DMKは、バージニア・コモンウェルス大学にNIGMS（K12GM093857）からIRACDAの助成金によってサポートされていました。この作品は、ジョンR.グライダーにNIDDKDグラントDK34153によってサポートされていました。

バージニアコモンウェルス大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、このプロトコルで使用されるすべての動物や安楽死の手順を承認しました。 ソリューションの調製<ol><li> （：118のNaCl、4.75のKCl、1.19 KH 2 PO 4、1.2 硫酸マグネシウム、2.54のCaCl 2、25のNaHCO 3、11グルコース[mMの中]で構成）クレブス緩衝液4リットルを準備します。 、各固体化学物質の適切な量を計量し、脱イオン水の適切な量に入れ、溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜます。 </li><li> 37℃に加熱しながら、30分間carboxygenの溶液（95％O 2、5％CO 2）を通気。 </li><li> HClを用いて、必要に応じて、37℃（器官槽と同じ温度）でpHを7.4に調整しながら、溶液のpHを決定します。実験期間を通してクレブス緩衝液を連続的carboxygenated、37℃で保管してください。 </li><li>入れバッファ容器への蠕動ポンプからの流入と流出管とチューブとオルガンバスシステム全体のバッファの灌流を開始するために蠕動ポンプをオンにします。 注：バッファが最初に潅流バッファに器官浴や化学物質へのいずれかの組織の追加まで、元の容器に戻し圧送することができます。これは、実験のために必要なバッファの総量を減らすことができます。入って来ると発信バッファが混在しないように、そして、発信バッファ灌流ラインが空の容器の中に配置する必要があります。 </li><li>器官浴内のバッファになり、実験の期間中、37.0±0.5°Cのままであるように風呂サーキュレータに加熱システムの温度を調整します。確認し、必要に応じて、少なくとももう1つの時間ステップ2.8で浴に組織セグメントを配置する前に、クレブス緩衝液のpHを変更します。 </li></ol>組織の調製<ol><li>安楽死させます密閉されたチャンバー内の二酸化炭素吸入/窒息またはローカル動物のケアと使用委員会によって承認された別の安楽死法を用いてモルモット。 </li><li>動物の安楽死を確認した後、解剖ハサミで縦方向に腹壁を開き、腸を探しカット。盲腸を露出させる助けるために小腸に添付腸間膜をカットします。 注：動物のケアと使用委員会によって承認された安楽死を確認するためには、二国間の開胸術などの二次の手順を実行します。 </li><li>盲腸の先端を見つけ、盲腸との接続にちょうど遠位近位結腸を横断。そして、最初の切断に近接結腸再び~8センチ先端を横断。 </li><li>さらに解剖のために（セクション1に記載）温め、carboxygenatedクレブス液に結腸組織を置きます。解剖浴にコロンをピンとできるだけ多くの腸間膜脂肪を除去するために、はさみの小さいセットを使用します。 </li><li>時間でeated解剖トレイ、平滑末端のカテーテルに連結された注射器を用いて内腔を通ってクレブス緩衝液の優しく灌流により、すべての管腔内コンテンツを削除する（組織の穿孔を防ぐため）。この灌流プロセス中にセグメントの過膨張は避けてください。 </li><li> 2火災研磨ガラス管のカテーテル（3 mmの直径）を入手し、組織内腔に入るガラス管の部分の周りにポリエチレンチューブの短い断片（〜3 mmの長さと〜3 mmの直径）を配置します。 注：これは、縫合糸は安全なままに組織し、ガラス管の周りに配置され、準備が臓器浴にし、組織の長さの変化の間に置かれているように滑らないことを可能にします。 </li><li>組織標本の経口最後に1つのカテーテルを挿入し、外科医の結び目を使用してカテーテルを囲むチューブの小片を中心に縫合糸を結びます。ゆっくり結び目がぴったりであることを確認するために戻って出てカテーテルを引くしようとします。その後、他のカテーテル入るトンで同じアクションを実行します彼は、組織の終わりを尾方。 </li><li>カテーテルが固定されると、器官槽のいずれかに解剖トレイから製剤全体（組織プラスカテーテル）を移動。ユーザから離れて直面している経口端に浴に準備を置きます。 </li><li>次に2を示唆のいずれかの方法で器官槽にガラス管のカテーテルを固定/マウント。 注：ガラス管は実験中に長さを変更したり、浴中のクレブス緩衝液の表面レベルの上に来てからの組織セグメントを防ぐセキュリティ保護。 <ol><li>オプションA：成形機の粘土やプラスチックのクリップを使用することによりプラスチック臓器槽の側面の上部にガラス管の上部を固定します。 </li><li>オプションB：プラスチッククリップを使用することにより、臓器浴剤の上にカメラを保持する金属極にガラス管を固定します。 </li></ol></li><li>カテーテルは風呂に固定されると、各カテーテルの開放端にチューブの5 cmの作品を添付します。経口猫のためのheterは、近位結腸セグメントの内腔にバッファを注入するために使用される10-mlシリンジ、このチューブを取り付けます。尾方カテーテルは、チューブのこの作品は、管腔の流出が回収容器（50ミリリットルのビーカー、貯水池など ）に向けられるようになります。 </li><li>経口端部に取り付けられた注射器を使用して、ゆっくりとフラッシュは、組織を通って流れることができる液体を確実にするために、組織内腔を通してクレブス緩衝液を加温しました。フローは、尾方カテーテルから出る液体によって確認されます。組織を30分間平衡化しながら、録画システム（プロトコルセクション3）を調整します。 </li></ol>ビデオ記録システムの3キャリブレーション<ol><li>明るさとコントラスト、およびソフトウェアを使用して水平方向の距離をカメラの高さの配置、ビデオ設定を較正します。 注：腔内灌流のセットアップに最適な設定は、ペレット推進13の速度を決定するために使用される設定とは異なります。 </li><li> CLIカメラのための実験のタブのCKを校正​​します。そして、「ファイル」メニューの「キャリブレーションを]をクリックします。 </li><li>ビデオは「キャリブレーションワークステーションのウィンドウに表示されたら、画像が結腸内腔に挿入されたカテーテルの先端を含んでいる高さにカメラを設定します。 </li><li>次に、それぞれのバスに接続されている半透明の定規ステッカーを使用して、画像で見て水平方向の距離を調整します。 注：このキャリブレーションは、管腔直径と収縮波の速度の後のソフトウェアの計算に不可欠です。 </li><li>彼らはカメラ画像における支配者によると10ミリメートル離れているように、同じ「校正ワークステーションのウィンドウで、赤い垂直のガイドラインを設定します。次に、「距離カーソル」ウィンドウに適切な距離（10ミリメートル）を入力し、「CAL」ボタンをクリックします。 </li><li>次に、利得、明るさ、およびそのようにカメラ画像を変更するために「較正ワークステーション」ウィンドウ内でスライダをシャッターを調整します組織セグメントは、明るい背景に暗いシルエットとして表示されます。 メモ ：図4は、このキャリブレーション手順の良い面と悪い例を示します。 </li><li>画像を適切に調整するには、また、カメラ自体にフォーカスや絞りのつまみを調整します。 </li><li>キャリブレーションが完了しました。 [保存]をクリックし、ポップアップで「OK」をクリックし、最後に「終了」ボタンをクリックします。 </li></ol> 4.一般的な実験手順<ol><li>カメラキャリブレーション手順と組織の平衡の30分が完了した後、各実験プロトコルで裁判に名前を付けます。トライアル名を名前と化合物と液体の体積の濃度に基づいてすることができる管腔内実験の部分の間に組織セグメントに灌流されます。 </li><li>その後、チューブのクランプを使用することにより尾方カテーテルから突出したチューブを閉塞。 注：これは、府中尾方端から出るの管腔内の液体を防ぎますrther実験、膨満の様々なレベルを誘発するためにルーメン内の特定のボリュームの使用を可能にする（ 図1）。 </li><li>モルモットex vivoでの準備の推進収縮を開始するのに十分な膨張を提供するために、近位結腸内腔に約0.7ミリリットルクレブス緩衝液のを注入。 注： - 無傷のセグメントおよび器官槽内のセグメントに適用されるストレッチの量の全体の長さに応じて（0.2ミリリットル0.1）このボリュームは若干異なる場合があります。 </li><li>セグメントは管腔の流体によって膨張されると、カメラの電源をオンにして、時間の予め決められた期間（ 例えば、10分）のための運動を記録します。 <ol><li>具体的には、実験的なカメラビューを開き、カメラのフィールドを表示するには、 &quot;ON&quot;の位置にトグルスイッチをクリックし適切な名前トライアルをダブルクリックします。そして、記録を開始するために、録音ボタンをクリックします（カメラが記録している間に録画ボタンが赤のままになります）AND録音を停止するには、もう一度録音ボタンをクリックします。 </li></ol></li><li>この初期制御膨満試験の終了時に、緩め/組織セグメントは、内腔の外に膨らませる液体を推進できるように、尾方カテーテルを閉塞するクランプを取り外します。 </li><li> 10分間の再平衡期間の後、セグメント（ 例えば、短鎖脂肪酸またはデカンの推進運動性を変更するために管腔の流体中の栄養素、生物活性剤、薬剤、またはアゴニスト/アンタゴニストの種々のでこの手順を繰り返し酸）10,18。 <ol><li>バブルの進行結腸内腔への新たなソリューションの灌流時にユーザが時実験流体を知ることができるようになりますように、新しい実験的な流体は、結腸セグメントに入ったときにゲージを支援するために、注射器の港の近くに気泡を残します内腔に達しています。 </li><li>バブルはを完全に押されたまで開い尾方カテーテルを用いて管腔内灌流を続行管腔潅流システム（灌流液2〜3mlのが必要な場合があります）。その後、組織セグメントが最大5分間開いた尾方カテーテルを通して流体を排出することができます。 注：この手順の後、内腔は内腔に液体の既知の体積の灌流を可能にすること、流体の無視できる量が含まれています。 </li></ol></li><li>シリンジを介して制御条件のように流体を膨らませるのと同じ量を注入する（ステップ4.3のように）、チューブクランプを使用して、尾方管腔カテーテルチューブを再閉塞。後で分析と（ステップ4.5のように）制御クレブス条件との比較のために実験期間中の運動パターンを記録します。 </li><li>繰り返しセクション4.4 - 異なる管腔の化合物または同じ管腔化合物の濃度の異なるプロトコルの4.7。 </li></ol> 5.