DNは、EU FP7プロジェクトのPEPDIODE（GA 256672）とREGPOT-2012-2013-1（GA 316157）、およびイスラエル科学財団からの個人研究助成金（第10分の268）からの支援を認めています。我々は、共焦点顕微鏡画像を撮影するための教授シュムエルルビンスタイン、工学応用科学の学校、ハーバード大学、ケンブリッジMA、USAに感謝します。

1.準備クロロフィル株価ソリューション<ol><li>重要なステップ：光損傷を最小限にするために、化学フードで、緑色光（520 nm）の下や暗所でのクロロフィルの準備のすべての手順を実行します。必ず、ストレージ用の顔料を凍結する前に、窒素またはアルゴンを追加します。全ての溶媒は分析グレードであることを確認してください。 </li><li>チラコイド膜にのみクロロフィルaを含有する凍結乾燥スピルリナプラテンシス細胞または他のシアノバクテリア細胞の約5mgを秤量し、乳鉢と乳棒を使用してそれをつぶします。 </li><li>負荷は、ガラスカラム上に細胞を破砕し、カロテノイドを除去するために約50〜100mlの％アセトンので洗います。溶出グリーン/オレンジ部分を破棄します。 注：オレンジ画分を100mlのアセトンで溶出されていない場合には、緑色の画分が溶出し始めるまでアセトンで細胞を洗浄し続けます。 </li><li> 100％のメタノールを使用してExchangeアセトンとクロロフィルaを含む緑色画分を収集します。溶出したFRACTの体積イオン50-100 mlの間で変化してもよいです。初めに、溶出画分を溶出の終わりに薄緑色に変化する暗緑色を持っています。溶出画分の色は薄緑色に変わったら溶出を停止します。 </li><li>抽出物が完全に乾燥するまでロータリーエバポレーターを用いてメタノールを蒸発させます。この溶液に熱を加えないでください。エバポレーターの水浴温度が30℃を超えないようにしてください。 注：蒸発時間が蒸発するメタノール画分の量に依存し、10〜60分の間で変化してもよいです。完全にエキスを乾燥させることが重要です。 </li><li>ジエチルエーテル（約5〜10 ml）を少量の乾燥抽出物から顔料を溶解し、脱脂綿でろ過します。顔料が完全にフィルタリングする前に、エーテル中に溶解されていることを確認してください。 </li><li>顔料は（10月30日分）完全に乾燥するまで、ジエチルエーテルを蒸発させます。 注：乾燥顔料はでパージし、で窒素またはアルゴン下に保持することができます-20℃で、さらに処理するまで暗いインチ</li><li>ないすべてが完全に中断されていても、100％メタノール（約1ml）の可能な最小量に乾燥顔料を溶解します。この溶液にアセトンの4ミリリットルを追加し、完全に顔料を溶解させるために穏やかにガラスをフリック。 </li><li>パスツールピペットを用いて、DEAEカラム上に静かにサンプルをロードし、100％アセトンで平衡化したセファロース。 </li><li> 100％アセトンでカロテノイド（橙黄色帯）を溶出します。 1（v / v）のアセトン/メタノール混合物：その後、3とクロロフィル（緑帯）溶出します。 注：アセトン、アセトン/メタノール混合物の体積がカラムに充填セファロースDEAEの容積とほぼ同等です。 </li><li>溶離液17として2ジクロロメタン/ n-ヘキサン/イソプロパノール/メタノール（v / v）の混合物：25：5クロロフィル68を用いた薄層クロマトグラフィーにより純度を確認。 </li><li>クロロフィルaが完全に乾燥するまで（ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させ、10-60分）。 注：乾燥クロロフィル窒素またはアルゴンでパージし、暗所に-20℃でアルゴン雰囲気下で保存することができます。 </li><li> 100％エタノール2〜4 ml中の乾燥クロロフィルaを再溶解することによりクロロフィルに原液を準備します。 注：663 nmでのクロロフィルaの吸光係数は74400センチメートル-1 M -1（83.3センチメートル-1（mg / mlで）-1）エタノールです。典型的なストック溶液を、25mM（23 mg / mlで）の濃度に対応する1860のODを持っている必要があります。クロロフィルの10倍モル過剰の対と混合して有機相の5ミリリットル、及び水相の結果の1ミリリットル中WSCP 1mgを含有するエマルジ ​​ョンに、この株式の20μLを追加しますWSCP。 </li></ol> 2.エマルジョンの有機相を準備注：エマルジョンの有機相（v / v）のスパン80 4.5％を含有する鉱油で構成され、0.4％（v / v）のツイーン80。 <ol><li> Tの50ミリリットルチューブ0.2グラムを計量、80スパン80を1.8g、および鉱油38gのをWEEN。よく、すべての成分を混合し、氷上で冷却します。 注：有機相は、一週間まで4℃で保存することができます。 </li></ol> 3.エマルジョンの水相を準備注：エマルジョンの水相は、精製WSCP、またはWSCPを過剰発現する細菌の粗抽出物のいずれかで構成されてもよいです。 <ol><li>精製WSCPを含む水相を調製しました。 <ol><li> 0.3から0.6のODまで37℃でLB培地1LにWSCPプラスミド12を含む大腸菌 BL21細菌を成長させます。 </li><li> 1mMのIPTGを添加することによってタンパク質発現を誘導します。誘導後12から16時間、30℃で細菌を成長させます。 </li><li> 4℃で10分間、5000×gで遠心分離によって収穫細菌。 </li><li>氷の上にバッファと超音波処理の結合にペレットを溶解させる（上30秒、15秒オフ、5回）。の250ミリリットルの遠心分離から得られたペレットのための緩衝液10mlを使用しますタンパク質を過剰発現する細胞を含むLB培地。 注：精製方法に応じて、結合緩衝液は、100mMのリン酸緩衝液（pH7.2）または50mMのトリス、pH7.5で、500mMのNaCl、5mMのEDTAから構成されてもよいです。 </li><li> 4℃で30分間12,000×gで細胞溶解物をスピンダウン。 </li><li>アフィニティークロマトグラフィーによってWSCPを精製します。 WSCPに融合したタグに応じて、製造業者の指示に従って、タンパク質精製のための適切な市販のアフィニティークロマトグラフィーシステムを使用して組換えタンパク質を精製します。 </li><li>エマルジョン調製のために、50 mMの中の精製WSCPリン酸緩衝液、pH 7.8を使用します。再構成のために使用される最終的なタンパク質の量がバッファの1ミリリットル当たり0.5〜1.0ミリグラムであることを確認してください。 </li></ol></li><li> WSCPで、粗細菌溶解物を含む水相を調製しました。 <ol><li> OD 0.3から0.6まで、37℃でLB培地250ml中のプラスミド発現WSCPを含む大腸菌 BL21細胞を成長させます。 </li><li>でタンパク質発現を誘導します1mMのIPTGおよび30℃で一晩細菌を増殖します。 </li><li> 4℃で10分間5,000×gでの遠心分離によって菌体を回収。 </li><li> 4℃で30分間、12,000×gで50 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.8、超音波処理（上の30秒、15秒オフ、三回）遠心1-2 ml中にペレットを溶解します。 </li><li> 50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.8の0.875 mlの上清0.125 mlと混合して、エマルジョンの水相を調製します。 </li></ol></li></ol>エマルジ ​​ョン中のクロロフィルAとWSCPの4アセンブリ<ol><li>ガラスバイアルへの転送油、界面活性剤混合物の5ミリリットルを、氷上にそれを冷却します。ピペッティングの前に、有機相のすべてのコンポーネントが完全に混合されていることを確認し、界面活性剤や鉱物油との間には相分離はありません。 </li><li>有機相の5ミリリットルにセクション3のように調製した氷冷水相の1ミリリットルを追加します。 </li><li>氷上で9,500 rpmで2分間、組織ホモジナイザーを用いて、両相を混ぜます。</li><li>重要なステップ：上のこの段階から、光損傷を最小限にするために、緑色の光（520 nm）の下にあるすべてのさらなるステップを実行します。 25 mMのクロロフィルストック溶液20μlを加えるエマルジ ​​ョンに（項1.13を参照してください）。フリックとガラスバイアルを反転させて分散させます。クロロフィルが均等にエマルジョンで配布されていることを確認します。 </li><li>暗所で氷上で1〜2時間乳剤をインキュベートします。 </li><li>有機相からエマルジョンおよび独立した水滴を打破するために、室温で5分間、14,000×gで1.5ミリリットルプラスチックチューブと遠心分離機にエマルジョンを転送します。 注意：アセンブリが​​成功した場合、下層の水相は、緑の色を持っている必要があります。 </li><li>上部の油相を廃棄し、鉱油を1ml加えます。ボルテックスによって、あるいは完全にチューブを反転することによってペレット化し、エマルジョンとよくミネラルオイルを混ぜます。室温で5分間、14,000×gでサンプルをスピンダウン。水性および鉱山労働者を分離する明確なメニスカスまで、この手順を繰り返します中間エマルジョンなしアル油相が得られます。 </li><li>化学フード内で、この手順を実行します。水、ミネラルオイル相が明確に分離された後、ミネラルオイルを除去し、水飽和ジエチルエーテルを1ml加えます。ボルテックスし、室温で5分間、14,000×gでサンプルをスピンダウン。二回、この手順を繰り返します。 </li><li> 2回目の遠心分離後、ジエチルエーテルを除去し、フード内で5-20分間開いたチューブを残します。 </li><li>最後に、脱塩カラムにWSCP /クロロフィル複合体を含有する水相をロードし、さらなる実験のための適切な緩衝液で溶出します。 注：タンパク質は、リン酸と広範囲のpH（6.0-7.5）でトリス緩衝液中で安定しています。試料は、1ヶ月まで、光から保護して4℃で保存することができます。 </li></ol>

