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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. 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著者らは、開示することは何もありません。

Mechanosensationは生物に進化した第1の感覚の伝達経路のいずれかを意味します。 DIBのメカノ電気的特性を研究し、理解するため、この現象を利​​用して、機能的な刺激応答性材料に向けた重要なステップです。これは、脂質二重層インターフェースの張力の増加を検出することmechanoelectrical変換器とひずみゲージとしてDIBに、機械受容チャネル​​、MSCLの取り込みおよび活性化を伴います。別のノートでは、MSチャネルの機能は、厚さ、内部曲率、および圧縮を含む脂質二重層の基本的な材料特性を介して調節することができます。前述の光では、マイクロピペットベースの技術は、研究者のDIBで、MSチャンネルを研究し、脂質二重層の構造と同様に、脂質 - タンパク質相互作用への洞察を提供する能力を可能にする貴重なツールを提供します。 過去3十年にわたってSは、パッチクランプは、電圧と緊張の両方のクランプを可能にするので、MSチャネルを研究する主な方法でした。しかし、パッチクランプは小型化、感覚および変換デバイスのエンジニアリングのために要求される特性に適しかさばる機器ではなく、する必要があります。そのシンプルさ、安定性、および小型化に起因するのDIBはMSCLの活性を研究するために適した環境を表しています。ここでは、液滴と二層インターフェイスのサイズ、各液滴の化学組成、および動的刺激を介して界面における張力を制御する能力を、マイクロピペットベースの手法を提案することによってDIB形成技術の前の進歩を拡張します。技術は同軸上にガラスキャピラリーに反対の先端に、プロテオリポソー​​ムを含む、水性液滴を固定する構成されています。液滴は、有機溶媒の浴中に置き、界面での接触脂質二重層の形態で運ばれているとき。 マイクロピペットは、pに接続されています液滴の水平変位を可能iezoelectric発振器、。動的に液滴を圧縮し、水中油界面二重層と張力の増​​加したがってにおける界面張力の増加をもたらします。二つの主要な側面が類似しており、最近発表されたコンタクトバブル二重層（CBB）技術37からこのメソッドを区別しています。本明細書に提示される技術を使用して、二層の大きさは、マイクロマニピュレーターを使用して制御されるため、液滴の体積は、CBB法とは異なり、一定のままです。また、CBB技術が構築することが簡単で容易になり、本論文で提示された方法で必要とされていない圧力ポンプ、を求めています。 私たちは、組み込み、パッチピペットまたは化学修飾38を使用せず、初めての細菌MSCLを刺激することができます。システムは堅牢な非対称脂質二重膜の形成を促進するので、より密接リットルを模倣生体膜で見つかったIPID非対称。これは、私たちはMSCLの活性に対する制御膜組成や非対称性の影響を研究することができます。さらに、画像処理技術を介して、この方法は、二層界面における張力を推定するのに役立ちます。 DIBにバルクと表面力の間の相互変換の原理を理解する上でこの技術を支援は、基本的な膜特性の測定を容易にし、膜張力にMSCL応答の理解を向上させます。 この方法はMSCLを研究するために生体分子刺激応答性材料系に向けて、さまざまな生理的環境に歩近づく私たちがかかりますが、システムには限界があります。このシステムでは、張力により油/水界面での緊張を緩和する傾向が各小滴中のリポソームの形態で脂質リザーバの存在にクランプすることができません。そのため、現在では機械受容チャネル​​を刺激することができますのみ動的政権でのDIBインチシステム中の気泡の存在は、かなりの実験の精度、再現性に影響を与えます。ヒドロゲル内に存在する気泡は、電気的な接続の場合の損失を生じる可能性があります。 我々はMSCLの刺激のためのマイクロピペットに基づく方法の使用を記載しているが、技術は、MSのチャネルの他の種類を研究するために使用され、生体分子の多様性を研究するために研究者によって使用される可能性を有することができます。例えば、同様の設定は、チャネルフリー液滴界面の二分子膜のmechanoelectrical応答を研究するために我々の研究室で使用されています。様々なタンパク質が再構成し、各生体分子の再構築環境が変化することを考慮して取って、この高度に制御された設定を使用して活性化することができます。この資料に記載されているメソッドは、研究者の想像力に制限されてかなり広い応用の可能性にも触れて。