時空間マップの構築（STmaps） <ol><li>実験の記録が完了した後、分析風を開くために、特定の試験の名前をダブルクリックしますOW STMAPの建設のため。 </li><li>ビデオ再生エリア内では、分析のための画像が適切にするために、分析ウィンドウでコントラストと明るさスライダを調整し（明るい背景に黒い組織シルエット; 図4）。 注：カメラキャリブレーションは、画像のみ、この時点ではより少ない程度に変更することができ、実験を開始する前に、適切に行われなかった場合。 </li><li>画像が適切に対比されると、分析のための組織領域を分離し、成果物を含む領域を削除するには、ビデオ画像のウィンドウ内で水平方向と垂直方向の赤のガイドラインを設定します。また、開始を決定することによって、記録から適切な時間セグメントを選択し、分析のための時点を停止します。 <ol><li>具体的には、解析ソフトの中に緑色の「A」、黄色の「B」ボタンを使用して、ビデオ内の開始点と終了点を選択します。分析するためにビデオセグメントの先頭にタイムスライダを設定し、nは緑の &#39;&#39;ボタンをクリックします。その後、分析し、黄色の「B」ボタンをクリックするセグメントの最後にスライダーを設定します。 </li></ol></li><li>次に、STMAPウィンドウを開き、「ストップウォッチ」ボタンをクリックして「モータ分析]タブをクリックします。ストップウォッチをクリックした後、次のSTMAP生成を開始するために記録された映画の中の組織の黒いシルエットの中に十字線カーソルをクリックします。 </li><li>組織シルエットで十字線をクリックすると、ソフトウェアが生成し、ビデオのその地域のSTMAPが表示されます。 注：これは、分析のために選択したビデオの長さに応じて数分かかることがあります。 </li><li>画像を調整するSTMAPとコントロールの拡大画像を表示する「ズーム」をクリックします。 <ol><li>代わりにグレースケールの色としてSTMAPを表示するには、新しく作成されたウィンドウ内の「色」オプションをクリックします。また、マップやV内の特定のピクセルにカーソルを置くことができるように「有効にする」オプションをクリックしますその特定の組織領域のための管腔直径の変化の追跡IEW。完了したら、[終了]をクリックします。 </li></ol></li><li>論文やプレゼンテーションに使用するためにSTMAPをエクスポートまたはその後「メタファイルを &#39;&#39;データのエクスポート」を選択し、続いて「ファイル」メニューを選択することで、ImageJの中でさらに分析すること。その後の.emfファイルとして保存されますSTMAPを、名前を付け、「保存」ボタンをクリックします。 </li><li>代わりに、スクリーンショットをキャプチャすることにより、STMAPの画像を保存します。これは、STMAPの擬似カラーバージョンを保存することが必要です。 </li></ol> STmapsで収縮波速度の6分析<ol><li>収縮の伝播や収縮持続時間の速度を分析するために、最初.TIFF、.GIF、.JPG、または任意のファイル変換プログラムを通じてImageJのに受け入れられるの.bmpフォーマットにSTMAPの.emfファイルに変換します。 注：ImageJのソフトウェアからSTmapsのの.emf形式の出力を開きません。 <ol><li> Alternativエリー、画面上のSTMAPの写真を取り、適切なファイル形式で保存するためにスクリーンショットのキャプチャソフトウェアを使用しています。 </li></ol></li><li>その後、ImageJの中に再フォーマットされたSTMAPを開き、「プラグイン」メニューと選択」GIMMProcessorを開いてGIMMProcessorプラグインを開きGIMMProcessor」と「測定値表」の窓」。これは、両方を開きます」。 </li><li> ImageJのウィンドウ内で「長方形選択ツール」をクリックし、STMAPの右上隅にあるスケールバーの全領域をクリックしてドラッグすることで概要を説明するために使用します。その領域を選択した後、プラグインで「セットのキャリブレーション」ボタンをクリックします。最後に、スケールバー上の値に応じて、キャリブレーションボックスに適切な距離（mm）でと時間（秒）を挿入し、「完了」をクリックします。 </li><li>次に、ImageJのウィンドウでライン描画ツールをクリックします。目の角に沿って伝播する収縮の中心を通ってSTMAPに線を引きますクリックしてSTMAP画像上にドラッグすることで、電子スロープ。代わりに、収縮持続時間を決定するために、非伝播収縮のバンドを通して垂直線を描画します。 </li><li>行は（唯一の行が一度に描画される場合があります）適切に描画された後、水平距離、垂直距離、及び直線の傾きの読み出しを生成するプラグインで「測定を行う」ボタンをクリックします。それぞれ長さ（mm）、時間（秒）、速度（mm /秒）に対応します。このデータは、「測定値を表」ウィンドウに表示されています。 </li><li>線画を繰り返し、分析は、与えられたSTMAP内で複数回のステップと.gmdファイルとしてデータを保存します。プラグインで「保存」ボタンをクリックし、ファイルに名前を付けます。次に、プロセスを完了するために、再度「保存」をクリックします。これらのデータは、後に他の試験データまたはSTMAPで使用するために再描画線と比較することができます。 </li></ol>

