We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

1.一般的な考慮事項<ol><li>必要な試薬のリストについては、 マテリアル/機器の表を参照してください。厳格な無菌条件下で、すべての手順を実行します。 </li><li> FBSを含むすべてのメディアの準備のための熱不活性化ウシ胎児血清（hiFBS）を使用します。熱-不活性化するために、10分毎に反転、30分間56℃でFBS 50mlのアリコートを温める（ 表 1 参照）。 注：FBSを熱不活性化なしで使用される場合、上皮様表現型は、SH-SY5Y細胞の培養を通してより迅速に進行します。 </li><li>使用前に、メディアが温め、すべてのステップの前に、適切なpHバランスを確立するためのインキュベーターで平衡化することを可能にします。例えば、培地の50mlを完全に平衡化するのに約1時間かかり液（pH 7、37℃、5％CO 2）。 注：このプロトコルは、部分的に分化したSH-SY5Y細胞をトリプシン処理し、再メッキされている必要があり2段階の分割手順を使用しています。これはストレスが多いですこれらの非常に脆弱な細胞のためのプロセス。したがって、最小限の時間のために、トリプシンで細胞をインキュベートすることが重要です。これはまだ皿に付着した上皮様細胞を残して、ニューロンの優先リフトオフが可能になります。 </li><li>細胞を含有する円錐管の底部に対して先端と10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと分化した細胞のトリチュレーションを実行します。上下ない、低速で5倍以上のトリチュレーションを実行しません。 </li></ol> SH-SY5Yメンテナンス文化の2パッセージ<ol><li>細胞が70-80％コンフルエントに達しており、10〜15継代を超えない分割維持培養。培養物は、典型的には、（培養が分裂中に以上の5倍に希釈されていないと仮定して）3〜5日毎に継代する必要があります。 </li><li> T-75フラスコから継代細胞に、約10ミリリットル1×PBSですすぎ、その後、メディアを吸引します。 注：私たちは、SH-SY5Yメンテナンスの文化のfuを分割することはお勧めしません。1よりrther：5継代の間には、これは、細胞が低い密集度のために死ぬことを引き起こす可能性があるため。 </li><li>吸引し、PBS、その後、2.5ミリリットル0.05％トリプシン-EDTA（1X）を追加します。 </li><li>インキュベーター2-3分でインキュベートし、フラスコの表面から細胞を解放するために穏やかに転倒。 </li><li> 10ミリリットルの基本的な成長培地を追加します（ 表2を参照）、1-2回粉砕します。 </li><li>千×gで2分間スピンダウンし、培地を吸引し、次いで5ミリリットルの基本的な増殖培地でペレットを再懸濁。 </li><li> T-75フラスコ内で、通常のめっき用20ミリリットルの全容量に5、または分化（第5節）のためにカウントし、プレート：3から1：1から細​​胞を希釈します。 </li></ol> 3.凍結SH-SY5Y細胞<ol><li> 5％（v / v）のDMSOを補充した基本的な増殖培地中でSH-SY5Y神経芽腫細胞の早期継代の凍結。 </li><li>当初は、長期保存のために液体窒素に転送した後、24時間-80℃でアリコートを凍結します。 注：参考のために、コンフルエント（75から85パーセント）T-75フラスコは、5を得られます凍結するSH-SY5Y細胞を1mlのアリコート。これらのアリコートのそれぞれが総どこでも2から5万個の細胞が含まれている必要があります。 </li></ol> 4.解凍と文化未分化SH-SY5Y神経芽腫細胞<ol><li>基本的な増殖培地を準備します。 </li><li>急速に37℃の水浴（約2分）で凍結細胞を解凍します。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブ内の9ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁し、そしてその後、千×gで2分間遠心します。 </li><li>吸引し、ペレット化した細胞を妨害し、そして穏やかに10ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁させないように注意しながら上清。 </li><li> T-25フラスコまたは60ミリメートル2皿にプレート細胞。 </li><li>次の日は、死んだ細胞を除去するためにメディアを交換してください。 </li></ol> 5. 0日：分化のためのめっきセル<ol><li>分化スケジュールについては、図1を参照してください。 </li><li> 1×PBS、吸引と未分化細胞をすすぎ、その後、温めた1〜2ミリリットルを使用してトリプシン処理1倍、0.05％トリプシン-EDTA。 </li><li>細胞はトリプシンである場合に、インキュベーター内で約3分間インキュベートします。 </li><li> 、10ミリリットルの基本的な成長培地を添加することにより、トリプシンをクエンチフラスコまたは皿の側面を洗い流し、そして穏やかに1-3回を粉砕します。 15ミリリットルコニカルチューブにコンテンツを転送します。 </li><li>千×gで2分間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意しながら、メディアを吸引除去します。 </li><li> 5ミリリットルの基本的な増殖培地で再懸濁ペレットと1-3回粉砕します。 </li><li> 50,000細胞/ mlに基本的な増殖培地を用いて希釈した後、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 </li><li>プレート2皿当たり100,000細胞の合計のための35ミリメートル2ディッシュあたりの細胞mlのインキュベーターに戻し置きます。 </li></ol> 6. 1日目：メディアの変更（分化メディア＃1） <ol><li>分化メディア＃1のアリコート50mlを（ 表2を参照）、37℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>メディアが温められたとき、それは培養器に平衡化させる（37°Cで、5％CO 2）は、少なくとも1時間、使用前に適切なpHバランスを確立します。 </li><li>レチノイン酸（RA）を追加し、すぐに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。 注：レチノイン酸は光に敏感であり、4℃で暗所瓶に保存する必要があります</li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li> 35ミリメートル2ディッシュあたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加し、インキュベーターに戻します。 </li></ol> 7. 3日目：メディアの変更（分化メディア＃1） <ol><li>繰り返しセクション6（1-5ステップ） </li></ol> 8. 5日目：メディアの変更（分化メディア＃1） <ol><li>繰り返しセクション6（1-5ステップ） </li></ol> 9. 7日目：セルの分割1：1 <ol><li>すぐに料理にメディアを追加する前に分化メディア＃1を温めて、平衡化するためにRAを追加します。 </li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li> 200μLを加えます35ミリメートル2ディッシュあたり0.05％の1xトリプシンEDTAを温め、約2〜3分または細胞までは目に見えて、顕微鏡下で観察されるようにプレートから持ち上げられるインキュベーターで暖かいです。 </li><li> 35ミリメートル2皿あたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加することにより、トリプシンをクエンチ そしてプレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。 注意：トリプシン処理手順の間に、一度にあまりにも多くの料理をトリプシン処理しません。これは、神経細胞培養は、細胞毒性であることができる、あまりにも長い間、トリプシン中でインキュベートされないことを保証するのに役立ちます。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、静かにアップなしの5倍以上ダウン10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと摩砕。 </li><li> 35ミリメートル2新鮮な料理とインキュベータへの復帰へのアリコート2ミリリットルの細胞懸濁液。 </li></ol> 10. 8日目：変更メディア（分化メディア＃2） <ol><li> RAを追加します（参照&lt;すぐに料理にメディアを追加する前にメディアを温めて、平衡化するための強力な&gt;表1）。 </li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li>ゆっくりと2 mLの分化メディア＃2を追加します（ 表2参照 ） 35ミリメートル2皿当たりRAと、インキュベーターに戻します。ニューロンは、彼らはすぐに乾燥させることができるように長期間にわたって大気に曝されないようにしてください。 </li></ol> 11. 9日目：細胞外マトリックス（ECM）を準備コートディッシュ<ol><li>氷上でECMソリューションの1つのバイアルを解凍し、1を希釈：100を冷たいDMEMに。 </li><li>各35ミリメートル2皿に混合物の2ミリリットルを分配し、皿のベース全体が覆われていることを確認します。 </li><li>一晩で1時間またはインキュベーター（37℃、5％CO 2）内の場所。 </li><li>吸引した混合物とフードで約1時間、空気乾燥させ。最大2ヶ月間室温で保管してください。 </li></ol> 12日10：転送細胞にECMコーティングプレート1：1 <ol><li> RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。 </li><li>静かにメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li>各35ミリメートル2皿にトリプシン温め200μlを添加して、約1〜2分間、またはニューロンが目に見えて、顕微鏡下で観察されるように皿から持ち上げられるまで室温でインキュベートすることができます。 注：トリプシンニューロンを過剰インキュベートし、損傷が発生しないように室温でこのトリプシン処理ステップを実行します。ニューロンは、この段階で上皮様細胞よりもはるかに高速プレートから離します。 </li><li> 35ミリメートル2皿当たり2ミリリットル分化メディア＃2を追加することにより、トリプシンをクエンチし、プレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、優しくまでととせいぜい5回上下にゆっくりと粉砕します10ミリリットルプラスチックピペット。 </li><li> ECMコーティングされた35ミリメートル2皿に2ミリリットルの細胞懸濁液を分注し、インキュベーターに戻します。 </li></ol> 13.日11：メディアの変更（分化メディア＃3） <ol><li> RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。 </li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li>ゆっくりと35ミリメートル2ディッシュあたりRAと（ 表2参照 ）2ミリリットル分化メディア＃3を追加し、インキュベーターに戻します。ニューロンが長時間空気中に露出することはできません。 </li></ol> 14日14：メディアの変更（分化メディア＃3） <ol><li>繰り返しセクション13（1-3ステップ） </li></ol> 15.日17：最後のメディアの変更（分化メディア＃3） <ol><li>繰り返しセクション13（1-3ステップ） </li></ol> 16.日18：使用する準備ができて神経細胞培養<ol><li>新鮮な差分にメディアを変更3日ごとにRAとerentiationメディア＃3は、ニューロンの健康を維持します。 注：細胞は、神経細胞に分化し、神経細胞の表現型を示すべきです。培養物は、しかし、ニューロンの生存率の持続時間は分化の開始時に未分化細胞の継代回数に依存して、最終分化次の14日まで一般的に安定しています。高い継代数は、より短い耐用寿命と分化したニューロンをもたらします。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