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	<li>Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+photosynthesis+and+phototrophy+illuminated.">Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated.</a> Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).</li><li>Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+the+difference+in+absorbance+spectra+for+the+FMO+antenna+protein+from+various+green+sulfur+bacteria.">The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria.</a> Photosynth. 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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

私たちの目標は、疎水性の顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質の組み立てのための新しい一般的なシステムを開発することでした。ここでは、W / Oエマルションに基づいて、新たな再構成システムは、組換えE.で表現芽キャベツ、カリフラワー、わさびとバージニアpepperweedからWSCPアポタンパク質のアセンブリのために働くことが証明の一般的なアプローチであることが示されて?...

このようなクロロフィル（Chl類）、バクテリオ（Bchl類）およびカロテノイドのような疎水性顔料は、電子輸送、及び光エネルギーの取り込みと転送を行う光合成反応中心と集光性タンパク質中の主要な補因子です。反応中心およびCH1結合集光複合体の大部分は膜貫通タンパク質です。非酸素発生型光合成緑色硫黄細菌1,2のFenna-マシューズ-オルソン（FMO）タンパク質、および渦鞭毛藻類3のペリジニン-クロロフィルタンパク質（PCP）は、水溶性の集光タンパク質の例外的な例です。水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs） アブラナ科 、 タデ 、 アカザ科のとヒユ科の植物は4、5は、別のユニークな例であり、まだFMOとPCPとは対照的に、これらは、光の収穫にも主要な光合成反応のいずれかの中にも関与しています、およびそれらの正確なPHYsiological機能はまだ5-8不明です。彼らの高クロロフィル結合親和性はChl類及びクロロフィル誘導体の9,10の一過性の担体として示唆された機能につながっています。あるいは、WSCPが損傷を受けた細胞内でChl類を捕捉する役割を果たし、クロロフィルによって誘発される光酸化損傷7,11-13から保護するという仮説が立てられました。最近では、それはプロテアーゼ阻害剤としてのそのWSCP機能を提案し、草食性の間に役割を果たしているだけでなく花の開発14の間の細胞死を調節しました。 WSCPsは、それらの光物理的特性に応じて2つの主なクラスに分けられます。最初のクラス（クラスI、 例えば シロザから）は、照明時に光変換を受けることができます。クラスII、さらなるクラスIIa族に細分化されている（ 例えば 、 キャベツ、ダイコンから）光変換5,10を受けないアブラナ属植物からWSCPsおよびIIb（ 例えば 、 マメグンバイナズナから</eM&gt;）。 Lepidiumのvirginicumからクラス第IIb WSCPの構造は2.0Å分解能8のX線結晶学によって解決しました。これは、タンパク質サブユニットは、疎水性コアを形成する対称​​ホモ四量体を明らかにしています。各サブユニットは、単純なcore.This内の4つの密に詰まったChl類の密な配置になり、単一のクロロフィルは、すべてのクロロフィルの配置がWSCPsクロロフィル - タンパク質複合体の結合および組み立てを研究するための潜在的に有用なモデルシステム、および隣接Chl類の効果を作る結合しそして個々のChl類のスペクトルと電子物性上の​​タンパク質環境。また、人工光合成素子で集光モジュールに使用することができる人工のクロロフィル結合タンパク質を構築するためのテンプレートを提供することができます。 植物から精製された複合体は常にクロロフィルaの異なる組み合わせで四量体の不均一な混合物が含まれているため、ネイティブWSCPsの厳密な研究が実現可能ではありませんそして、クロロフィルbの9。したがって、 インビトロで Chl類と組換え的に発現WSCPsを組み立てるための方法が必要とされます。これは、 インビトロ組立体15が示されたチラコイド膜とアポタンパク質とを混合することによってそれができないだけで、水溶液中で顔料と水溶性のアポタンパク質を混合することによってin vitroで複合体をアセンブルすることができるChl類のごくわずかな水溶解度挑戦しているがこの方法は、チラコイド内のネイティブChl類の存在に限定されています。シュミットら 。組換えにより大腸菌にヒスチジンタグ付きタンパク質を発現させることによってカリフラワー（CaWSCP）からWSCPで、いくつかのクロロフィルとのBchl誘導体を組み立てる上で報告大腸菌は、Ni-アフィニティーカラム上にそれを固定化し、洗浄剤11中に可溶化クロロフィル誘導体を導入します。 A.からの組換えWSCPsのに成功しました再構成シロイヌナズナ 6、および芽キャベツ（BoWSCP）、日本の野生ダイコン（RshWSCP）AN同様の方法により、Dバージニアpepperweed（LvWSCP）も報告されました。 ここでは、小説、タンパク質をタグ付けを必要としないWSCPとChl類を組み立てるまたは固定化するための一般的な、簡単な方法を提示します。これは、鉱油中の水​​溶性アポタンパク質のそれらの水溶液からエマルションを調製するに依存しています。タンパク質は、このように体積比16に非常に高い表面積を有する油中水型（W / O）微小液滴中に封入されています。疎水性の補因子は、次いで、油中に溶解され、容易に油相から液滴に導入されます。我々は、組換えE.で表現WSCPアポタンパク質のいくつかの変異体の組立方法を使用してについて報告しますクロロフィルを持つ大腸菌 。我々は、新規のクロロフィル結合タンパク質を開発するためのスクリーニング系として使用することができるWSCP過剰発現細菌の粗溶解物からアセンブリを示します。