Catamount Research and Development, Inc., creator of the GIMM system, covered publication fees for this manuscript.

腸運動は、記録されたパラメータの性質に基づいて、視点の数から見て説明してきました。ビデオ録画と時空間マッピングは、セグメントに沿った特定のポイントで腸の長いセグメントにわたる全体的な動きおよび/または推進の分析だけでなく、活性の分析を可能にする貴重なツールであることが分かっています。録画時空間マッピングに取られたアプローチは二つあること、検査部位の反射および管腔内容の性質であることができます。コンテンツは、より半固体である場合管腔内容物はより液体および近位結腸である腸セグメントにおいて、活性は、ボーラスまたは注入による流体の管腔内導入によって誘導されます。これらのビデオ記録から作られた時空間マップは、上述したように、全体のセグメントの動きを表現するように設計されています。これとは対照的に、内容がより固体である遠位結腸に半ばに、活動は糞便PELLEを挿入することにより開始されますトン（エポキシは自然ペレットまたは人工ペレットを被覆した）と時空間マップはホフマンらのJOVEの記事に示すように、コロンを通ってペレットの動きを反映するように設計されている。13。このように、実験と解析の設定が重要であると研究されて刺激し、地域のタイプに依存します。したがって、流体誘発性腸運動の時空間マップの生成と分析のための重要なステップは、次のとおりです。解剖組織からの腸間膜の1）適切な除去; 2）記録前の適切な画像校正。 STMAPの生成と分析の間のアーティファクトの3）適切な除去; 4）分析システムの適切なセットアップ。及び5）カテーテルを挿入し、それらを損傷することなく、セグメントを縫合するための手先の器用さを増し。 管腔直径のSTmapsの使用は腸の領域にわたって完全な運動パターンを視覚化し、分析する能力を向上させているがと組み合わせると、技術が使用されている最高の圧力や筋肉の収縮2,15,20の機能測定。例えば、いくつかの筋肉の収縮がわずかに管腔直径を変更し、いくつかのSTmaps（ すなわち、筋原リップル）上に表示され、彼らが実際に腸の内容物25の任意の推進や混合を引き起こさないことがあります。これは、他の機能の測定値にこの技術のカップリングなしに知ることができません。また、（ポンプシステムによって、すなわち、閉じた管腔システムまたは一定腔灌流）このタイプのシステムの多くの組織調製物の性質はSTmaps内のアーチファクトにつながります。これにより、ユーザは、その特定の臓器の準備と実験が起因する組織の無力にデータとデータ分析では、これらのアーチファクトを回避または除外する方法でアーティファクト（例えば、腸間膜に誘発される垂直線や暗いピクセル化につながることができる方法を知っていなければなりません）閉じた管腔準備でシステムから流体を排出します。管腔灌流のための複数の方法があります。クローズドシステムに加えて、腸のセグメントをタクト。一つの方法は、代わりに調製8-10,30の肛門端に上昇管および/ ​​または一方向弁を使用することによって一定の管腔内/背圧を維持する開放系を使用することです。これは、流体が推進収縮時に準備の外に移動することができます。 システムは管腔直径の変化を検出するために、主にセットアップされているように、非常に管腔直径に影響を与えないもの収縮や運動パターンは、多くの場合、このプロトコルによって可視化することは困難です。 STMAP内のピクセルシェーディングの変化は管腔直径の変化に基づいているため、強力な収縮も同じ記録内に存在している場合、直径の大きな変化を生じない運動パターンは、この方法でうまく可視化されることはありません。近いトンの録画で分析線を設定し、リップル型の収縮（ 図3）の可視化および解析のために記載したようO組織壁は、この問題を回避することができます。最小限にしか組織径を変更収縮を可視化することができるように、この方法は、STMAP内に表示される最大直径を減少させます。この問題を解決するための別のオプションは、小さい収縮がより容易に可視化されるように大きく、管腔の直径に影響を与える収縮を排除するために、分析されたビデオセグメントの継続時間を変更しています。これは、最小限の収縮が大きく管腔直径を変えた個別のSTMAPに似て探して管腔直径が変化する運動性の潜在的な問題につながります。地図上の白画素の決意は、所与のビデオ内の最小直径に基づいているからです。ビデオ内の直径がはるかに変動（円筋肉のほとんど、あるいは全く収縮）が存在しない場合は非常に準備の直径を変更しない、非常に小さい収縮は別のビデオから蠕動収縮に似て見ることができます。したがって、図を考慮することが重要ですマップの右上の伝説。最大値と最小直径の差が小さい場合には、それは、STMAPに示すように、画素の濃淡変化の妥当性を判断するために生成されたビデオにSTMAPを比較することが重要です。したがって、実際の記録と併せてスケールバーの検査では、マップの解釈を修正することが重要です。 30、ラット7,9,30 - - 33、モルモット5,6,8,13 -ビデオ録画と腸および結腸セグメントの時空間マッピングは、ゼブラフィッシュ26、マウス25,27を含む様々な種に適用されている19、 24,30,32,34,35、brushtailのポッサム12,36、ウサギ2,30,37,38、鶏39、豚40,41と人間42。最も広く研究されている種モルモットです。これは、モルモット腸神経系のHので、驚くべきことではありません最も完全に特徴付けられて歴史的に、それはほとんどの腸43の推進運動性に関して、in vitroでの研究動物されているよう。時空間マッピングは、主に小動物から腸の管状のセグメントに適用されています。ただし、変更されたシステムを使用して、ウサギおよびブタでの研究は、より大きな動物にこの方法論の適用を示しています。ウサギの場合、アプローチは、より大きなセグメントおよび器官槽30を用いたこと以外は小さい動物のものと同一です。豚に使用されるアプローチは、臓器浴に解剖組織セグメントの麻酔したブタではなく、浸漬から腸の体外ループを使用することでした。また、STmapsは相互相関ではなく、ほとんどの研究40で使用透照法により作製しました。録画時空間マッピングのため、単離され、灌流vascularlyループ調製物はまた、ラットのような小さい種に適用されています<sup&gt; 33。 Kuizenga らによる最近の研究。ビデオのSTmapsの最初の使用は、ヒトの腸42 の ex vivoセグメントにおける運動パターンを記録しています。 STmappingアプローチは 、インビボ3,44 ヒトにおける圧力計（圧力）記録の分析に適用されている、にもかかわらず。ヒト組織における記録運動パターンは、同様の技術を使用して、すでに動物モデルで記録されたものと同様であり、ヒトの組織へのこのアプローチの拡張を検証します。これは、この研究は力変換器によって記録された筋収縮の測定にビデオ録画由来STmapsを組み合わせたことは注目に値します。 エキソビボセグメントに挿入された光ファイバーマノメーターカテーテルによって管腔内圧力の測定も管腔直径の変化よりも視覚化するためにSTMAPの多様性を示す、STMAPに変換しました。この組み合わせアプローチ相関筋肉の緊張は、管腔内圧力と壁の動きが可能にビデオ記録から生成STmapsのより詳細な機能解析のために。 （もDmaps呼ばれる）壁の動きから生成STmapsおよび管腔直径の変化の研究は、このような推進蠕動波やローカライズされた分節性収縮などの運動パターンの詳細な説明を可能にしました。これらのパターンは、以前の実験方法によって同定されたが、現在のアプローチは、このような波紋と新規抗蠕動収縮9,24,25,30,31,42などのローカライズされた収縮の動きをより洗練された定義を可能にします。 STmapsと運動パターンの変化の分析の建設は、腸および大腸の消化管運動における重要な問題に適用されています。これらには、神経性および筋原性収縮の分化とカハール6,9,11,12,16,24,26,27,29の間質細胞の役割の定義- 31,33,37を - 40,42を 、複合体を理解します様々な運動パターンの管腔内栄養素10,18,19の効果調べる円形と縦走筋層2,7,8,11,12,32,39,40の間の相互作用、微生物株34、及び粘度12,36、 7,9,10,13 - -世代の17,28,35,40および運動性の修正と様々な内因性の神経ホルモン剤、及び2,4-外因性薬剤の役割を理解します。この技術の将来は、圧力、電気生理学と緊張/収縮などの他の測定値とそれをカップリングさせることを含みます。最近の研究は、多くの場合、追加の相関の詳細2,42を提供する映像記録時空間マッピングと併せて、これらの測定値の一つ以上が組み込まれています。また、システムは、他の管状および非管状の器官で運動性を測定することができます。例えば、試みが使用して胃の運動を測定で行われていますこのようなシステムが、技術およびソフトウェアは、より良い、そのような非管状器官45に運動性を定量化するために洗練を必要としています。時空間マッピング技術だけではと分析のより伝統的な方法との組み合わせでの使用がより深い、将来的に消化管運動の包括的な理解につながることは間違いありません。

