이 책에서보고 된 연구는 과학 연구의 기본 구상을 부여 FA9550-12-1-0464의 공군 사무실에 의해 지원됩니다.

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Mechanosensation는 생물 진화 최초의 감각 전달 경로 중 하나를 의미한다. 공부와 DIB의 전기 - 기계 특성을 이해하는데이 현상을 이용하여, 자극 - 반응 기능성 물질 향해 중요한 단계이다. 그것은 mechanoelectrical 변환기 및 지질 이중층 인터페이스 장력 증가를 검출하는 변형 게이지로서 DIB에 mechanosensitive 채널, 후 MsCl의 결합 및 활성화를 수반한다. 다른 주에, MS 채널의 기능은 두께, 극한 곡률 및 압축성을 포함한 지질 이중층의 기본 물성을 통해 조절 될 수있다. 전술의 관점에서, 마이크로 피펫 기반 기술 연구원 DIB의에서 MS 채널을 연구 및 지질 이중층의 구조뿐만 아니라, 지질 - 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 능력을 허용하는 유용한 도구를 제공한다. 지난 3 년간 이상들, 패치 클램프는 전압과 긴장 모두의 클램핑을 할 수 있기 때문에, MS 채널을 연구하는 기본 방법이었다. 그러나, 패치 클램프는 부피가 큰 장비 소형화, 감각 및 변환 장치의 설계에 필요한 속성에 대한 적합하지가 ​​필요합니다. 그 단순성과 안정성, 소형화로 인해의 MsCl은 DIB의 활성을 연구하기에 적합한 환경을 나타낸다. 여기서는 액적 및 이중층 인터페이스의 크기, 각각의 방울의 화학 조성 및 동적 자극을 통해 계면 장력을 제어 할 수있는 능력과, 마이크로 피펫 기반 기술을 제안하여 DIB 형성 기법 이전 진보를 연장한다. 기술은 동축 유리 모세관 대향 팁, 테오 함유 수성 액 적을 고정 이루어져있다. 접촉 계면에서의 지질 이중층을 형성하게 할 때, 유기 용제 액의 욕조에 넣고있다. P는 마이크로 피펫에 부착된다방울의 수평 변위를 허용 iezoelectric 발진기. 동적 물 오일 계면에서 계면 장력의 증가에 따라서 이중층 장력의 증가 방울 결과를 압축. 두 가지 주요 측면은 유사과 최근 발표 된 연락처 거품 이중층 (CBB) 기술 (37)에서이 방법을 차별화. 여기에 제공된 기술을 사용하여, 이중층의 크기가 미세 조작기를 이용하여 제어되고, 이에 따라 액 적의 볼륨 CBB 방법에서와 달리, 일정하게 유지. 또한, CBB 기술은 단순하고 구축하기 쉬워 본 논문에서 제시된 방법에서 필요하지 않은 가압 펌프를 요구한다. 우리는 통합 및 패치 피펫 또는 화학적 변형 (38)의 사용없이 처음 세균성 후 MsCl을 자극 할 수있다. 시스템은 강력한 지질 이중층 비대칭 막의 형성을 용이하게하므로,보다 밀접 L을 모방생물 세포막에서 발견 IPID 비대칭. 이것의 MsCl 활동 제어 막 조성물 또는 비대칭의 효과를 연구하기 위해있게 해준다. 또한, 화상 처리 기술을 통해,이 방법은 이중층 계면 장력을 추정 할 수 있습니다. DIB에서 벌크 및 표면 세력 사이의 상호의 원리를 이해하는데이 기술 어시스트, 기본적인 막 특성의 측정을 용이하게하고, 긴장을 막 후 MsCl 응답의 이해를 향상시킨다. 이 방법은 후 MsCl을 연구 걸음 더 가까이 생체 분자 자극 - 반응 물질 시스템을 향한와 다른 생리 학적 환경에 우리가 걸립니다 만, 시스템에 대한 제한 사항이 있습니다. 이 시스템에서의 장력으로 인해 오일 / 물 계면 장력을 완화하는 경향이 각 액적에서 리포좀 형태의 지질 저장소의 존재에 클램프 될 수 없다. 따라서, 현재의 mechanosensitive 채널에서 자극 할 수있다단지 동적 정권에서 DIB의에. 