<table><tbody><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.</td></tr><tr><td>His Trap HF column</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td><td>Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag</td></tr><tr><td>DEAE Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>Chromatography medium for chlorophyll purification</td></tr></tbody></table>

water in oil emulsions: a new system for assembling water-soluble chlorophyll-binding proteins with hydrophobic pigments

クロロフィル（Chl類）およびバクテリオ（Bchl類）は光合成集光と電子輸送を行う主要な補因子です。これらの機能は、批判的に大規模と精巧なマルチサブユニット膜貫通タンパク質複合体内での特定の組織に依存します。これらの複合体は、太陽エネルギーの変換を促進する方法を分子レベルで理解するためには、蛋白質顔料、および顔料色素相互作用、励起ダイナミクスへの影響を理解することが不可欠です。このような理解を得る一つの方法は、単純な水溶性組換えタンパク質とChl類の複合体を構築し、研究することによってです。しかし、水溶性タンパク質に親油性Chl類及びBchl類を組み込むことは困難です。また、疎水性の顔料と水溶性タンパク質のアセンブリのために使用することができない一般的な方法は存在しません。ここでは、お尻を可能にする、油中水型エマルジョンに基づく単純かつ高スループットのシステムを示します疎水性のChl類と水溶性タンパク質のembly。新しい方法は、クロロフィルとアブラナ科植物 （WSCP）の水溶性クロロフィル結合タンパク質の組換え型を組み立てることによって検証されました。私たちは、クロロフィルの成功アセンブリをE.を表現WSCPの使用して粗溶解物を実証します新規な水溶性のクロロフィル結合タンパク質のための、およびクロロフィル-タンパク質相互作用及び組立プロセスの研究のための遺伝子スクリーニングシステムを開発するために使用することができる大腸菌細胞。

組換えWSCPアポタンパク質は、前のセクションで説明したプロトコルに従って、W / Oエマルション中のクロロフィルAを用いて組み立てました。プロトコルは純粋WSCPs、または溶解物大腸菌細胞WSCPを過剰発現する（ 図1）のいずれかを含有する水相を用いて実施されました。プロトコルは速く、簡単で、組織ホモジナイザーを除き、特別な装置?...