過去十年間に、人工脂質二重層のアセンブリは、実質的に液滴界面の二重層法の開発を通して進められています。安定した、堅牢として知られ、DIBには（ミューラー）塗装古典と折り畳まれた（Montal-ミューラー）の平面二重層1の代替モデル系として自分自身を課しました。脂質二重層を作成するための液滴を使用してのアイデアは1960年代2にさかのぼりますが、それは最近まで人気を獲得していません。最初に成功した試みはベイリー・グループ4-6により液滴のネットワークを使用して、二重層形成を証明するいくつかの研究が続いTakeushiグループ3、によって報告されました。より最近では、カプセル化技術は、新規な刺激反応材料システム10の構成要素としてのDIBを使用する概念を開拓レオグループ7-9によって提案されました。以前の研究では、DIBには、電気9,11、CHEMに対応する能力を証明していますiCalの10,12、および光刺激13。 DIB 10,14で再構成したときに別の刺激応答性官能基を有する様々な生体分子を効果的に刺激されました。これらの成功した試みの​​光の中で重要な問題が提起されています。適切な生体分子が組み込まれている場合、DIBは、機械的刺激に反応するだろうか？ DIBに作用する界面力は、他の2層系15,16と異なります。そのため、液滴に保持された二重層の張力は水 - 脂質 - 油界面の張力を調整することによって制御することができます。塗装または折り畳まれた二層システムでは適用できない概念。 広く浸透圧調節物質のリリースバルブおよび細菌細胞膜の基本的な要素として知られているMSCLチャンネルは、増加した膜張力17,18に反応します。低浸透性ショックの場合に、いくつかのチャネルは、小さい細胞の膜に存在する19 MASを生成することができSIVE透過性応答は、迅速溶解20から細菌を保存し、イオンおよび小分子を放出します。生物物理学的に、MSCLはよく研究されており、著名なパッチクランプ法21-23を通じて、主に特徴とします。 MSCLのゲーティング機構24,25を説明する信頼性の高い構造モデルは28をモデル化し 、その同族体の結晶構造26,27に基づいており、大規模な実験24,29-31の結果提案されています。 〜の張力下では10mN / mで、膜貫通ヘリックスの緊密な束で構成され、閉じたチャネルは、〜28オングストロームの水で満たされた導電性の孔21,24,32を形成大きく傾いたヘリックスのリングに変身。また、インナーTM1ドメインの交差点に位置する緊密なゲートの疎水性は、チャネル33の活性化閾値を決定することが確立されています。それに応じて、それが判明したゲートの疎水性を減少させることによって、tension個の閾値は、22に低減することができました。 MSCLのこのプロパティは、主に薬物送達のために、様々な制御バルブ34の設計可能にしました。電気生理学的活動に細胞膜過度の緊張を翻訳し、その基本的な役割に基づいて、すべての前述の特性とは、MSCLはDIBの中mechanoelectricalトランスデューサとしてぴったりになります。 この記事では、DIBのを形成し、機械的刺激に基づき設立されたMSCLチャネルの活性を測定するために、元のマイクロピペットベースの方法を提示します。私たちは、初めての機械的刺激とDIBの35でMSCLのV23T低閾値変異体の機能的再構成するのDIBの反応を報告しています。 実験システムは、2つの対向ホウケイ酸ガラスマイクロピペットの先端に固定された脂質包まれた水性液滴で構成されています。液滴が接触するときに脂質二重層インタフェースはFOでありますrmed。この技術は、各液滴（バルク）の化学組成とサイズの制御だけでなく、二層インターフェイスの寸法を提供しています。また、各リーフレットの様々な脂質組成を有する非対称膜を容易に形成することができました。 、高調波圧電アクチュエータに取り付けられたマイクロピペットのいずれかを持つことは、事前にプログラムされたシングルサイクルや振動刺激を適用する機能を提供します。張力はそれをサポートする両方の液滴の圧縮を介して人工膜に送達されます。液滴の変形の結果として、水 - 脂質 - 油界面の増加と同時に液滴との間の角度の領域は、膜張力および過渡MSCLの活性化の増加を引き起こし、減少します。変形中の液滴の形状を分析することによって、界面で作成された張力を推定することができました。この記事の焦点は、DIBのメカノトランスダクションの性質にあるにもかかわらず、我々はまた、バイオの他のタイプを強調例えば、アラメチシンなどの分子は、この多機能プラットフォームによって活性化することができます。我々は、ここでは、準備組み立て、および段階的にこの新しい方法で測定を行うのすべての技術的側面を提示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MSCL、大コンダクタンス機械受容チャネル​​（MSC）は、細菌が急激に低浸透性ショックを乗り切る助けユビキタスオスモライトリリースバルブです。これは、発見され、厳密にはほぼ三十年のためのパッチクランプ法を用いて研究されています。透過性応答に細胞膜の張力を翻訳するその基本的な役割は、人工膜ベースの生体分子デバイスでmechanoelectrical変換器として機能する有力な候補になります。そのようなデバイスのビルディングブロックとして、液滴界面二重層（のDIB）はMSCLチャネルの取り込みおよび刺激のための新たなプラットフォームとして使用することができます。ここでは、のDIBを形成し、組み込まれたMSCLチャネルの活性を測定するためにマイクロピペットベースの方法を記載します。この方法は、二つの対向（同軸上に位置）ホウケイ酸ガラスマイクロピペットの先端に固定された脂質包まれた水性液滴で構成されています。液滴が接触するときに、脂質二重層のインタフェースであります形成されました。この技術は、化学組成と各液滴の大きさだけでなく、二重層界面の大きさを制御しています。高調波圧電アクチュエータに取り付けられたマイクロピペットの1つを有する、所望の振動刺激を送達する能力を提供します。変形中の液滴の形状を解析して、界面で作成張力を推定することができます。この技術を使用して、DIBシステム内のMsClチャネルの最初の活性が報告されています。 MSチャンネルに加えて、チャネルの他の種類の活動が、このプラットフォームの多機能性を証明し、この方法を用いて研究することができます。ここで紹介する方法は、基本的な膜特性の測定を可能に対称および非対称膜の形成をより細かく制御を提供し、刺激し、機械受容チャネル​​を研究する別の方法です。