시스템에서의 기포의 존재는 상당히 실험의 정밀도 및 재현성에 영향을 준다. 하이드로 겔에 존재하는 기포는 전기 연결의 경우 손실이 발생할 수 있습니다. 우리의 MsCl 자극 마이크로 피펫 기반 방법의 사용을 설명하지만,이 기술은 MS 채널들의 다른 유형을 연구하기 위해 사용되며, 생체 분자의 다양한 연구하는 연구자에 의해 사용될 수있는 잠재력을 보유 할 수있다. 예를 들어, 유사한 설정이없는 채널 액적 인터페이스 이중층 막의 mechanoelectrical 반응을 연구하기 위해 실험에 사용되었다. 다양한 단백질을 재구성하고 각 생체 분자의 재구성 환경 변화를 고려하여 복용이 높은 제어 설정을 사용하여 활성화 할 수있다. 이 문서에서 설명하는 방법은 연구자의 상상력에 제한되어 상당히 넓은 응용 가능성에 감동.

지난 10 년간, 인공 지질 이중층의 조립체는 실질적 액적 인터페이스 이중층 방법의 개발로 발전되고있다. 안정적이고 견고한로 알려진, DIB의은 (뮐러) 그린 고전 접혀 (Montal - 뮐러) 평면 이중층 1 대안 모델 시스템으로 자신을 부과했다. 지질 이중층을 만드는 방울을 사용하는 개념은 1960 년대로 거슬러 2 있지만, 최근까지 인기를 얻고 않았다. 최초의 성공적인 시도는 베일리 그룹 4-6에 의해 소적의 네트워크를 사용하는 이중층의 형성을 보여주는 여러 연구 하였다 Takeushi 군 (3)에 의해보고되었다. 보다 최근에는, 밀봉 기술은 새로운 자극에 반응하는 물질 시스템 (10)의 빌딩 블록으로 DIB의 사용의 개념을 개척 레오 그룹 7-9에 의해 제안되었다. 이전 연구에서, DIB의 전기 9,11, 화학 반응 할 수있는 능력을 입증10, 12의 iCal, 광 자극 (13). DIB 10, 14에서 재구성 할 때 다른 자극에 반응하는 기능을 가진 다양한 생체 분자를 효과적으로 자극하고있다. 중요한 문제가 발생이 성공적인 시도에 비추어 : 기계적인 자극에 DIB의 응답이 때 적절한 생체 분자가 포함되어 있을까? DIB에 작용하는 계면 힘은 다른 이중층 시스템 (15, 16)과 다를. 따라서, 액적 보유한 이중층에 장력 물 지질 오일 계면 장력을 조절함으로써 제어 될 수있다; 페인트 또는 접힌 이중층 시스템에 적용 할 수없는 개념입니다. 널리 osmolyte 릴리스 밸브와 세균의 세포질 막의 기본 요소로 알려진 후 MsCl 채널은, 증가 된 장력 막 (17, 18)에 반응한다. 하이포 삼투압 충격의 경우에, 여러 개의 채널이 작은 셀에 존재하는 막 (19)을 생성 할 수 MAS시브 투과성 반응은 신속하게 용해 (20) 박테리아를 저장, 이온과 작은 분자를 분리합니다. Biophysically, 후 MsCl 잘 연구하고 눈에 띄는 패치 클램프 기법 21-23을 통해 주로 특징. 후 MsCl의 게이팅 메커니즘 (24, 25)을 설명하는 신뢰할 수있는 구조 모델의 동체의 크리스탈 (28) 모델링 구조 26, 27, 및 광범위한 실험 24,29-31의 결과를 바탕으로 제안되고있다. ~의 적용 긴장에서 10 mN의 / M, 횡단 나선의 꽉 번들로 구성되어 닫힌 채널은 ~ (28)의 물이 채워진 도전 기공 21,24,32를 형성 크게 기울어 나선의 고리로 변환합니다. 또한 내측 TM1 도메인의 교차점에 위치하는 게이트 타이트의 소수성은, 채널 (33)의 작동 임계 값을 결정하는 것으로 확립되어있다. 이에 대응하여, 그 발견 된 해당 게이트의 소수성을 감소시킴으로써, 장력N 임계 값 (22)을 낮게 할 수있다. 의 MsCl이 속성은 주로 약물 전달을 위해, 다양한 제어 밸브 (34)의 설계 가능. 