1。 GIMMのための結腸組織の準備<ol><li>消化管運動のモニター（GIMM）、最初の場所の氷冷したKrebs溶液（121 mMのNaCl、5.9 mMの塩化カリウム、2.5mMのCaCl 2を 、1.2 mMのMgCl 2、25mMのNaHCO 3の内の隔離されたコロンのために遠位結腸のセグメントを準備するには、1.2 mMののNaH 2 PO 4、および8 mMグルコース、95％O 2 / 5％CO 2を通気）。外壁からの残りの腸間膜を除去すると臓器の風呂に入れると、それを区別することができるように口端に小さな切開を行います。注：組織は、最大2時間、アイスクレブス溶液で実験に先立って残ることがあります。 </li><li>次に、彼らは画像取得との干渉を防ぐためにカメラのフィールドの外にあるので、臓器槽に流入し、流出導管を配置します。継続的に温めておいたと器官浴（37℃）10ml /分の流量で酸素（95％、5％CO 2）クレブスのソリューションを灌流。 </li><li>セグメントは、中央の1cmのために自由に移動できるように、弛緩の小さな程度をできるように、臓器浴中にどちらかの端に遠位結腸のセグメント（少なくとも5センチ）ピン、経口対肛門の端を追跡する。経口最後は糞の塊を置くことを容易にするために研究者の方に配置する必要があります。セグメントの長さとテンションは縦ストレッチがトランジット（ディクソンらの割合の減少とともに、推進運動の速度に影響を与えるため、結腸のセグメントは、実験の与えられたセット内のすべての実験のための同じ研究者によって同じ方法で確保されるべきである。 、2007）。 </li><li>準備は、少なくとも30分間平衡させる。 </li></ol> 2。 GIMMとデータ収集の設定<ol><li> GIMMシステムでは、灌流チャンバ内の結腸セグメントは、下から照らされている。コンピュータとのインターフェース、デジタルビデオカメラは、チャンバーの上に配置されている。光照射の光源とGIMMソフトウェアの両方の電源がオンになっていることを確認してください。 </li><li> GIMMソフトウェアアプリケーションの新しい実験をセットアップした後、蠕動運動を開始するために大腸セグメントの経口最後にエポキシ樹脂コーティングfecalペレットを挿入することにより、第一審を開始。カメラをオンにして録音を開始するために録音ボタンをクリックしてコンピュータ上のカメラのトグルスイッチをクリックしてください。肛門方向のペレットの動きは、ビデオカメラによって記録され、デジタルムービーは後で解析するためにPCに保存されます。ペレットは、結腸セグメントの終わりに達したときに、録音を停止するには、レコードボタンをクリックします。 </li><li>推進の速度の制御値を取得するには、健康な動物からと薬を適用せずに大腸セグメントで始まります。各実行の間に5分の回復期で、単一の製剤3〜5の試験を実施する。 </li><li>大腸運動に一定の条件や薬剤の効果を決定するために、各実験条件のための3-5試験/準備を行います。加えて、少なくとも5つの異なる動物から少なくとも5つの異なるコロンでそれぞれ実験を行う。 </li><li>デジタルムービーの解析では、糞の推進の速度は、それが大腸セグメントのXのCMを通過するペレットにかかる時間として計算されます。 </li></ol> 3。時空間マップの構築<ol><li>個々のGIMMの実行から取得したデジタルビデオは、カスタムGIMMのソフトウェアを使用して時空間マップに変換することができます。 </li><li>横軸に、結腸の直径の変化は、シルエットに、各ビデオフレームにコロンの画像を変換し、グレースケールに全長に沿って直径を計算して変換することによって、時間の経過とともにプロットされます。最終結果は、収縮の領域が白色で表示される間、ペレットとリラクゼーションの領域は、黒表示されることです。 </li><li>コロンセグメントを介してペレットが移動する距離は、縦軸に表されます。 </li></ol> 4。代表的な時空間マップ<ol><li>ここに示されている様々な実験条件下で結腸のセグメントでペレットの運動性を示す代表的な時空間マップです。 x（水平）軸はペレットがコロンセグメントを介して進行する距離を表し、y（垂直）軸は、時間をかけてペレットの位置を表します。 <img src="/files/ftp_upload/2435/2435fig1.jpg" alt="図1" /> </li><li>コントロールのコロン（通常の、未処理）から時空間マップに、ペレットは約2 mm /秒の速度で直線的に進行します。対照的に、大腸内の特定の薬物や炎症の管理は、そのような停止運動性と障害物運動などの混乱運動パターンになる可能性があります。 </li><li> GIMMからの結果は、y軸は糞便ペレットとx軸は時間を秒単位で表すことによって走行ミリメートルの距離を表している、グラフとして表示することができます。たとえば、DAMGO（D - Ala2、N - ME - Phe4、のGly - ol5）の投与、オピエートμ受容体作動薬は、大腸の推進運動性の低下を引き起こします。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bayliss, W. M., Starling, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movements+and+innervation+of+the+small+intestine.">The movements and innervation of the small intestine.</a> J of Physiol (Lond). 24, 99-143 .</li><li>Dickson, E. J., Spencer, N. J., Hennig, G. W., Bayguinov, P. O., Ren, J., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enteric+occult+reflex+underlies+accommodation+and+slow+transit+in+the+distal+large+bowel.">An enteric occult reflex underlies accommodation and slow transit in the distal large bowel.</a> Gastroenterology. 132, 1912-1924 (2007).</li><li>Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G., Grider, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+colonic+motility+and+the+electrophysiological+properties+of+myenteric+neurons+persist+following+recovery+from+trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis+in+the+guinea+pig.">Changes in colonic motility and the electrophysiological properties of myenteric neurons persist following recovery from trinitrobenzene sulfonic acid colitis in the guinea pig.