上記のプロトコルは、均質かつ実行可能な人間の神経細胞培養を生成するための簡単​​で再現性のある方法を提供します。このプロトコルは、いくつかの以前に公開された方法1-4を統合手法と実践を利用し、それぞれのベストプラクティスを描写することを目指しています。 SH-SY5Y細胞の分化は、緩やかな血清欠乏に依存しています。レチノイン酸、神経栄養因子および細胞外マト...

ビトロモデル系で使用する能力は、神経生物学と神経科学の分野を大幅に強化しました。培養中の細胞は、タンパク質の機能と特定の現象の根底にある分子メカニズムを特徴づけるために病気や感染症の病態を理解するために、予備薬物検査の評価を実施するための効率的なプラットフォームを提供します。神経生物学では、細胞培養モデルの主要なタイプは、ラットB35細胞5、ニューロ2Aマウスセル 6、およびラットPC12細胞を7としてラットおよびマウス、および神経芽細胞腫細胞株に由来する初代神経細胞培養物を含みます。このような細胞株の使用が大幅にフィールドを進めているが、非ヒト細胞および組織を処理に関連するいくつかの交絡因子が存在します。人間と比較した場合、これらは理解種特異的代謝過程の違い、病気の症状、および病原性の表現型が含まれます。ことに注意することも重要です再齧歯類モデルおよび経路は、げっ歯類およびヒト8-11との間で保存されているの理解の重要性の限界を強調し、マウスとヒトの遺伝子発現と転写因子のシグナル伝達の間に有意な差です。他のものはN-テラ-2（NT2）ヒト奇形癌細胞株および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を含むヒト神経細胞株の使用を採用しています。これらの細胞株は、 インビトロでのヒト・システムのための優れたモデルを提供します。しかしながら、レチノイン酸（RA）、ニューロン、星状細胞の混合集団の発生をもたらし、さらなる精製工程を必要と放射状グリア細胞12とNT2細胞の分化は、ニューロンの純粋な集団を得ました。また、NT2細胞は、細胞の72％より大きい60染色体で、非常に可変性核型13を示しています。性IPSCは、異なる細胞株の間の区別の変動を示し、分化効率が変化します<html> 14。これらの選択肢を補完するために一貫して再現性のヒト神経細胞モデルを有することが望ましいです。 SH-SY5Y神経芽細胞のような細胞は、親の神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHのサブクローンです。親細胞株は、神経芽細胞様および上皮様細胞15の両方含ま骨髄生検から、1970年に生成されました。 SH-SY5Y細胞は、47の染色体からなる、安定な核型を有し、かつ異なるRAの使用を含む機構、ホルボールエステル、およびそのような脳由来などの特定のニューロトロフィンの様々を通して成熟ヒトニューロンへの神経芽細胞のような状態から区別することができます神経栄養因子（BDNF）。前の証拠は異なる方法の使用は、アドレナリン作動性、コリン作動性、およびドーパミン作動性ニューロン16,17のような特定のニューロンのサブタイプに選択できることを示唆しています。この後者の側面は、神経生物学実験の多数のためのSH-SY5Y細胞が有用となります。 ontent &quot;&gt;いくつかの研究は、未分化および分化した状態で、SH-SY5Y細胞との間の重要な違いを指摘している。SH-SY5Y細胞が未分化である場合、それらは急速に増殖し、非常に少数の、短いプロセスと、非偏光であるように思われる。彼らは多くの場合、成長します塊および分化、これらの細胞は増殖の減少、長く、分枝プロセスを拡張し、場合によっては2,18を偏光する。未成熟ニューロン18,19を示すマーカーを発現する。完全に分化したSH-SY5Y細胞は、以前に発現することが実証されています成長関連タンパク質（GAP-43）、ニューロン核（NeuNの）、シナプトフィジン（SYN）、シナプス小胞タンパク質II（SV2）、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）と微小管関連タンパク質（MAP）を含む成熟ニューロンの異なる様々なマーカー2,16,17,20、および4。SH-SY5Y細胞の分化をさらに支持するものreprese例えばグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）のようなグリアのマーカーの発現を欠いているためにntの均質なニューロン集団は、BDNFの除去は、細胞のアポトーシスを4になります。これは、分化したSH-SY5Y細胞の生存は、成熟ニューロンに類似栄養因子に依存することを示唆しています。 サブクローンは、1978年3に設立されて以来、SH-SY5Y細胞の使用が増加している。その使用のいくつかの例としては、パーキンソン病17、アルツハイマー病21、およびポリオウイルス22などのウイルス感染症の病因、エンテロウイルス71（EV71）23,24を調査含ま、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）1、ヒトサイトメガロウイルス25、および単純ヘルペスウイルス（HSV）2,26。 SH-SY5Y細胞を用いたいくつかの研究は、特に神経ウイルス学27-36の分野において、その未分化形態において、これらの細胞を使用していることに留意することが重要です。