腸の運動性を記録し、分析する様々な方法は、過去150年1にわたって開発されてきました。これらは、最初のin vivoでの観察と説明ウィリアム・ボーモントのウォルターキャノンの測定と筋肉の緊張のマルチサイト記録の解釈のより最近の方法に、管腔内圧力、および/ ​​または膜電位（ すなわち、接合部電位）2の範囲であってきました- 6。これらの後者のアプローチは、全体的な運動パターンのスナップショットを提供するが、記録部位間での領域に記録部位の数とデータの補間の有効性によって制限されます。 録画時空間マッピング（STMAP）の最近の開発技術は、それが可能なコロンと腸のex vivoでの全セグメントにおいて、複雑な運動パターンを観察し、分析するために行きました。最初intesについて記述初期のアプローチ、1990年代後半7,8でtinalセグメントは、ビデオ録画を分析するために研究者・設計されたソフトウェアに依存します。 12 -いくつかのグループは現在、この目的の2,8のソフトウェアを作成または変更しました。多くのグループが独自のソフトウェアパッケージやプラグインを生成したが、それらすべては、組織セグメントの直径を分析し、グレースケール表現にそれらの種々の直径を変換します。市販の記録及び分析システムは消化管運動モニタリングシステム（GIMM）モルモット遠位結腸13と同様に推進し、混合運動性パターンの解析で糞便ペレット速度決意を経由して推進運動性の両方の分析を可能にするターンキー・アプローチを提供すると呼ばれます19 -無傷の腸セグメント4,5,14内の流体刺激と。この後者のアプローチはSTmapsの生成および分析に依存し、本論文で説明されています。この方法の目的は、Tを増加させることです彼は能力定性的および定量腸内に存在する様々な運動パターンを分析します。他のグループが独自のソフトウェアを介して運動性分析のためにSTMAPを使用しているが、これはSTmapsの生成により運動パターンを分析するためにGIMMを使用する方法の最初の記述です。組織径の変化を検出する能力、STmapsの作成を最大化するためにビデオ録画、録画パラメータを適切に設定するための腸組織の準備だけでなく、本論文では、詳細なステップバイステップの手順を提供GIMMシステムとImageJソフトウェアを使用してSTmapsの解釈と分析。 ここで説明する方法は、流体または腸運動パターンに影響を与える化合物を含有する半固体の管腔内灌流の分析に固有のものです。糞便ペレット推進の分析のための方法はMaweと同僚13による論文に記載されています。ここで説明する一般的な方法が考えられます以下のような他の管状の平滑筋臓器に適用：独自に、この方法は、圧力や筋肉の緊張の変化に関するデータを提供していませんが、小腸、血管、尿道、尿管など 、圧力を使用して結合することができますいくつかの他のグループは、2,15,20,21を示しているように運動パターンのより完全な画像を提供するために、トランスデューサ、力変換器や電気生理学的測定。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxygen (95%O2/5%CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting trays/dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dunkin Hartley Guinea Pigs</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>Freely available online.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM)</td>
			<td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td>
			<td></td>
			<td>Includes parts listed below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pumps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Cameras</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath TransIllumination Backlights</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ Baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Backlight Intensity Controls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIMM Processor ImageJ Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Connectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing for Peristaltic Pumps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Bath/Water Circulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal mapping of motility in ex vivo preparations of the intestines

