Name: water in oil emulsions: a new system for assembling water-soluble chlorophyll-binding proteins with hydrophobic pigments
Uploaded: 2016-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
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DN은 EU FP7 프로젝트의 PEPDIODE (GA 256672)과 REGPOT-2012-2013-1 (GA 316157), 그리고 이스라엘 과학 재단에서 개인 연구 보조금 (제 10분의 268)의 지원을 인정합니다. 우리는 공 초점 현미경 이미지를내어 교수 쉬 무엘 루빈스타인, 공학부 및 응용 과학, 하버드 대학, 캠브리지 MA, USA 감사합니다.

1. 엽록소에게 주식 솔루션을 준비 <ol><li> 중요한 단계는 : 광 손상을 최소화하기 위해, 녹색 광 (520 ㎚) 또는 어두운 하에서 화학적 후드 엽록소 제조의 모든 단계를 수행한다. 항상 저장을 위해 안료를 동결하기 전에 질소 나 아르곤을 추가합니다. 모든 용매 분석 학년 있는지 확인합니다. </li><li> 틸라코이드 막 만 엽록소 a를 포함하는 동결 건조 스피루리나 platensis 세포 또는 다른 cyanobacterium 세포의 약 5 mg의 무게 박격포와 유 봉을 사용하여 분쇄. </li><li> 유리 컬럼에 짓 눌린 세포를로드 및 카로티노이드를 제거하기 위해 약 50 ~ 100 ml의 100 % 아세톤으로 세척한다. 용출 된 오렌지 / 그린 부분을 폐기하십시오. 주 : 오렌지 분획을 아세톤 100 ㎖로 용출되지 않으면 녹색 분획이 용출되기 시작할 때까지 아세톤으로 세포를 세척 계속한다. </li><li> 과거 100 % 메탄올, 아세톤 및 엽록소 함유 녹색 분획을 수집한다. 용출 fract의 부피이온은 50 ~ 100 ml의 사이에 다를 수 있습니다. 초기에 용출 된 분획을 용출 끝에 옅은 녹색으로 변화되는 짙은 녹색을 갖는다. 용출 된 부분의 색이 옅은 녹색으로 바뀌면 용출를 중지합니다. </li><li> 추출물을 완전히 건조 될 때까지 회전 증발기를 사용하여 메탄올을 증발시켰다. 솔루션에 열을 가하지 마십시오; 증발기의 수조 온도가 30 ° C를 초과하지 않는 것을 보장한다. 참고 : 증발의 시간이 증발되는 메탄올 분획의 양에 따라 달라지며 10 ~ 60 분 사이에 다를 수 있습니다. 완전히 추출물을 건조하는 것이 중요하다. </li><li> 디 에틸 에테르 (약 5 ~ 10 ㎖)의 작은 볼륨에서 건조 추출물에서 색소를 용해하고, 탈지면을 통해 필터링합니다. 안료가 완전히 필터링 전에 에테르에 용해되어 있는지 확인합니다. </li><li> 안료가 (10-30 분)이 완전히 건조 될 때까지 디 에틸 에테르를 증발시켰다. 주 : 건조 안료는 치환 및 질소 또는 아르곤하에 유지 될 수 -20 ° C, 추가 처리 될 때까지 어둠한다. </li><li> 하지 모두가 완전히 정지되는 경우에도 100 %의 메탄올 (약 1 ㎖)의 가능한 가장 작은 양의 건조 안료를 녹인다. 이 용액에 아세톤 4 mL를 넣고 완전히 안료를 용해하기 위해 부드럽게 유리를 쓸어. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여, DEAE의 열이 100 % 아세톤에 평형 세 파로스에 부드럽게 샘플을로드합니다. </li><li> 100 % 아세톤으로 용출 카로티노이드 (오렌지색 - 노란 밴드). 1 v / V를 아세톤 / 메탄올 혼합물 : 다음, 3 엽록소 A (녹색 밴드) 용출. 주 : 아세톤, 아세톤 / 메탄올 혼합물의 부피가 컬럼에 로딩 DEAE 세 파로스의 용적과 거의 동등하다. </li><li> 용리액 (17)이 디클로로 메탄 / n- 헥산 / 이소프로판올 / 메탄올 (v / v)의 혼합물을 25 : 5 엽록소에게 68을 사용하여 박층 크로마토 그래피에 의해 순도를 확인한다. </li><li> 엽록소 a가 완전히 건조 될 때까지 (a 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시켜 1060 분). 주 : 건조 엽록소는 질소 또는 아르곤으로 퍼징하고, 어둠 속에서 -20 ℃에서 아르곤 대기 하에서 저장 될 수있다. </li><li> 100 % 에탄올 2-4 ml의 건조 엽록소 a를 다시 용해시켜 엽록소를 원액을 준비한다. 