Recherche présentée dans cette publication est soutenue par l&#39;Office de la Force aérienne de l&#39;Initiative de recherche scientifique fondamentale Grant FA9550-12-1-0464.

<ol>
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Les auteurs ont rien à révéler.

Mécanosensibilité signifie l&#39;une des premières voies de transduction sensorielle qui ont évolué dans les organismes vivants. L&#39;utilisation de ce phénomène pour l&#39;étude et la compréhension des propriétés mécano-électrique de la DIB, est une étape cruciale vers matériaux stimuli-sensibles fonctionnels. Elle implique l&#39;incorporation et l&#39;activation d&#39;un canal mécanosensible, MscL, dans la DIB comme un transducteur mécano et une jauge de contrainte pour détecter l&#39;augmentation de la tension dans l&#39;interface lipidique bicouche. Sur une autre note, la fonction de canaux MS pourrait être réglementée par les propriétés du matériau de base de bicouches lipidiques, y compris l&#39;épaisseur, la courbure intrinsèque, et la compressibilité. À la lumière de ce qui précède, la technique basée-micropipette fournit un outil précieux permettant au chercheur d&#39;étudier la capacité des canaux dans la SEP DIB et donne un aperçu de la structure dans la bicouche lipidique, ainsi que les interactions lipide-protéine. Au cours des trois dernières annéess, patch-clamp était la principale méthode pour étudier les canaux MS, car elle permet à la fois de la tension de serrage et de tension. Cependant, patch-clamp nécessite un équipement encombrant et ne convient pas pour la miniaturisation, une propriété nécessaire pour l&#39;ingénierie des dispositifs sensoriels et de conversion. DIB en raison de leur simplicité, de stabilité, et la compacité représentent un environnement approprié pour étudier l&#39;activité de MscL. Ici, nous présentons avances précédentes dans les techniques de formation DIB en proposant une technique basée micropipette, avec la capacité de contrôler la taille des gouttelettes et de l&#39;interface de deux couches, la composition chimique de chaque gouttelette, et la tension à l&#39;interface à travers la stimulation dynamique. La technique consiste à ancrer gouttelettes aqueuses, contenant des protéoliposomes, aux extrémités opposées de façon coaxiale capillaires en verre. Les gouttelettes sont placés dans un bain de solvant organique et lorsqu&#39;ils sont mis en contact un lipide formes bicouches à l&#39;interface. Les micropipettes sont attachés à piezoelectric oscillateurs, ce qui permet un déplacement horizontal de gouttelettes. Comprimer dynamiquement les gouttelettes entraîne une augmentation de la tension interfaciale à l&#39;interface eau-huile et donc une augmentation de la tension de la bicouche. Deux aspects majeurs différencient cette méthode à partir de la technique 37 contacts bulle similaire et a récemment publié bicouche (CBB). Utilisation de la technique présenté ici, la taille de la bicouche est contrôlé en utilisant des micromanipulateurs et donc les volumes des gouttelettes restent constantes, contrairement à la méthode CBB. En outre, la technique CBB appelle des pompes à pression, qui ne sont pas nécessaires dans la méthode présentée dans ce document rendant plus simple et plus facile à construire. Nous sommes en mesure d&#39;intégrer et de stimuler MscL bactérienne pour la première fois sans l&#39;utilisation d&#39;une pipette de patch ou de modifications chimiques 38. Étant donné que le système facilite la formation de membranes asymétriques robustes bicouches lipidiques, il imite plus étroitement la lasymétrie ipid trouvé dans les membranes biologiques. Cela nous permet d&#39;étudier les effets de la composition de la membrane contrôlée ou d&#39;asymétrie sur l&#39;activité de MscL. En outre, grâce à des techniques de traitement d&#39;image, ce procédé permet d&#39;estimer la tension à l&#39;interface de deux couches. Cette technique aide à comprendre les principes de interconversion entre les forces de surface et de volume dans la DIB, facilite les mesures des propriétés fondamentales de la membrane, et améliore la compréhension de la réponse à la membrane MscL tension. Bien que cette méthode nous emmène un pas de plus vers un système matériel de stimuli-sensibles biomoléculaire et à un environnement physiologique différente pour étudier MscL, il ya des limites au système. La tension dans ce système ne peut pas être serré en raison de la présence du réservoir de lipide sous la forme de liposomes dans chaque gouttelette, ce qui tend à réduire la tension à l&#39;interface huile / eau. Par conséquent, à l&#39;heure actuelle les canaux mécanosensibles peut être stimuléedans DIB que dans un régime dynamique. La présence de bulles d&#39;air dans le système affecte de manière significative la précision et la reproductibilité des expériences. Les bulles d&#39;air présentes dans les hydrogels pourraient entraîner la perte si la connexion électrique. Bien que nous décrivons l&#39;utilisation de la méthode de la micro-pipette pour la stimulation de MscL, la technique peut être utilisée pour étudier d&#39;autres types de canaux de sclérose en plaques et a le potentiel d&#39;être utilisée par les chercheurs pour étudier une variété de biomolécules. Par exemple, la configuration similaire a été utilisée dans notre laboratoire pour étudier la réponse de mécano une interface gouttelette membrane bicouche libre en forme de canal. Diverses protéines pourraient être reconstituées et activés à l&#39;aide de cette configuration très contrôlé, en prenant en considération que les environnements de reconstitution de chaque biomolécule varient. La méthode décrite dans cet article touche à un potentiel d&#39;application beaucoup plus large qui est limitée seulement à l&#39;imagination du chercheur.