</a> Neurogastroenterol Motil. 19, 990-1000 (2007).</li><li>Langley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autonomic Nervous System. , (1921).</li><li>Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+excitability+of+myenteric+AH+neurones+in+the+inflamed+guinea-pig+distal+colon.">Enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea-pig distal colon.</a> J Physiol. 547, 589-601 (2003).</li><li>Linden, D. R., Sharkey, K. A., Ho, W., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclooxygenase-2+contributes+to+dysmotility+and+enhanced+excitability+of+myenteric+AH+neurones+in+the+inflamed+guinea+pig+distal+colon.">Cyclooxygenase-2 contributes to dysmotility and enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea pig distal colon.</a> J Physiol. 557, 191-205 (2004).</li><li>Linden, D. R., Chen, J. X., Gershon, M. D., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+availability+is+increased+in+mucosa+of+guinea+pigs+with+TNBS-induced+colitis.">Serotonin availability is increased in mucosa of guinea pigs with TNBS-induced colitis.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 285, 207-216 (2003).</li><li>Linden, D. R., Couvrette, J. M., Ciolino, A., McQuoid, C., Blaszyk, H., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indiscriminate+loss+of+myenteric+neurones+in+the+TNBS-inflamed+guinea-pig+distal+colon.">Indiscriminate loss of myenteric neurones in the TNBS-inflamed guinea-pig distal colon.</a> Neurogastroenterol Motil. 17, 751-760 (2005).</li><li>Lomax, A. E., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+facilitation+and+enhanced+neuronal+excitability+in+the+submucosal+plexus+during+experimental+colitis+in+guinea-pig.">Synaptic facilitation and enhanced neuronal excitability in the submucosal plexus during experimental colitis in guinea-pig.</a> J Physiol. 564, 863-875 (2005).</li><li>Lomax, A. E., O'Hara, J. R., Hyland, N. P., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+alterations+to+enteric+neural+signaling+in+the+guinea+pig+colon+following+the+resolution+of+colitis.">Persistent alterations to enteric neural signaling in the guinea pig colon following the resolution of colitis.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, 482-491 (2007).</li><li>Strong, D. S., Cornbrooks, C. F., Roberts, J. A., Hoffman, J. M., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+neuromuscular+transmission+is+selectively+attenuated+in+ulcerated+regions+of+inflamed+guinea+pig+distal+colon.">Purinergic neuromuscular transmission is selectively attenuated in ulcerated regions of inflamed guinea pig distal colon.</a> J Physiol. 588, 847-859 (2010).</li><li>Wade, P. R., Chen, J., Jaffe, B., Kassem, I. S., Blakely, R. D., Gershon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract.">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16, 2352-2364 (1996).</li><li>Wood, M. J., Hyman, N. H., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Daikenchuto+(DKT)+on+Propulsive+Motility+in+the+Colon.">The Effects of Daikenchuto (DKT) on Propulsive Motility in the Colon.</a> J Surg Res. , (2009).</li></ol>