모든 전술 특성 및 전기 생리 활동에 세포막 과도한 긴장을 번역하는 근본적인 역할에 따라, 후 MsCl는 DIB의에서 mechanoelectrical 변환기로 좋은 착용감을합니다. 이 글에서, 우리는 기계적인 자극에서 통합 후 MsCl 채널의 활동을 DIB의 형성 및 측정하는 원래의 마이크로 피펫 기반 방법을 제시한다. 우리는 처음과 DIB의 기계적 자극 (35)의 MsCl V23T 낮은 임계 변이체의 기능적 재구성 DIB의 행의 응답을보고한다. 실험 시스템은 두 개의 반대 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때 지질 이중층 인터페이스는 fo를 인rmed. 이 기법은 각각의 액적 (벌크)의 화학 조성과 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 치수를 제공한다. 또한, 각 전단 각종 지질 조성물 비대칭 막을 용이하게 형성 할 수있다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 미리 프로그래밍 된 단일 사이클 또는 진동 자극을 적용 할 수있는 능력을 제공한다. 장력을지지 두 방울의 압축을 통해 인공 막에 전달된다. 액적 변형의 결과로, 수분 - 지질 오일 인터페이스 증가와 동시에 물방울이 이루는 각의 영역은 막의 장력 과도 후 MsCl 활성의 증가를 초래 감소한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 문서의 초점은 DIB의 메카 - 전달 특성에 비록, 우리는 또한 강조 다른 종류의 바이오이러한 alamethicin 같은 분자는이 다기능 플랫폼에 의해 활성화 될 수있다. 우리는, 제조, 조립, 및 단계적인 방식으로이 새로운 방법으로 측정을 모든 기술적, 여기에 제시한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

후 MsCl는 큰 전도도 mechanosensitive 채널 (MSC)는 박테리아가 갑작 저자 삼투 충격을 생존하는 데 도움이되는 유비쿼터스 osmolyte 릴리스 밸브입니다. 그것은 발견 엄격 거의 30 년 동안 패치 - 클램프 기술을 이용하여 연구되었다. 투자율 응답으로 세포막에인가 장력 번역 기본적인 역할은 인공 막 기반 장치에 생체 분자 mechanoelectrical 변환기 역할을 유력하게. 이러한 장치에 빌딩 블록으로서, 액적 인터페이스 이중층 (DIB의)는 후 MsCl 채널의 혼입 및 자극 새로운 플랫폼으로 사용될 수있다. 여기서는 인용 후 MsCl 채널의 활성을 DIB의 형성과 측정 마이크로 피펫 기반 방법을 설명한다. 이 방법은 두 상대 (동축 위치) 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때, 지질 이중층 인터페이스이다형성했다. 이러한 기술은 화학 성분과 각각의 액적 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 크기를 제공한다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 원하는 진동 자극을 전달하는 기능을 제공한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 기술을 사용하여, DIB 시스템 후 MsCl 채널들의 제 활성이보고되어있다. MS 채널 외에 채널의 다른 유형의 활동이 플랫폼의 다중 기능을 증명하는,이 방법을 이용하여 연구 할 수있다. 여기에 제시된 방법은, 기본 막 특성의 측정을 가능하게 대칭 및 비대칭 막의 형성을 통해 더 큰 제어를 제공하고, 자극 mechanosensitive 채널을 연구하는 또 다른 방법이다.