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油中水型エマルジョン: 水溶性クロロフィル結合タンパク質と疎水性色素を会合させる新しいシステム |化学 |ビデオ

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

この原稿は、油中水型エマルジョンに基づく疎水性顔料と水溶性タンパク質を組み立てるための単純かつ高スループットの方法が記載されています。私たちは、Eで表したアブラナ属植物の組換え水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs）の4種類でネイティブクロロフィルの組み立て方法の有効性を実証します大腸菌 。

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

water-oil-emulsions-new-system-for-assembling-water-soluble

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14.5K ビュー.  Weizmann Institute of Science. この原稿は、油中水型エマルジョンに基づく疎水性顔料と水溶性タンパク質を組み立てるための単純かつ高スループットの方法が記載されています。私たちは、Eで表したアブラナ属植物の組換え水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs）の4種類でネイティブクロロフィルの組み立て方法の有効性を実証します大腸菌 。 

ビデオ: Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

A 'Plug and Play' Method to Create Water-dispersible Nanoassemblies Containing an Amphiphilic Polymer, Organic Dyes and Upconverting Nanoparticles

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate amphiphilic polymers in situ, and describe a protocol to encapsulate the prepared UCNPs and different organic dye molecules (porphyrins and diarylethenes) using polymer shells to form stable water-dispersible nanoassemblies. The nanoassembly samples containing both the UCNPs and the diarylethene organic dyes have interesting photochemical and photophysical properties. Upon 365 nm UV irradiation, the diarylethene group undergoes a visual color change. When the samples are irradiated with visible light of another specific wavelength, the color fades and the samples return to the initial colorless state. The samples also emit visible light from the UCNPs upon irradiation with 980 nm near-infrared light. The emission intensity of the samples can be tuned through alternate irradiation with UV and visible light. Modulation of fluorescence can be performed for many cycles without observable degradation of the samples. This versatile encapsulation procedure allows for the transfer of hydrophobic molecules and nanoparticles from an organic solvent to an aqueous medium. The polymer helps to maintain a lipid-like microenvironment for the organic molecules to aid in preservation of their photochemical behavior in water. Thus this method is ideal to prepare water-dispersible photoresponsive systems. The use of near-infrared light to activate upconverting nanoparticles allows for lower energy light to be used to activate photoreactions instead of more harmful ultraviolet light.

Organic dye molecules and oleic acid coated upconverting nanoparticles are not water-soluble. This protocol describes a &#8216;plug and play&#8217; method that enables the transfer of organic dye molecules and upconverting particles from their initial hydrophobic solvent to water.

「プラグアンドプレイ」両親媒性ポリマー、有機染料及びアップコンバーティングナノ粒子を含む水分散性Nanoassembliesを作成する方法を

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate ...

化学

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

生化学

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

生物工学

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

水/空気界面で疎水性有機分子をドープしたハイブリッド脂質膜の自己集合

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic properties allow them to dissolve hydrophobic compounds in the aqueous environment of the human body. However, self-assembling peptide solutions have poor blood compatibility (e.g., low osmolarity), hindering their clinical application through intravenous administrations. We have recently developed a generalized platform for hydrophobic drug delivery, which combines SAPs with amino acid solutions (SAP-AA) to enhance drug solubility and increase formulation osmolarity to reach the requirements for clinical uses. This formulation strategy was thoroughly tested in the context of three structurally different hydrophobic compounds &#8211; PP2, rottlerin, and curcumin &#8211; in order to demonstrate its versatility. Furthermore, we examined effects of changing formulation components by analyzing 6 different SAPs, 20 naturally existing amino acids at low and high concentrations, and two different co-solvents dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethanol. Our strategy proved to be effective in optimizing components for a given hydrophobic drug, and therapeutic function of the formulated inhibitor, PP2, was observed both in vitro and in vivo. This manuscript outlines our generalized formulation method using SAP-AA combinations for hydrophobic compounds, and analysis of solubility as a first step towards potential use of these formulations in more functional studies. We include representative solubility results for formulation of the hydrophobic compound, curcumin, and discuss how our methodology serves as a platform for future biological studies and disease models.

This protocol describes a clinically-applicable means of dissolving hydrophobic compounds in an aqueous environment using combinations of self-assembling peptide and amino acid solutions. Our method resolves a major limitation of hydrophobic therapeutics, which lack safe, efficient means of solubility and delivery methods into clinical settings.

自己組織化ペプチドとアミノ酸の組み合わせを用いる水溶液中の疎水性化合物の溶解度

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

医学

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

要約

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「プラグアンドプレイ」両親媒性ポリマー、有機染料及びアップコンバーティングナノ粒子を含む水分散性Nanoassembliesを作成する方法を

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

水/空気界面で疎水性有機分子をドープしたハイブリッド脂質膜の自己集合

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

自己組織化ペプチドとアミノ酸の組み合わせを用いる水溶液中の疎水性化合物の溶解度

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

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体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

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エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

水/空気界面で疎水性有機分子をドープしたハイブリッド脂質膜の自己集合

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

自己組織化ペプチドとアミノ酸の組み合わせを用いる水溶液中の疎水性化合物の溶解度

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成