図1及び脂質二重膜の機械的刺激の過程でタンパク質活性を記録するために2ディスプレイ実験および機器を使用しました。我々の測定に電気的なノイズを最小限に抑えるため、ワークステーションは、ラボ製ファラデーケージ内に配置され、AxoPatch 200 Bアンプのアース接続に接地されています。 安定した絶縁脂質二重層の形成は、この研究の重要なステップです。この構成では、脂質単層は、有機溶剤の浴に浸漬水性液滴の油/水界面で組み立てます。液滴が接触するように配置されると、余分な油を排除し、2つの分子の厚さの脂質二重層に対向する脂質単分子層が薄くされます。二層の特性評価に使用される最も一般的な手法は、電圧クランプです。電流を測定しながら、電圧クランプを用いて、二重層の両端の電圧を一定値に維持される。 図4 </stronG&gt;は、最初の二層形成の典型的なリアルタイムの現在の記録を描いています。 DPhPC脂質二重層の比容量（〜0.6μF/ cm 2）を5知ること、形成された二層の面積を算出することができます。二重層の領域は、液滴（ 図4A）の位置を変えることによって制御することができます。圧電アクチュエータを使用して、異なる周波数、振幅およびデューティサイクルの波形（正弦波、方形、三角形、 等 ）の異なるタイプが水平の液滴に適用され、軸方向にそれらを振動、したがって、二重層の張力及び面積を変更することができることができ（ 図4B）。 DIBを機械的に刺激されると、膜を横切る一定のDC電位を維持しながら、MSCLの低しきい値（機能獲得）V23T変異体は、主にサブ導通状態と時折フルオープンイベントを含む信頼性の高い活動を生成する（ 図5） 。これらのEVエントは、精製V23T MSCLで再構成し、無傷の内側大腸菌膜及びリポソームからのパッチクランプ法を用いて記録したものと同じです。 図5の結果は、ゲーティングを証明するすべての電流スパイクがピーク圧縮で観察されているので、張力の増加に応じて発生します。ピーク圧縮では、液滴の相対面積の拡大が最大であるため、界面での張力が最大です。 DC電圧は、膜36を横切って印加されたときアラメチシン、電位依存性イオンチャネルであり、最も研究されたペプチドの一つは、膜透過性を増加させます。膜貫通タンパク質およびペプチドをホストする脂質二重層界面の能力もアラメチシンペプチドを用いた電圧 - ゲート電流の記録を行うことによりテストされます。アラメチシンは、100ng / mlの最終濃度にリン脂質溶液と混合される。 図6は、下の電流測定値を示しています<html>電圧クランプ（115 MV）。この実験では、小滴二層インターフェイスとより高い抵抗とより小さな静電容量を達成するために、引き離されています。アラメチシンペプチドのゲーティング動作は、現在の（ 図6）の離散的なステップを通して示されています。プロットの右側のヒストグラムは、基本的には、チャネル自体の最初のコンダクタンスレベルである基準レベル（0.0962 NS）から、コンダクタンスの変化を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> 図1：メイン部品やオイルリザーバの寸法を説明する模式オイルリザーバーはバージニア工科大学の機械工場で製造されています。これは、アクリル板の表面に接着し、機械加工、円筒状のアクリルの管で構成されています。寸法および設計は、異なるアプリケーションまたは二つ以上のマイクロピペットを収容するように修正することができます。/53362/53362fig1large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> 図2：実験セットアップとマイクロピペットの調製（A）を形成するための標準的なワークステーション、機械的刺激、及び界面二重層を特徴付けることは、顕微鏡、3軸マニピュレータ、デジタルカメラ、圧電発振器、除振台、ファラデーケージを含みます。 （図示せず）。 （B）実験は、水平ヘキサデカン油浴内に配置された2つの対向PEG-DMAヒドロゲル満たさマイクロピペットで構成されています。マイクロピペットの各々は、電気的接続を提供するためのAg / AgCl電極を含んでいます。プロテオリポソー​​ム溶液で満たされた第三のマイクロピペットは、他のマイクロピペットの先端で液滴を形成するために使用されます。 （C）DIB電流応答を測定することができますパッチ増幅器及び低雑音データ収集システムの組み合わせを使用して。 （D）Aは、マイクロピペットの先端に形成された水性液滴を示す写真をクローズアップ。 （E）のAg / AgCl電極は、漂白剤二つ250μmの銀ワイヤの先端を浸漬することによりなされます。電極はその後固化するUV光で硬化されるPEG-DMAのヒドロゲルで充填された2つのホウケイ酸ガラスキャピラリーを介して供給されます。オスコネクタストレート微小電極ホルダーはパッチ増幅器のヘッドステージにマイクロピペットのいずれかを接続するために使用されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> 図3：液滴界面二重層の形成を示す写真（A）プロテオリポソームを充填した10μmのマイクロピペットは、マイクロピペット先端に近接する、顕微鏡の下に配置されています。マイクロピペットに接続された注射器を使用して、小容量を分配プロテオリポソー​​ムの所望の体積の球状液滴を形成します。液滴は10分間座ってできるようにすることで、単層の形をしてみましょう。接触液滴をもたらします。界面でのすべての油が除去された後、二重層が形成されます。 （B）二重層が形成されているが、界面の両側の化学組成は、マイクロサイズのマイクロピペットを使用して所望の化学物質を注入することによって制御することができます。 （C）最初の接触の瞬間に液滴。 （D）脂質二重層が形成された液滴。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> 図4：リアルタイム測定値は初期間伐やインタフェースのその後の展開の両方を示し、（A）電流は、三角形の電位のアプリケーションを介して二層形成の過程で測定しました。測定された電流の大きさはCapaciのに正比例していますタンス、したがって、二重層界面の面積。インタフェース、およびその逆の面積より大きく、液滴が一緒にされる近づきます。機械的励起を印加する（B）は 、二重層界面の面積が増加し、刺激信号と同じ周波数で減少します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> 図5：リアルタイム測定は、機械的励起に二重層の応答だけでなく、MSCLのV23T変異体のゲーティングを示す電流応答の形状は、結果として二重層容量の正弦波変化に関係する、正弦波です。二層の面積変化。電流スパイクは、各サイクルのピーク時に発生する、V23T変異体のサブコンダクタンスゲーティングを示しています。さらに極座標プロットは、二層の界面での緊張の増加を反映して、ゲートがピーク圧縮で生じていることを示しています。 図6：電圧クランプと組み込まれたアラメチシンチャネルのゲーティング活動のためのコンダクタンスレベルの対応するヒストグラムの下の電流測定アラメチシンペプチドのゲーティング動作は、電流の個別の段階的増加によって示されています。コンダクタンスレベルはバージニア工科大学7で私たちの研究グループによって行われる前の測定値と非常によく一致します。

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

細菌機械受容チャネル​​は、生体分子デバイスでmechanoelectricalトランスデューサとして使用することができます。そのようなデバイスへの液滴のインタフェース二重層（DIBを）、セル風のビルディングブロックは、機械受容チャネル​​を組み込むと刺激する新しいプラットフォームを表します。ここでは、機械的な刺激の下で機械受容チャネル​​の研究を可能にする、のDIBを形成する新しいマイクロピペットベースの方法を示しています。

液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K ビュー.  Virginia Polytechnic Institute and State University. 細菌機械受容チャネル​​は、生体分子デバイスでmechanoelectricalトランスデューサとして使用することができます。そのようなデバイスへの液滴のインタフェース二重層（DIBを）、セル風のビルディングブロックは、機械受容チャネル​​を組み込むと刺激する新しいプラットフォームを表します。ここでは、機械的な刺激の下で機械受容チャネル​​の...

ビデオ: Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

電気生理学的実験のための人工二重層の準備

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...