도 1 및 지질 이중층 막의 기계적 자극의 과정에서 단백질 활성을 기록하는 2 디스플레이 실험 장치 및 장비를 사용 하였다. 우리의 측정에 전기 노이즈를 최소화하기 위해, 워크 스테이션이 실험실 만든 패러데이 케이지 내에 배치되고, AxoPatch 200 B 앰프의 접지 연결에 접지. 안정적인 절연 지질 이중층의 형성은이 연구에서 핵심적인 단계이다. 이러한 구성에서, 지질 단층은 유기 용매 조에 침지 수성 액적 오일 / 물 계면에서 조립. 물방울이 접촉하여 배치되는 경우, 과량의 오일을 제거하고, 두 분자 두께의 지질 이중층에 대향 지질 단층 얇다. 이중층 특성화에 사용되는 가장 일반적인 방법은 전압 클램프이다. 전류를 측정하면서, 전압 클램프, 이중층 양단의 전압은 일정한 값으로 유지된다.도 4 </strong&gt; 초기 이중층 형성의 전형적인 실시간 현재 녹화를 그렸다. 특정 용량 (~ 0.6 μF / cm 2) DPhPC 지질 이중층 5를 알면, 이중층의 형성 영역을 산출 할 수있다. 이중층 영역 방울 (도 4A)의 위치를 변화시킴으로써 제어 될 수있다. 압전 액츄에이터를 이용하여, 상이한 주파수, 진폭과 듀티 사이클에서의 파형 (정현파, 사각형, 삼각형, 등.)의 종류가 가로로 물방울인가 축 방향 그들을 진동하므로, 이중층 장력 영역은 변경 될 수 될 수있다 (그림 4B). DIB 기계적 자극되면 막을 가로 질러 일정한 DC 전위를 유지하면서,의 MsCl 낮은 임계 (기능 획득) V23T 돌연변이는 주로 서브 도전 상태와 때때로 전체 개방 이벤트를 포함하여 안정적인 작업을 생성한다 (도 5) . 이 EV엔트는 정제 후 MsCl V23T으로 재구성 그대로 내부 대장균 및 리포좀 막에서 패치 - 클램프 기술을 이용하여 기록 된 것과 동일하다. 도 5의 결과는 모든 전류 스파이크가 압축 피크에서 관측되기 때문에 그 게이트는, 장력의 증가에 반응하여 발생 증명. 최대 압축에, 물방울의 상대 면적 확대가 최대이므로, 계면 장력은 최대이다. DC 전압이 막 (36)을 가로 질러인가 될 때 Alamethicin, 전압 관문 이온 채널과 가장 공부 펩티드 중 하나는, 세포막 투과성을 증가시킨다. 막 횡단 단백질 및 펩티드를 호스트 지질 이중층 인터페이스의 능력은 또한 펩티드 alamethicin 사용 전압 게이팅 현재 녹화를 수행함으로써 테스트된다. Alamethicin 100 NG / ml의 최종 농도 인지질 용액과 혼합된다. (6)는 아래에 전류 측정을 보여준다<html> 전압 클램프 (115 MV). 이 실험에서 작은 방울 이중층 인터페이스 따라서 더 높은 저항 및 더 작은 커패시턴스를 달성하기 위해 이격 당겨진다. Alamethicin 펩타이드의 게이팅 동작 전류 (그림 6)의 분리 단계를 통해 표시됩니다. 플롯의 우측의 막대 그래프는 기본적 채널 자체의 제 컨덕턴스 레벨 인 기준 레벨 (0.0962하고 nS)의 컨덕턴스 변화를 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> 그림 1. 주요 부품, 오일 저장소의 크기를 설명하기위한 개략 오일 리저 버지니아 테크 기계 공장에서 제조된다. 그것은 아크릴 시트의 표면에 접착 가공 원통형 아크릴 튜브로 구성되어 있습니다. 치수 및 디자인은 다른 응용 프로그램 또는 두 개 이상의 마이크로 피펫을 수용하도록 변경 될 수있다./53362/53362fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> 그림 2. 실험 장치 및 마이크로 피펫 제조 (A) 기계적으로 형성하는 자극과 인터페이스 이중층을 특성화 표준 워크 스테이션 현미경, 3 축 매니퓰레이터, 디지털 카메라, 압전 진동자, 방진 테이블 및 패러데이 케이지를 포함 (도시되지 않음). (나) 실험 장치는 수평 헥사 데칸 오일 목욕 내에 위치이 반대 PEG-DMA 하이드로 겔 충전 가능한 Micropipette로 구성되어 있습니다. 