記録筋緊張の変化、腔内圧力、および膜電位：複数のアプローチを含めた消化管運動を記録し、評価するために使用されてきました。これらのアプローチのすべてが、その後、全体的な運動パターンの感覚を提供するために解釈され、同時に腸に沿って一又は複数の位置で活性の測定に依存しています。近年、録画時空間マッピング（STMAP）技術の発展により、観察し、結腸および腸の ex vivo全セグメントで複雑 ​​なパターンを分析するために行きました。一度記録され、デジタル化され、ビデオ記録は管腔直径はグレースケールまたはカラーに変換するSTmaps [呼ばれる直径マップ（Dmaps）]に変換することができます。 STmapsは、運動方向（ すなわち、静止し、蠕動、逆蠕動）、速度、期間、頻度及び収縮運動パターンの強度に関するデータを提供することができます。このアプローチの利点は次のとおりです。analysiを相互作用または同じセグメントの異なる領域で異なる運動パターンの同時開発のSは、運動パターンの可視化は、時間の経過とともに変化し、他の地域の一つの領域に影響を与える活動でどのように活性の分析。別個STmapsおよび運動性パターンをより詳細に分析することができるように、ビデオ記録は、異なる時間スケールおよび分析パラメータを用いて再生することができます。このプロトコルは、特に運動の生成に影響腔内流体の膨張と腔内刺激の効果を詳細に説明します。管腔受容体アゴニストおよびアンタゴニストの使用が開始され、1つのパターンを他のパターンに変換することができる方法を方法の特定パターンに関する機構的情報を提供します。技術のみ腔内圧力変化または筋肉の緊張のデータを提供することなく、管腔直径の変化を引き起こし、そして実験に基づいて、成果物を生成することによって運動を測定する能力によって制限されます。ただし、analysi方法は、これらの問題を考慮することができます。従来の技術と比較すると、ビデオ録画とSTMAPのアプローチは、消化管運動をより包括的に理解を提供します。