주 : 663 nm에서 엽록소 A의 흡광 계수는 74,400cm M -1 -1 (83.3 cm -1 (㎎ / ㎖) 1) 에탄올이다. 전형적인 스톡 용액을 25 mM의 (23 ㎎ / ㎖)의 농도에 대응하여 1860의 OD를 가져야한다. 엽록소의 10 배 몰 과량 대와 혼합 유기상을 5 ㎖ 및 수성 상 결과를 1ml WSCP 1 ㎎을 함유하는 에멀젼이 주식의 20 μL를 추가 WSCP. </li></ol> 2. 에멀젼의 유기 단계 준비 에멀젼의 유기상 (v / v)의 스팬 (80) 4.5 %를 함유하는 미네랄 오일로 구성되고, 0.4 % (v / v)의 트윈 80 참고. <ol><li> T의 50 ㎖ 튜브 0.2 g에 무게80 스판 80 1.8 g, 미네랄 오일 38 g을 싸우는. 물론 모든 구성 요소를 혼합하고 얼음에 냉각. 참고 유기상을 1 주일까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 에멀젼의 수성 상을 준비 주 : 에멀젼의 수성 상 정제 WSCP 또는 WSCP 과발현 균의 조 추출물 중 구성 될 수있다. <ol><li> 정제 WSCP을 함유하는 수성 상을 준비. <ol><li> 0.3-0.6의 OD까지 37 ℃ LB 배지 1 L로 WSCP 플라스미드 12을 함유하는 대장균 BL21 박테리아 성장. </li><li> 1 mM의 IPTG를 첨가하여 단​​백질 발현을 유도한다. 유도 후 12 ~ 16 시간 동안 30 ° C에서 박테리아를 성장. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 5,000 XG에 원심 분리하여 수확 박테리아. </li><li> 얼음에 버퍼와 초음파 처리를 결합에서 펠렛 (30​​ 초, 15 초 오프 5 회)을 녹인다. 250㎖를 원심 분리로 얻어진 펠렛을 완충액 10 ㎖를 사용하여단백질을 과발현하는 세포 LB 배지. 주 : 정제 방법에 따라 상기 결합 완충액은 100 mM의 포스페이트 완충액, pH가 7.2, 50 mM 트리스, pH가 7.5, 500 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA로 구성 될 수있다. </li><li> 39 ° C에서 30 분 동안 12,000 XG에서 세포 용 해물을 스핀. </li><li> 친화도 크로마토 그래피에 의해 WSCP을 정화. WSCP 융합 태그에 따라 제조사의 지시에 따라 단백질 정제에 적합한 시판되는 친 화성 크로마토 그래피 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 정제. </li><li> 에멀젼 제제를 들어, 50 밀리미터의 정제 WSCP 인산염 완충액, pH가 7.8을 사용합니다. 재구성에 사용되는 최종 단백질 양이 버퍼 1 ㎖ 당 0.5 ~ 1.0 mg을 확인하십시오. </li></ol></li><li> WSCP 원유 박테리아 용 해물을 함유하는 수성 상을 준비. <ol><li> OD 0.3-0.6 될 때까지 37 ℃ LB 배지 250 ㎖ 중의 플라스미드 발현 WSCP를 포함한 대장균 BL21 세포를 성장한다. </li><li> 과 단백질 발현을 유도1 mM의 IPTG는 30 ℃에서 밤새 박테리아를 성장. </li><li> 원심 분리하여 수확 박테리아 세포를 4 ℃에서 10 분 동안 5,000 XG에. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 1-2 ml를 50 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 7.8, 초음파 처리 (30 초, 15 초 오프, 3 회) 및 원심 분리기에서 펠렛을 녹인다. </li><li> 50 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 7.8 0.875 ml의 상등액 0.125 mL를 혼합하여 에멀젼의 수성 상을 준비한다. </li></ol></li></ol> 에멀젼의 엽록소 a를 가진 WSCP 4. 조립 <ol><li> 유리 바이알에 넣고 오일 - 계면 활성제 혼합물을 5 ㎖를 얼음에 냉각. 피펫 전에, 유기상의 모든 성분이 완전히 혼합되는 것을 확인한 후 계면 활성제 및 광유 사이에는 상 분리가 없다. </li><li> 유기 상을 5 ml의 섹션 3에서와 같이 제조 얼음처럼 차가운 수상의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 얼음에 9,500 rpm에서 2 분간 조직 균질를 사용하여 두 단계를 섞는다.