分化したSH-SY5Y細胞対未分化の観察された表現型の違いは、WHEの問題を提起しますTHER感染の観察進行が成熟分化したニューロンで異なるだろう。例えば、分化したSH-SY5Y細胞は、原因HSVに結合し、未分化SH-SY5Y細胞2のエントリを調節する表面受容体の欠如にすることができる未分化、増殖するSH-SY5Y細胞に対するHSV-1の取り込みのより高い効率を有します。 in vitroでのニューロンのテストに焦点を当てた実験を設計する際に、SH-SY5Y細胞をin vivoモデルに変換し、比較のために最も正確な結果を得るためには区別されるべきであることが重要です。 ヒトニューロン培養物を生成するための信頼できる方法の開発は、研究者は正確に人間の神経系をモデル化する翻訳実験を実行することを可能にするのに不可欠です。ここで紹介するプロトコルは区別されている人間の神経細胞を濃縮するために、従来の方法1-4由来のベストプラクティスを描く手順ですレチノイン酸を使用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">B-27</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">17504-044</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:141px;">Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">D0627</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">DMSO</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">4-X</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:141px;">Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">M5650</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">GlutamaxI</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">35050-061</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Glutamine</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:141px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP366-1</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:141px;">MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">E0282</td>
			<td style="width:232px;">See step 11 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">21103-049</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:141px;">Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15140-122</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Retinoic acid (RA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">R2625</td>
			<td style="width:232px;">Should be stored in the dark at 4&#176; C because this reagent is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">SH-SY5Y Cells</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-2266</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">0.5% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15400-054</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:141px;">Falcon 35mm TC dishes</td>
			<td style="width:141px;">Falcon (A Corning Brand)</td>
			<td style="width:133px;">353001</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