直径マップなどの理解時空間マップ（STmaps）（Dmaps） この技術によって生成されたマップは時空間であるが、組織の管腔直径の変化は、具体的には、距離と時間の両方で可視化パラメータです。 STMAPは、下部にトップと終了時には開始時間と（秒単位）、y軸上の水平（mm単位）、x軸上の組織セグメントに沿った距離と時間を描いています。右上には、xとy軸（ 図1-4）の両方のスケーリングと同様、最小値と最大管腔直径を表示伝説、です。このように、グレースケール画像内の異なるピクセル色合いが異なる管腔の直径に対応しています。暗いピクセルは、より広い直径に対応し、明るいピクセルは、より小さな直径に対応しています。このように、円形の筋肉の収縮波が（による管腔直径の減少により明るいピクセル化の領域として表示されます。 <stronG&gt;図1黒矢印）。これとは対照的に、原因円形筋弛緩または流体の大きな塊に管腔膨満はSTMAP / DMAP（ 図1C白矢印）での管腔直径の増加と暗いピクセルの原因となります。 STmapsの形成と意味のさらなる議論は、ラマース群 11によって、紙に記載されています。 腔膨満誘発伝播収縮 図1では 、モルモット近位結腸は、各ボリュームで5分間クレブス緩衝液の0.5、1.0、1.5、および2.0 mlを膨張させました。伝播収縮が≥1.0すべてのボリュームによってミリリットル誘発し、STMAP（ 図1）のように薄い白いバンドを表示させました。腸管腔の膨満が伝播する収縮の開始を引き起こします。 図1に示すように 、より大きな管腔内容積を有する内腔の直径が大きくなるとSTMAPの画素その直径に対応する総合的な暗い背景を作成暗くなります。膨満のいくつかのレベル蠕動反射が活性化された（1.0ミリリットル;図1）では、内腔の直径を小さく経口最後に収縮の推進波を開始し、セグメントの肛門の端に向かって移動（白いバンドとして示されます図1及び図 4）。収縮を表すホワイトバンドは、多くの場合、先に蠕動波（ 図1C白矢印）の尾方緩和を表し、暗いバンド、先行します。これらの白と暗いピクセルは、昇順の収縮に対応しており、それぞれ蠕動反射、22,23の緩和要素を降順。 STMAP 図1のパネルAでは、0.0ミリリットルで0推進波、0.5ミリリットル膨満で0推進波、1.0ミリリットル膨満で3推進波、1.5ミリリットル膨満で6推進波、および5推進波aがありますトン2.0ミリリットル膨満。 栄養誘発文房具/ミキシング収縮 収縮を伝播する波がSTmapsによって可視化することができる唯一の​​運動パターンではありません。そのような分割として運動の混合パターンもSTmapsと対応する画像（ 図2A）に見ることができます。このパターンは、収縮を伝播とは異なります。混合パターンの間に多くの小、静止収縮が同時に（同じ水平線内の複数の小さな白い四角として可視化するが、お互いに接触していない）で異なる領域で起こります。各分節収縮が静止しており、伝播する収縮のために説明したように肛門的に口頭で移動しませんが、長い期間にわたって複雑な収縮パターンを説明するためのSTmapsの能力は、（ 図2A肛門時間をかけて収縮の進行を遅らせるの可視化を可能に黒い矢印）。の期間各個々の収縮はまた、ImageJのプラグインと関連した（ 図2A）を使用して、白色収縮正方形を通して垂直線を引くことによって決定することができます。短鎖脂肪酸の結腸内灌流から生成され、この特定のSTMAPでは、平均固定収縮時間は約2秒（1.9〜2.1秒の範囲）です。組織セグメント上に残っている腸間膜分析にアーチファクトを引き起こすことができるが、腸間膜（ 図1B、2B）によって生成された縦線アーチファクトは、縦筋の動きを決定するために用いることができます。 図1B および図2Bに黒い縦線の水平移動は、収縮および縦走筋の弛緩によるものです。縦筋のこの横方向の動きは、（ 図1B、2B）腸間膜アーチファクトによって発生する垂直帯の水平移動としてSTmapsに可視化することができます。 ImageJのとPlugiSTmapsのn分析両方の伝搬波（ 図3）と同様に収縮の持続時間（ 図2）の速度は、ImageJのとGIMMProcessorプラグインを使用することによって決定することができます。 （：0.21 0.35ミリメートル/秒の範囲） 図3に 、直立歩行のと逆行性の両方の波の伝搬速度は〜0.25ミリメートル/秒でした。 STマップ上のビデオ画像に見られるように、分析線（映像上にボックスを形成する赤線）は、組織セグメントの一方の端部の周りの代わりに、セグメント全体の周りに正確に設定されました。これは、ソフトウェアのガイドラインの重要な用途です。これらのガイドラインの正確な設定は、さらなる議論のセクションで分析したビデオの適切な分析に不可欠です。これは、筋原リップル収縮24を可視化 STMAPを生成することができます。これらの収縮は、原点で筋原性であり、非常に管腔直径を変更しないでください。また、別のディレクトリリップルのために共通している伝播ections（直立歩行のまたは逆行）は、（ 図3）は、この技術を用いて分析することができます。 図2に示すように、収縮の持続時間は、組織セグメントの異なる領域で変化させることができます。 STmapsの適切な分析 STmapsの創造の一つの潜在的な問題は、実験方法に可能なアーティファクトの生成です。例えば、組織の外側に残って腸間膜はSTMAP（ 図1、図2（b））の垂直黒い線を作成する組織のそのセグメントの直径測定値を増加します。腸間膜の存在はまた、人工的にスケールのコントラスト測定の鈍化をもたらす最も広い腔の測定を、増加させることによって、グレースケールマップを広げます。このためには、組織を穿孔することなく、セグメントからできるだけ完全に腸間膜を除去することをお勧めします。アン<html>他の可能STMAPアーチファクトが原因で、黒（ 図4B）と対比することができません腔液内の気泡に白い縦線です。これらの気泡は、管腔直径が解析ソフトウェアに小さく表示またはSTMAPで運動パターンに光/白領域をオーバーレイすることがあります。そのため、分析の前に組織セグメントとビデオ録画の適切な明暗の設定がSTmapsの構築に成功した（ 図4）に絶対的に重要です。適切および不適切な対照的なセットアップは、図4に示されている。これは、実験前のカメラキャリブレーションとポスト実験解析ウィンドウの両方が適切なSTMAPの生成と解析に不可欠であるにその映像調整を注意することが重要です。不適切な画像のキャリブレーションは使用できないデータ（ 図4A）とSTmapsにつながることができます。 700 &quot;/&gt; 近位結腸に伝搬波1.図。 （A）（モルモット近位結腸で行わ）膨満-応答曲線は、このセグメント（白水平バンド）に波を伝播開始するために、適切な管腔内の流体の体積を決定するために使用しました。