Dans la dernière décennie, l&#39;assemblage des bicouches lipidiques artificielles a été avancé à travers sensiblement la mise au point de la méthode de la double couche d&#39;interface des gouttelettes. Connu comme stable et robuste, DIB se sont imposés comme des systèmes de modèle alternatif à la classique peint (Mueller) et pliés (Montal-Mueller) planes bicouches 1. Bien que l&#39;idée d&#39;utiliser des gouttelettes de créer bicouches lipidiques remonte aux années 1960 2, il n&#39;a pas gagné en popularité jusqu&#39;à récemment. La première tentative réussie a été rapporté par le groupe Takeushi 3, suivie par plusieurs études démontrant la formation de bicouche en utilisant un réseau de gouttelettes par le groupe Bayley 4-6. Plus récemment, des techniques d&#39;encapsulation ont été proposées par le groupe Leo 7-9, qui a lancé le concept de l&#39;utilisation de fichiers DIB comme blocs de construction de 10 nouveaux systèmes matériels stimuli-sensibles. Dans des études antérieures, DIB ont prouvé leur capacité à répondre à 9,11 électrique, chemical 10,12, et 13 stimuli optique. Diverses biomolécules avec des fonctionnalités différentes de stimuli-sensibles ont été effectivement stimulé lorsqu&#39;il est reconstitué dans la DIB 10,14. À la lumière de ces tentatives réussies une question importante se pose: la DIB pourrait répondre à un stimulus mécanique lors de biomolécules appropriées sont incorporés? Les forces interfaciales agissant sur ​​un DIB diffèrent de ceux des autres 15,16 système bicouche. Par conséquent, la tension dans la bicouche est tenue par des gouttelettes peut être contrôlée par le contrôle de la tension aux interfaces eau-lipide-huile; un concept pas applicable aux systèmes bicouches peintes ou pliées. MscL canaux, largement connu que les vannes osmolyte de libération et les éléments fondamentaux de la membrane cytoplasmique bactérienne, réagissent à l&#39;augmentation de la tension de la membrane 17,18. Dans le cas de chocs hypo-osmotique, plusieurs canaux résidant dans la membrane d&#39;une petite cellule 19 peut générer un masréponse de perméabilité sive pour libérer rapidement les ions et les petites molécules, sauver les bactéries de lyse 20. Biophysique, MscL est bien étudié et caractérisé principalement par le biais de la technique de patch clamp éminent 21-23. Modèles structurels fiables expliquant le mécanisme de déclenchement de 24,25 de MscL sont proposées sur la base de la structure de son homologue de cristal 26,27, 28 modélisation, et les résultats d&#39;une expérimentation 24,29-31. Sous une tension appliquée de ~ 10 mN / m, le canal fermé qui est constitué d&#39;un faisceau serré des hélices transmembranaires, se transforme en un anneau d&#39;hélices fortement inclinés formant un ~ 28 Å rempli d&#39;eau pores conducteur 21,24,32. Il a également été établi que le caractère hydrophobe de la porte étanche, placé à l&#39;intersection des domaines TM1 interne, détermine le seuil d&#39;activation de la voie 33. En conséquence, il a été trouvé que l&#39;hydrophobicité en diminuant de la porte, le tensioseuil de n 22 pourrait être abaissé. Cette propriété de MscL rendu possible la conception de diverses vannes contrôlables 34, principalement à des fins de délivrance de médicaments. Pour toutes les propriétés mentionnées ci-dessus et sur la base de son rôle fondamental de traduire la membrane cellulaire des tensions excessives dans les activités électrophysiologiques, MscL fait un grand ajustement comme un transducteur mécano dans DIB. Dans cet article, nous présentons une méthode basée sur la micropipette d&#39;origine pour former des DIB et de mesurer l&#39;activité des canaux MscL constituée en vertu de la stimulation mécanique. Nous rapportons pour la première fois, la réponse de DIB à un stimulus mécanique et la reconstitution