（TPS）プロトコルを使用して完全に自動化された測定器で行われています。続いて、単離されたDNAサンプルをddPCRシステムを用いたBRAF V600E突然変異の存在について分析されます。すべての試料がプロファイルされた後、標的変異分析が実行され、データは、データ解析ソフトウエアにロードされています。サンプルの数に応じ/群を研究、データ分析は、1〜数時間必要とする場合があります。方法論の実験的な構成要素は、取り扱いの精度を必要と<a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Joveの科学教育ビデオは、RNAとの関連についての詳細を説明する、酵母から核酸を単離">するDNAを</a>し、rologicalピペット・ピペッター、ピペット操作の状況についての詳細を説明するJoveの科学教育ビデオ&quot;&gt; 96ウェルプレートにピペット操作、データ解析ソフトウェアを使用して実行されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

私たちのddPCR分析のために、我々は、BRAF V600E突然変異のFFPE参照標準細胞株を研究しました。液滴リーダはデータ分析ソフトウェアを実行しているラップトップコンピュータに接続します。各個々の液滴が正または負であるとして蛍光振幅に基づいて定義されます。製造業者によって提供されるソフトウェアは、ユーザー定義のカットオフは、正と負の液滴間の閾値を定義するために入...

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Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

このビデオの目的は、臨床の場で珍しい変異を検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株およびデジタル滴PCR（ddPCR）分析から、自動化されたDNAの抽出を実行する方法を実証することです。 FFPEサンプルにおける変異を検出することはFFPEサンプルでddPCRの臨床的有用​​性を示します。

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K ビュー.  Seoul National University. このビデオの目的は、臨床の場で珍しい変異を検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株およびデジタル滴PCR（ddPCR）分析から、自動化されたDNAの抽出を実行する方法を実証することです。 FFPEサンプルにおける変異を検出することはFFPEサンプルでddPCRの臨床的有用​​性を示します。 

ビデオ: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

生物学

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...