黒い矢印は、完全長の伝搬波の例を示します。白矢印は、不完全な腸間膜の除去に起因するラインアーティファクト。（B）パネルAと同様の実験からSTMAP生成することによって達成収縮を伝播の拡大図が、より短い持続時間のビデオを説明します。これは、収縮が肛門方向に口頭で進行し、このマップは、また腸間膜の成果物の別のビューを提供するパネルAに比べて先にホワイトバンドの暗い領域として表さ前の尾方リラクゼーションを識別することに注意することは容易です。赤いボックスは、このパネルには、さらに近くビューOを示し、このSTMAPの領域はパネルC.（C）で展開を識別する同じビデオFとBの白矢印は伝搬波に流体尾方により管腔の膨張に起因している暗い画素に「流体膨満」ポイントをラベルパネルのようにマップされます。これらは、円形の筋肉の弛緩は、円形の筋収縮に尾方起こる領域です。伝播収縮が原因で、マップの長いタイムスケールにパネルAにおいて完全に水平線のように見えることに注意してください。収縮波が測定され、波の移動速度として報告することができるスロープを有するように、パネルBおよびCでは、時間スケールが徐々に短くなっている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" /> STMAPによって収縮時間の2決意図。 （A）モルモットの近位大腸SH短鎖脂肪酸（酪酸）の管腔内灌流に応答して、混合/分節運動パターンOWS。縦の赤い線は、Image JとGIMMProcessorプラグインを使用して収縮持続時間を決定するために収縮の期間を通して描かれています。黒い矢印は、静止収縮の伝播の尾方方向を示している。（B）マウス回腸内を伝播する収縮は、多くの場合、持続的な収縮の領域を示しています。垂直の矢印は、より多くの口腔領域がより長い期間のために契約したまま、このマップのショーに描かれました。この調製では、準備の肛門の端は、組織の収縮時にクローズドシステムを残してから流体を防ぐために閉鎖されました。パネルの上部にある画像は、全体の肛門の端部が流体（STMAPに黒）によって膨張している間に組織全体の経口端は、（STMAPに白）収縮する時間を示しています。パネルB STMAPの真ん中に黒い縦の横方向/水平方向の動きがの動きを示しています縦筋層。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" /> 図3.双方向運動パターン。伝播する波は、方向（経口肛門）（肛門に経口）と逆行両方直立歩行の中に移動することができます。黒の実線の矢印は、通常の直立歩行の伝播を示し、破線の黒い矢印は、逆行性伝播を示します。このSTMAPで直立歩行のと逆行収縮の両方の伝播速度は、ImageJの分析によって決定され、〜0.25ミリメートル/秒でした。画像解析ライン（STMAP上記ビデオ画像上のボックスを形成する赤線）は、多くの場合、直立歩行のに向いて低振幅である筋原リップル収縮、浅い収縮を可視化するために近くの組織の一方の端に設定された、Retrograde、または両方の方向は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" /> STMAP世代のための適切な画像コントラストの4重要性を図。パネルBは、適切に対比画像とSTMAPを示している（A）は 、不適切に対比画像とSTMAPを示しています。 （A）は 、適切に対比画像（B）から発生する水平白いバンドは、明らかではなく、原因グレースケールであること最初の画像に複数のアーティファクト（ホワイトシェーディング）があります。 STMAPでグレースケールの白シェーディングアーティファクトが消え正しく対比画像（B）から生成され、伝播する波はより顕著です。また、黒の濃淡が緩和ああを表します伝播する収縮波のEADは、収縮の各波とSTMAPの肛門最後に見ることができます。パネルBでは白矢印は、適切に対比することができなかった画像の領域で生成されたSTMAPアーティファクトを示しています。このタイプのアーティファクトは、時折実験プロトコルの過程で準備で発生した気泡管腔内に、主に起因している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

運動の時空間マッピングで<em&gt;エクスビボ</em腸の&gt;準備

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

10.3K ビュー.  Virginia Commonwealth University. Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

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Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

腱の生体外で機械的負荷

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

生物学

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

ex vivoでのウイルス形質導入を用いた毛包におけるGFPの標的発現

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

消化管運動のモニター（GIMM）

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

ザ ex vivoで</em血管反応性の調査のために>隔離された骨格微小血管の準備

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

C-FOSタンパク質免疫組織学的検出：特定の生理反応に関与する中央経路のマーカーとして有用ツール<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt; ex vivoで</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

マウス生殖管自発的運動性を評価するためのEx Vivo法とデータ解析のためのMATLABベースの子宮運動追跡アルゴリズム

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

運動の時空間マッピングで

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