最小限の細胞設計および薬剤送達のための上分子構造の効率的なアセンブリは挑戦的なままである。ここでは、両親媒性エラスチン様タンパク質に基づいて上分子構造を生み出す効率的なプロトコルを示す。提示されたアセンブリプロトコルは、ベシクル、繊維、およびコアセルベートなどの適応可能な物理化学的特性を持つ多目的な上分子構造を生成します。
タンパク質膜ベースのコンパートメントは、相分離挙動を示し、化学的に多様な蛍光性の積荷分子のカプセル化を可能にします。F20E20-mEGFPおよびF20E20-mCherryの発現については、一晩前培養から0.3のOD600にメイン発現培養を接種する。37°Cおよび200 rpmで適切な抗生物質を添加した滅菌LB培地の400ミリリットルでそれをインキュベートする。
発現培養液が0.5~0.8のOD600に達したら、1ミリモルの最終濃度にIPTGを加え、インキュベーション温度を摂氏20度に下げます。非天然アミノ酸を有する両親媒性ELPの発現については、適当なプラスミドを含む一晩の大腸菌前培養物から0.3のODに主発現培養液を接種する。カナマイシンとクロラムフェニコールを37°C、200rpmで補充した無菌LB培地400ミリリットルでインキュベートします。
100ミリモルの非天然アミノ酸ストックを準備するには、8ミリリットルの超純水に206.2ミリグラムの非天然アミノ酸を加えます。水酸化ナトリウム3モルで溶液のpHを上げ、激しく混ぜます。非天然アミノ酸が溶解したら、pHを約10.5に下げ、10ミリリットルの体積に超純水を加える。
無菌0.22マイクロメートルフィルターで溶液をフィルターし、それを2ミリリットル反応管でアリコートします。発現培養物が0.5~0.8のOD600に達したら、2ミリモルの最終濃度に非天然アミノ酸を加える。さらに10分間インキュベートします。
次に、標的タンパク質と必要なtRNA合成酵素の発現を、IPTGとアラビノースの同時添加を介して誘導する。インキュベーション温度を摂氏20度に下げ、約20時間も続けて表現を続けます。インキュベーション後、摂氏4度、4000グラムで40分間遠心分離して細胞を収穫する。
リソザイムおよびPMSFでリシスバッファー内の細胞ペレットを再懸濁します。氷の上で30分間溶液をインキュベートする。その後、液体窒素に沈めることで2回凍結解凍します。
懸濁液を超音波処理し、10,000グラムと摂氏4度で遠心分離により、40分間のライセートをクリアします。次いで、アフィニティークロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製する。タンパク質溶出後、さらに使用するまで摂氏4度で保存します。
ELP溶液500マイクロリットルに蛍光染料1マイクロリットルを加え、ThermoMixerで振りながら摂氏15度で約10時間インキュベートし、光から保護します。過剰な蛍光色素を除去するために、透析膜を超純水で10分間平衡化する。クリックしたELP溶液で反応管の開口部の上に置かれる正しいサイズに膜をカットします。
次に、コアのない蓋でチューブを閉じて開口に膜を固定します。空気のトラップを防ぐために、蓋と膜の間のスペースをバッファーで埋めます。次に、選択したバッファーに反応管を置き、それを表面の下に押し、逆さまにします。
4°Cで少なくとも3時間透析を行い、各バッファ交換後少なくとも3時間は透析を継続できます。THFの腫脹のために、安定したpH 7.5のリン酸塩またはTrisバッファーに対して同種ELP溶液を透析する。凍結乾燥機を準備し、凍結乾燥のために開始温度まで冷却します。
アリコートは、1.5ミリリットルの反応チューブ内の透析タンパク質溶液を、凍結乾燥の過程で圧力変化による固体サンプルを失うことを避けるために、小さな穴でキャップで密封する。液体窒素でサンプルをショックフリーズします。凍結したタンパク質サンプルを液体窒素から取り出し、すぐに凍結乾燥を開始するために凍結乾燥剤に入れます。
サンプルが完全に乾燥した後、乾燥窒素で換気し、空気の水分との接触を避けるためにすぐに反応管の蓋を閉じます。純粋なTHFを凍結乾燥したサンプルに加え、水浴ソニエーターに15分間氷水を入れます。熱サイクラーを小胞形成時に摂氏30~60度に予熱し、繊維形成のために摂氏90度まで予熱し、超純水または緩衝液で新しい反応管を準備します。
超音波処理の後、ELP /THF溶液と準備された水またはバッファーをサーモサイクラーに5分間置きます。次に、ELP溶液を水またはバッファーの上に層状にし、2つの相と異なる相間相の分離が可視であることを確認し、混合物をサーモサイクラーに戻します。試料を室温で10分間冷やし、水や緩衝液に対する透析、または蛍光顕微鏡で進めます。
1~50マイクロモルELP溶液を調製し、10~20%1-ブタノールを加えます。すぐに上下にピペットで溶液を混ぜます。溶液の濁度は、混合中に増加する必要があり、小胞形成を示す。
狭いサイズの分布を達成するために、1マイクロメートルの細孔サイズの膜を通してミニ押出機でベシクルを押し出す。色素カプセル化の場合、10ミリモルトリス-HClのELP溶液の約40マイクロリットルを、DMSOのデキストランテキサスレッドストック溶液の1マイクロリットルと混合します。10マイクロリットルの1-ブタノールを加え、0.25~25ミリメートルの針を装備した注射器を通して5~10回押し出します。
THFの膨潤法は3つの連続したステップから構成され、温度に応じてELPの異なる上分子集合体をもたらす。この蛍光顕微鏡画像はBDP-R20F20から組み立てられた小胞と、BDP-R40F20から組み立てられた細胞構造を示す。1-ブサノール押出方法は、ELP小胞の形成に専念する。
THFの膨潤法と比較して、約2桁の小胞が生成される。BDP-R40F20を10〜15%ブダノールと混合し、かつ小胞を混合物の押出を介して調製した。異なる上分子構造をTHF膨潤プロトコルを介してBDP-R40F20から組み立てた。
バッファーのpHおよび組立工程の温度は、コアセルベート、線維、または小胞のいずれかを形成するように調整した。アセンブリプロトコルの小さな間違いは、集合体の形成につながる可能性があります。正に帯電した色素ATTO Rho 13と多糖デキストランレッド3000を、1-ブタノール押出法を介してF20R20-mEGFPから組み立てられた小胞の内腔に封入した。
共焦点顕微鏡画像は、緑色のチャネルの小胞、赤いチャネルの貨物、および結果としてマージされたチャネルでの成功したカプセル化を示しています。組み立てられたPMBC集団との単一PMBCビルディングブロックの混合時のELP両親媒性体の相分離および融合挙動も実証された。PMBCアセンブリの前に混合すると、組み立てられたPMBC膜内に均質に分布する分子が生じ、組み立てられた小胞集団を混合すると、少なくとも20分間目に見える赤または緑色の蛍光の膜パッチが生じる。
この手順を試みる際には、正しいステップ順とTHF膨潤法とブタノール押出法との違いに注意することが重要です。このプロトコルに従って、ELP小胞は、薬物送達シャトルとして、インビトロ転写や翻訳などの酵素反応のためのプラットフォームとして、または合成最小細胞の形成に使用することができる。