現時点では、未分化SH-SY5Y細胞は、ヒトのニューロン27-36のための機能モデルとして使用されている神経生物学と神経ウイルス学の分野で多くのインスタンスがあり、重要なのは、未分化細胞である、そのような最適なウイルスの取り込み2のような表現型を欠いてもよいです正確な解釈のために必要な。 SH-SY5Y細胞または他のin vitroの神経系を使用する場合、細胞は適切?...

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Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

70.7K ビュー.  The Pennsylvania State University. It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications. 

ビデオ: Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is to efficiently revert lineage-primed, conventional human pluripotent stem cells (hPSC) maintained on either feeder-free or feeder-dependent conditions to a na&#239;ve-like pluripotency with improved functionality. This chemical na&#239;ve reversion method employs the classical leukemia inhibitory factor (LIF), GSK3&#946;, and MEK/ERK inhibition cocktail (LIF-2i), supplemented with only a tankyrase inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverts conventional hPSC to a stable pluripotent state adopting biochemical, transcriptional, and epigenetic features of the human pre-implantation epiblast. This LIF-3i method requires minimal cell culture manipulation and is highly reproducible in a broad repertoire of human embryonic stem cell (hESC) and transgene-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. The LIF-3i method does not require a re-priming step prior to the differentiation; N-hPSC can be differentiated directly with extremely high efficiencies and maintain karyotypic and epigenomic stabilities (including at imprinted loci). To increase the universality of the method, conventional hPSC are first cultured in the LIF-3i cocktail supplemented with two additional small molecules that potentiate protein kinase A (forskolin) and sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signaling (LIF-5i). This brief LIF-5i adaptation step significantly enhances the initial clonal expansion of conventional hPSC and permits them to be subsequently na&#239;ve-reverted with LIF-3i alone in bulk quantities, thus obviating the need for picking/subcloning rare N-hPSC colonies later. LIF-5i-stabilized hPSCs are subsequently maintained in LIF-3i alone without the need of anti-apoptotic molecules. Most importantly, LIF-3i reversion markedly improves the functional pluripotency of a broad repertoire of conventional hPSC by decreasing their lineage-primed gene expression and erasing the interline variability of directed differentiation commonly observed amongst independent hPSC lines. Representative characterizations of LIF-3i-reverted N-hPSC are provided, and experimental strategies for functional comparisons of isogenic hPSC in lineage-primed vs. na&#239;ve-like states are outlined.

We present a protocol for efficient, bulk, and rapid chemical reversion of conventional lineage-primed human pluripotent stem cells (hPSC) into an epigenomically-stable na&#239;ve preimplantation epiblast-like pluripotent state. This method results in decreased lineage-primed gene expression and marked improvement in directed multilineage differentiation across a broad repertoire of conventional hPSC lines.

従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...