このビデオの制作は、この記事で使用する楽器を生成する野猫研究開発、株式会社後援した。

消化管の神経を介した推進運動性は、最初のベイリスとスターリング（ベイリスとスターリング、1899）によって一世紀以上も前に記述されていた。この観察結果は、腸神経系（ENS）、自律神経系の異なる部門（ラングレー、1921）などの腸の神経の指定につながった。神経性腸蠕動は、指定されたポイントと反射を介した収縮上記、または経口、反口側の方向に刺激とリラクゼーションのレベルでのストレッチ及び/または粘膜の刺​​激を伴います。その結果、反口側の方向に口頭で内腔の内容を推進させる圧力勾配の世代です。種の多様の小腸では、とラットの大腸で、収縮の蠕動波は、腸のセグメントの内腔に流体の注入によって活性化することができます。モルモット遠位結腸では、天然または人工の糞は、大腸の口端に挿入することができるとコロンのセグメントに沿って、その進捗状況を簡単に監視することができます。このように、モルモット遠位結腸では腸で推進運動性を調査するためのシンプルかつ有用なアッセイを提供する。 蠕動は、神経活性化合物と受容体の数を含む複雑な神経反射である。その結果、EN​​Sの神経伝達に影響を与える化合物は、推進運動の速度に影響を与えます。腸粘膜の腸クロム親和性細胞から主に放出セロトニンは、、蠕動反射の開始に関与している。推進運動性を5 - HT 4受容体アゴニスト（。。フォックス-オレンスタインら 、1998;グライダーら 、1998）のintralumenal投与により増強されることを示したモルモット遠位結腸、グライダーや同僚を使用して、一方、5のアプリケーションの風呂- HT 3と5 - HT 4受容体拮抗薬は、推進力の割合（。。リンデンら、2003b。門脇ら 、1996）に減少。さらに、選択的セロトニン再取り込み阻害薬によるセロトニントランスポーターの阻害薬（SSRI）はまだ、低濃度で蠕動運動を増加させる5 - HT受容体（門脇ら 、1996の脱感作の可能性が高いため、より高い濃度で、蠕動運動が低下します。。。ウェイドら 、 1996年）。モルモット推進運動性に寄与する他のシグナル伝達分子が腸内のニューロン間のシグナル伝達の主要なメディエーターであるニコチン性受容体、体に作用するアセチルコリンが含まれています。より低い濃度が推進の速度（門脇ら 、1996）に影響しないしながらニコチン受容体拮抗薬ヘキサメトニウムとのシナプス伝達をブロックすると、高濃度でペレットの推進力を減少する。長い消化管運動に対する抑制効果を有することが知られているアヘン、およびオピオイド受容体アゴニストは、、（。。; Wood ら 、2009フォックス、オレンスタインら 、1998）モルモット推進運動のモデルでペレットの推進力を減少させる。 、オピオイド拮抗薬のナロキソンを投与した場合に興味深いことに、daikenchuto、嘔吐、腹痛、および無秩序な運動の治療に臨床的に使用される日本の伝統的な漢方薬は、ペレットの推進力の割合が減少し、単独で投与したとき、逆蠕動運動の結果（Wood ら。 2009年）。これらの知見は、大腸運動のパターンで、種々の化合物およびそれらの受容体の寄与を評価するためにモルモット推進運動モデルの有用性を示しています。 、およびこれらの変更は、炎症からの回復（クラウターを後の数週間持続することができる、（ロマックスら、2005。。リンデンら 、2003A）多くの研究は、炎症が大腸の神経細胞の電気的及びシナプス特性の変化につながることが実証されているら、2007;。ロマックスら、2007）。。推進運動で大腸炎誘発性neuroplastic変更の影響はGIMMシステムを使用してモルモット遠位結腸で調べることができます。このシステムは、単に糞ペレットが所定の距離を移動する時間を測定することにより、推進運動を評価する大腸運動を監視する従来の方法、利点がいくつかあります。 、まだGIMMシステムを使用して、より最近の調査がより明らかにして、大腸の炎症誘発性神経可塑性のこれまでの研究では、ペレット推進（。。リンデンら 、2005年リンデンら 、2003A）の速度の低下があることが示されている複雑な変更（ストロングら 、2010）。例えば、ペレット推進の速度は、炎症遠位結腸の潰瘍化した地域で減少され、まだ運動は、隣接する地域、それ以前の&quot;ストップウォッチ&quot;の方法によって認識されない現象に加速される。他の研究では、炎症の活動期の間に運動障害がCOX - 2の阻害に復元できることが示されている（リンデンら 、2004）、まだ超えて存続運動を変化さ炎症の解像度は、COX - 2を区別しない（クラウターら 、2007）である。さらに、これらのその後の研究では、GIMMシステムによって生成された時空間マップは、推進力の減少率に貢献する炎症後の動物で観察された大腸運動の段階的なパターンを明らかにした。 結論では、モルモット遠位結腸推進運動性アッセイはまた、結腸運動に試験化合物および病理学的条件の影響を測定するハイスループットな手段を表し、GIMMシステムは 、in vitro での結腸推進運動を評価するためにシンプルでわかりやすいアプローチを提供します。それは、ペレットの推進だけでなく、自発的な活動パターンを勉強する時空間マップの生成を連続的に測定することができます。従来の方法に比べて、それはまた、定量することができる、デジタルファイルとして再分析し、複数の方法がシステムに保存し、簡単にアクセスすることが、より複雑な現象をもたらすことができる。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Krebs&#x2019; Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Anesthesia</td>
<td>Webster Veterinary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epoxy-coated fecal pellet </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beakers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>500 mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas Tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>95% O2/5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gastrointestinal Motility Monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Catamount Research and Development</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm">http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