fonctionnelle du mutant V23T faible seuil de MscL dans DIB 35. Le système expérimental est constitué de lipides enfermé gouttelettes aqueuses ancrés aux conseils de deux micropipettes de verre borosilicate opposées. Lorsque les gouttelettes sont mises en contact d&#39;une interface de bicouche lipidique est formée. Cette technique permet de contrôler la composition chimique et la taille de chaque gouttelette (en vrac), ainsi que les dimensions de l&#39;interface à deux couches. En outre, des membranes asymétriques avec différentes compositions lipidiques dans chaque feuillet pourraient facilement être formés. Ayant l&#39;une des micropipettes attachés à un actionneur piézo-électrique harmonique, permet d&#39;appliquer un seul cycle préprogrammé ou stimulus oscillatoire. La tension est fournie à la membrane artificielle par la compression de deux gouttelettes qui le soutiennent. À la suite de la déformation de la gouttelette, les domaines de l&#39;eau-huile-lipide interfaces augmentation, et simultanément l&#39;angle entre les gouttelettes diminue, ce qui provoque une augmentation de la tension de la membrane et MscL activation transitoire. Grâce à l&#39;analyse de la forme des gouttelettes lors de la déformation, la tension créée à l&#39;interface peut être estimé. Même si l&#39;accent dans cet article est sur les propriétés mécano-transduction de la DIB, nous soulignons également que d&#39;autres types de biomolécules, telles que alaméthicine, peuvent être activés par cette plate-forme multi-fonctionnel. Nous présentons ici, tous les aspects techniques de la préparation, de l&#39;assemblage, et en prenant des mesures avec cette nouvelle méthode d&#39;une manière étape-par-étape.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL, un canal mécanosensible grande conductance (MSC), est une soupape de libération osmolyte omniprésente qui aide les bactéries survivent chocs hypo-osmotique brusques. Il a été découvert et étudié rigoureusement en utilisant la technique de patch-clamp pendant près de trois décennies. Son rôle de base de la conversion tension appliquée à la membrane cellulaire en réponse à perméabilité en fait un candidat solide pour fonctionner comme un transducteur mécano biomoléculaires dans des dispositifs à base de membranes artificielles. Servir comme blocs de construction de tels appareils, bicouches d&#39;interface des gouttelettes (de DIB) peuvent être utilisés comme une nouvelle plateforme pour l&#39;intégration et la stimulation des canaux MscL. Ici, nous décrivons une méthode basée micropipette pour former DIB et de mesurer l&#39;activité des canaux MscL incorporés. Cette méthode consiste à gouttelettes aqueuses lipides enfermé ancrés aux conseils de deux opposées (coaxiale) positionnés micropipettes de verre borosilicate. Lorsque les gouttelettes sont mises en contact, une interface bicouche lipidique estformée. Cette technique permet de contrôler la composition chimique et la taille de chaque gouttelette, ainsi que les dimensions de l&#39;interface à deux couches. Ayant l&#39;une des micropipettes attachés à un actionneur piézo-électrique harmonique permet de délivrer une impulsion d&#39;oscillation désirée. Grâce à l&#39;analyse de la forme des gouttelettes lors de la déformation, la tension créée à l&#39;interface peut être estimée. En utilisant cette technique, la première activité des canaux MsCl dans un système de DIB est rapporté. Outre les canaux MS, activités d&#39;autres types de canaux peuvent être étudiés en utilisant cette méthode, prouvant la multi-fonctionnalité de cette plate-forme. La méthode présentée ici permet la mesure des propriétés de la membrane fondamentale, offre un plus grand contrôle sur la formation des membranes symétriques et asymétriques, et est une autre façon de stimuler et étudier canaux mécanosensibles.