마이크로 피펫의 각각은 전기적인 접속을 제공하는 Ag / AgCl 전극 포함. proteoliposome 용액으로 채워진 마이크로 피펫 셋째는 다른 마이크로 피펫의 선단에 액 적을 형성하기 위해 사용된다. (C) DIB 전류 반응을 측정 할 수 있었다패치 증폭기 및 저잡음 데이터 획득 시스템의 조합을 사용. (D)는 마이크로 피펫의 끝 부분에 형성된 수성 방울을 보여주는 그림을 마감했다. (E)의 Ag / AgCl을 전극에 표백제 개의 250 ㎛의은 와이어의 선단을 침지하여 제조된다. 전극은 고화 UV 광 경화 PEG-DMA 하이드로 겔로 충전 두 보로 실리케이트 유리 모세관을 통해 공급된다. 남성 커넥터 직선 미세 전극 홀더는 패치 증폭기의 headstage에 가능한 Micropipette 중 하나에 연결하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> 도 3 :. 액적 인터페이스 이중층의 형성을 도시하는 이미지 (A) 테오 가득 10 μm의 마이크로 피펫을 마이크로 피펫 팁 부근의 현미경으로 위치된다. 마이크로 피펫에 연결된 주사기를 사용하여, 작은 양을 분배테오의 원하는 볼륨으로 구형의 물방울을 형성한다. 방울 10 분 동안 앉아있을 수 있도록하여 단층 양식을 보자. 접촉에 방울을 가져; 계면에서의 모든 오일이 제거 된 후에는 이중층 형성 할 것이다. 이중층이 형성되어 있지만, 인터페이스의 양측 화학 성분은 마이크로 사이즈의 마이크로 피펫을 이용하여, 원하는 약품 주입에 의해 제어 될 수있다 (B). (C) 제의 접촉 순간 방울. (D) 지질 이중층을 형성 방울. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> 도 4 : 실시간 측정은 초기 씨닝 및 인터페이스의 후속 팽창 모두 표시 삼각 전위의인가를 통해 이중층의 형성 과정에서 측정 (A)를 현재.. 측정 된 전류의 크기 capaci 정비례tance 및 이중층 인터페이스 따라서 영역. 인터페이스와 그 반대의 지역 더 큰, 작은 물방울이 함께하게된다 가까이. 기계적 자극인가시 (B)는, 이중층 계면의 면적이 증가하고, 자극 신호와 동일한 주파수에서 감소한다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> 도 5 :. 실시간 측정은 기계적 자극에 이중층의 응답뿐만 아니라의 MsCl V23T 변이체 게이팅 표시 전류 응답의 형상의 결과로서 이중층 커패시턴스에 정현파 변화에 관한 것으로, 이는 사인파 이중층 지역 변경. 전류 스파이크는, 각 사이클의 피크에서 발생, V23T 돌연변이의 하위 전도 게이팅을 나타냅니다. 상기 극성 플롯 게이팅 이중층 계면 장력의 증가를 반영하는 피크 압축 발생 것을 나타낸다. 그림 6 :. 전압 클램프 및 통합 Alamethicin 채널의 게이팅 활동에 대한 전도도 수준의 대응 히스토그램에서 전류 측정 Alamethicin 펩타이드의 게이팅 동작 전류의 이산 단계적인 증가를 통해 표시됩니다. 전도 수준은 버지니아 공대 7에서 우리의 연구 그룹에 의해 수행 이전의 측정과 매우 잘 일치합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K 조회수.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보?...

비디오: Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

전기 생리학 실험을위한 인공 Bilayers의 준비

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...