gastrointestinal motility monitor (gimm)

消化管運動のモニタは、（GIMM、野猫研究開発、セントオールバンズ、VT）モルモット遠位大腸の孤立セグメントの推進運動を監視するin vitroの系です。完全なシステムは、コンピュータ、ビデオカメラ、照らされた臓器の風呂、ポンプを循環蠕動と温水槽、およびデータを記録して分析するためのカスタムGIMMソフトウェアで構成されています。結腸蠕動運動を監視する従来の方法と比較して、GIMMシステムは、運動の継続的、定量的に評価することができます。モルモット遠位結腸を暖め、酸素クレブス液に包まれ、そして経口最後に挿入された糞は約2mm /秒の速度でコロンのセグメントに沿って推進されています。セグメントに沿って糞の処理を進めるのムービーがキャプチャされ、そしてGIMMソフトは糞の塊の進行状況を追跡に使用することができます。推進運動の速度は、セグメント全体のためや、興味のある特定の地域のための得ることができます。ボーラスによって誘発される運動パターンの分析に加えて、時空間マップは自発運動のパターンを評価するためにキャプチャされたビデオセグメントから構築することができます。このシステムのアプリケーションでは、薬理学的推進運動に対する受容体アゴニストとアンタゴニストの効果の評価、だけでなく、炎症やストレスなどの病態生理学的状態、より結果がその変化の評価が含まれています。 GIMMシステムを使用してモルモット遠位結腸推進運動性アッセイは、学ぶために簡単で単純なもので、その推進運動を評価の信頼性と再現性のある方法を提供する。

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Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

消化管運動のモニター（GIMM）によるモルモット遠位結腸の大腸運動の評価は、定量的に消化管での推進運動を評価するためのアプローチを学ぶことは簡単でシンプルです。

消化管運動のモニター（GIMM）

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

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Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

Drugs Affecting Gastrointestinal Motility

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30.6K ビュー.  The University of Vermont. 消化管運動のモニター（GIMM）によるモルモット遠位結腸の大腸運動の評価は、定量的に消化管での推進運動を評価するためのアプローチを学ぶことは簡単でシンプルです。

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Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

生物学

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

運動の時空間マッピングで<em&gt;エクスビボ</em腸の&gt;準備

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

Most animals use the gastrointestinal (GI) tract to digest food. The movement of the ingested food in the GI tract is essential for nutrient absorption. Disordered GI motility and gastric emptying cause multiple diseases and symptoms. As a powerful genetic model organism, Drosophila can be used in GI motility research. The Drosophila crop is an organ that contracts and moves food into the midgut for further digestion, functionally similar to a mammalian stomach. Presented is a protocol to study Drosophila crop motility using simple measurement tools. A method for counting crop contractions to evaluate crop motility and a method for detecting the distribution of food dyed blue between the crop and gut using a spectrophotometer to investigate the effect of the crop on food passaging is described. The method was used to detect the difference in crop motility between control and nprl2 mutant flies. This protocol is both cost-efficient and highly sensitive to crop motility.

Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

The goal of this protocol is to measure crop contraction and quantify food distribution in the Drosophila gut.

ショウジョウバエにおける作物運動性と食物過大評価の測定

Most animals use the gastrointestinal (GI) tract to digest food. The movement of the ingested food in the GI tract is essential for nutrient absorption. ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...