Figures 1 et 2 affichage de la configuration et de l&#39;équipement expérimental utilisé pour enregistrer l&#39;activité de la protéine au cours de la stimulation mécanique de la membrane bicouche lipidique. Pour minimiser le bruit électrique dans nos mesures, le poste de travail est placé dans une cage de Faraday de laboratoire réalisés, à la terre pour une connexion de terre sur la Axopatch 200 B Amplificateur. Formation d&#39;une écurie isolant bicouche lipidique est une étape clé dans cette étude. Dans cet agencement, une monocouche lipidique assemble à l&#39;interface huile / eau des gouttelettes aqueuses immergés dans un bain d&#39;un solvant organique. Lorsque les gouttelettes sont mises en contact, l&#39;excès d&#39;huile est éliminée, et les monocouches lipidiques opposées mince à une épaisseur de deux molécules bicouche lipidique. La technique la plus couramment utilisée dans la caractérisation bicouche est voltage-clamp. Avec voltage-clamp, la tension aux bornes de la double couche est maintenue à une valeur constante tandis que le courant est mesuré. Figure 4 </strong&gt; dépeint un enregistrement actuel en temps réel typique de la formation initiale de la bicouche. La connaissance de la capacité spécifique (~ 0,6 uF / cm 2) de la 5 bicouche lipidique DPhPC, la zone de la bicouche formée a pu être calculée. La zone de la bicouche peut être contrôlée en changeant la position des gouttelettes (figure 4A). Utilisation de l&#39;actionneur piézo-électrique, différents types de formes d&#39;onde (sinusoïdale, carrée, triangulaire, etc.) À des fréquences différentes, des amplitudes et des cycles de service pourraient être appliquées aux gouttelettes à horizontalement et axialement entre eux oscillent et donc, la tension de la bicouche et de la zone pourraient être modifiées (Figure 4B). Si la DIB est mécaniquement stimulée, tout en conservant un potentiel continu constant à travers la membrane, un seuil bas (gain de fonction) mutant V23T de MscL génère des activités fiables, y compris surtout les États sous-conducteurs et des événements parfois pleins d&#39;ouverture (Figure 5) . Ces events sont identiques à ceux enregistrés en utilisant la technique patch-clamp de membranes intactes intérieures E. coli et des liposomes reconstitués avec le V23T MscL purifiée. Les résultats de la figure 5 montrent que déclenchement se produit en réponse à une augmentation de la tension, étant donné que toutes les pointes de courant sont observés à la compression maximale. Au compression de crête, l&#39;expansion par rapport surfacique des gouttelettes est maximale et, par conséquent, la tension à l&#39;interface est maximale. Alaméthicine, un canal ionique voltage-dépendant et l&#39;un des peptides les plus étudiés, augmente la perméabilité de la membrane lorsqu&#39;une tension continue est appliquée à travers la membrane 36. La capacité de l&#39;interface lipide bicouche d&#39;accueillir transmembranaires protéines et des peptides est également testée en effectuant des enregistrements de courant à tension gating en utilisant alaméthicine peptide. Alaméthicine est mélangé avec la solution de phospholipide à une concentration finale de 100 ng / ml. La figure 6 montre les mesures de courant de moins de<html> pince de tension (115 mV). Les gouttelettes dans cette expérience sont séparés afin de réaliser petite interface à deux couches et donc une résistance plus élevée et plus faible capacité. Le comportement de déclenchement du peptide alaméthicine est représenté par les étapes discrètes de courant (figure 6). L&#39;histogramme sur le côté droit de la parcelle présente les variations de la conductance de la niveau de base (0.0962 ns), qui est essentiellement le premier niveau de la chaîne elle-même de la conductance. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figure 1:. Un schéma décrivant les principales parties et les dimensions du réservoir d&#39;huile Le réservoir d&#39;huile est fabriqué dans l&#39;atelier d&#39;usinage à Virginia Tech. Il se compose d&#39;un tube cylindrique usiné acrylique collé à la surface d&#39;une feuille acrylique. Les dimensions et le design peuvent être modifiés pour accueillir différentes applications ou plus de deux micropipettes./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figure 2:. Configuration et micropipettes expérimentale préparation (A) Le poste de travail standard pour former, mécaniquement stimulant, et la caractérisation des bicouches d&#39;interface comprend un microscope, manipulateurs à 3 axes, un appareil photo numérique, un oscillateur piézo-électrique, table d&#39;isolation des vibrations, et une cage de Faraday (pas montré). (B) Le dispositif expérimental se compose de deux opposés PEG-DMA hydrogel rempli micropipettes placés horizontalement dans un bain d&#39;huile Hexadécane. Chacune des micropipettes contient une électrode Ag / AgCl pour fournir une connexion électrique. Un troisième micropipette remplie de protéoliposome solution est utilisée pour former des gouttelettes à la pointe des autres micropipettes. (C) La réponse en courant peut être mesuré de DIBen utilisant une combinaison de l&#39;amplificateur de patch et le système d&#39;acquisition de données à faible bruit. (D) Un fermé photo montrant les gouttelettes aqueuses formées à la pointe des micropipettes. Électrodes (E) Ag / AgCl sont fabriqués en trempant le bout de deux 250 um fils d&#39;argent dans l&#39;eau de Javel. Les électrodes sont ensuite introduites à travers les deux tubes capillaires en verre de borosilicate remplis d&#39;hydrogel de PEG-DMA, qui est durci avec de la lumière UV à se solidifier. Le titulaire de microélectrodes droite avec connecteur mâle est utilisé pour connecter un des micropipettes à l&#39;headstage de l&#39;amplificateur de patch. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Figure 3:. Images qui illustrent la formation de bicouches gouttelettes d&#39;interface (A) à 10 pm micropipette remplie de protéoliposomes est placé sous le microscope à proximité de la pointe de micropipette. En utilisant une seringue reliée à la micropipette, distribuer de petits volumesdes protéoliposomes pour former des gouttelettes sphériques de volume désiré. Laissez la forme de monocouche en permettant aux gouttelettes reposer pendant dix minutes. Apportez les gouttelettes en contact; la bicouche se forme après toute l&#39;huile à l&#39;interface est éliminée. (B) Pendant la bicouche est formé, la composition chimique des deux côtés de l&#39;interface peut être contrôlé par l&#39;injection de produits chimiques désirés au moyen d&#39;un micro-taille micropipette. (C) Les gouttelettes au moment du premier contact. (D) Les gouttelettes lorsque la bicouche lipidique est formée. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figure 4: Mesures en temps réel montrent à la fois l&#39;amincissement initial et l&#39;expansion subséquente de l&#39;interface (A) actuelle mesurée au cours de la formation de bicouche par l&#39;application d&#39;un potentiel électrique triangulaire.. L&#39;intensité du courant mesurée est directement proportionnelle à la capacidistance, et donc la zone de l&#39;interface à deux couches. Plus les gouttelettes sont amenées ensemble, plus la zone de l&#39;interface et vice versa. (B) Lors de l&#39;application de l&#39;excitation mécanique, la zone de l&#39;interface bicouches augmente et diminue à la même fréquence que le signal de stimulation. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Figure 5:. Mesures en temps réel Les montrent la réponse de la bicouche à une excitation mécanique ainsi que le déclenchement du mutant V23T de MscL La forme de la réponse en courant est sinusoïdal, qui se rapporte à un changement sinusoïdal en bicouche capacité à la suite de le changement de zone de bicouche. Les pointes de courant, se produisant à la pointe de chaque cycle, indiquent sous-conductance déclenchement du mutant V23T. Un tracé polaire indique en outre que déclenchement se produit à la compression de pointe, ce qui reflète une augmentation de la tension à l&#39;interface de la bicouche. Figure 6:. Les mesures de courant dans le cadre de serrage et de tension correspondant histogramme de niveaux de conductance de l&#39;activité de déclenchement de canaux incorporés alaméthicine Le comportement de déclenchement du peptide alaméthicine est signalée par l&#39;augmentation par étapes discrètes en cours. Les niveaux de conductance correspondent très bien avec les mesures précédentes effectuées par notre groupe de recherche à Virginia Tech 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Canaux mécanosensibles bactériennes peuvent être utilisés comme capteurs dans des dispositifs mécano biomoléculaires. Bicouches gouttelettes d&#39;interface (DIB), blocs de construction inspiré de cellule à ces dispositifs, représentent de nouvelles plateformes pour intégrer et stimuler les canaux mécanosensibles. Ici, nous démontrons une nouvelle méthode de formation de DIB, permettant l&#39;étude des canaux mécanosensibles sous stimulation mécanique basé micropipette.

Multifonctionnel, Micropipette à base Méthode de constitution et la stimulation de la société Bacterial mécanosensible Canaux ioniques en gouttelettes interface Bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K vues.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  Canaux mécanosensibles bactériennes peuvent être utilisés comme capteurs dans des dispositifs mécano biomoléculaires. Bicouches gouttelettes d'interface (DIB), blocs de construction inspiré de cellule à ces dispositifs, représentent de nouvelles plateformes pour intégrer et stimuler les canaux mécanosensibles. Ici, nous démontrons une nouvelle méthode de formation de DIB, permettant l'étude des canaux mécanosensibles sous stimulation mécanique bas...

Vidéo: Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Préparation de bicouches artificielle pour des expériences d&#39;électrophysiologie

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l&#39;Ion sélectif microélectrodes Technique d&#39;auto-référencement

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Détermination de la surface de la cellule relative et d&#39;expression totale de Recombinant Canaux ioniques par cytométrie en flux

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...