</li><li> 중요한 단계 :에이 단계에서, 광 손상을 최소화하기 위해 녹색 빛 (520 ㎚)에서 모든 추가 단계를 수행합니다. 25 mM의 엽록소 주식 용액 20 μl를 추가 에멀젼에 (섹션 1.13 참조). 튕기 유리 바이알을 반전시킴으로써 분산. 엽록소가 균등하게 유화에 분산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 어둠 속에서 얼음에 1 ~ 2 시간 동안 에멀젼을 품어. </li><li> 실온에서 5 분 동안 14,000 × g으로 1.5 ㎖의 플라스틱 튜브에서 원심 분리에 에멀젼을 전송 유기상으로부터 분리 에멀젼 물방울을 분해하기 위하여. 주 : 조립이 완료되면, 하부 수 성상은 녹색을 가져야한다. </li><li> 상부 오 일상을 폐기하고 광유 1 ㎖를 추가한다. 소용돌이하거나 철저하게 튜브를 틀지하여 펠렛 에멀젼으로 잘 미네랄 오일을 섞는다. 실온에서 5 분 동안 14,000 XG에서 샘플을 스핀. 수성과 광부를 구분하는 명확한 메 니스 커스 때까지이 단계를 반복합니다중간 에멀젼없이 알 오일 상을 구한다. </li><li> 화학 후드에서이 단계를 수행합니다. 수성 미네랄 오일 상 명확하게 분리 된 후, 미네랄 오일을 제거하고 물, 포화 디 에틸 에테르를 가하여 1. 볼텍스하고, 실온에서 5 분 동안 14,000 XG에서 샘플을 스핀 다운. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 두 번째 원심 분리 한 후, 디 에틸 에테르를 제거하고 후드에서 5 ~ 20 분 동안 열린 튜브를 둡니다. </li><li> 마지막으로, 탈염 칼럼 상 WSCP / 엽록소에게 복합체를 함유하는 수성 상을로드하고 상기 실험에 적합한 완충액으로 용출시킨다. 주 : 단백질의 pH (6.0-7.5)의 넓은 범위에서 인산염 트리스 완충액에서 안정하다. 샘플은 1 개월까지 빛으로부터 보호 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

우리의 목표는 소수성 안료와 수용성 클로로필 결합 단백질의 조립을위한 새로운 일반 시스템을 개발 하였다. 여기가 W의 /의 O 에멀젼을 기반으로 새로운 재구성 시스템은 재조합 E. 표현 브뤼셀 콩나물, 콜리 플라워, 와사비와 버지니아 pepperweed에서 WSCP의 아포 단백질의 조립 작업을 입증 일반적인 방법입니다 것을 알 수있다 대장균. 다음 결과는 엽록소 (A)의 10 배 몰 과량 WSC...

이러한 엽록소 (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) 및 카로티노이드 등의 소수성 안료는 전자 수송 및 빛 에너지 캡처 및 전송을 수행 광합성 반응 센터와 빛 수확 단백질의 기본 보조 인자이다. 반응 센터와 엽록소 결합 광 수확 복합체의 대부분은 막 횡단 단백질이다. 비 산소를 광합성 녹색 유황 세균 1, 2의 Fenna - 매튜스 - 올슨 (FMO) 단백질 및 와편 모 조류 (3)의 peridinin - 엽록소 단백질 (PCP)는 수용성 빛 수확 단백질의 뛰어난 예이다. 수용성 엽록소 결합 단백질 (WSCPs) 십자화과, 타테, 명아주과 및 비름 식물 4, 5는 다른 독특한 예이며, 아직 FMO와 PCP 달리,이 광 수확에서나 차 광합성 반응의 어느 것도 관여 및 그들의 정확한 PHYsiological 기능은 아직 5-8 불분명하다. 높은 엽록소 결합 친 화성이 과도 Chls의 사업자와 엽록소 유도체 9,10와 같은 제안 기능에지도했다. 또한, 그것은 WSCP이 손상된 세포에 Chls을 청소하는 역할을하고 엽록소에 의한 광산화 손상 7,11-13 방지 것을 가정했다. 더 최근에는 프로테아제 억제제로서 그 WSCP 기능을 제시하고 초식 저항 동안 역할뿐만 꽃 발달 동안 14 세포 사멸을 조절 하였다. WSCPs는 광 물리 특성에 따라 두 가지 종류로 구분된다. 첫 번째 클래스 (클래스 I, 예. 명아주에서)는 조명에 광을 거칠 수있다. 광 5,10을받지 않는 브라 시카 공장에서 클래스 II WSCPs는 더 클래스 인천 공항으로 세분화된다 (예., 브라 시카 올레 라 케아, Raphanus sativus에서) 및 IIB (예., 다닥 냉이의 virginicum에서 </em&gt;). 다닥 냉이의 virginicum에서 클래스 IIB의 WSCP의 구조는 2.0 Å 해상도 8에서 X 선 결정학에 의해 해결되었다. 이것은 단백질 하위 단위는 소수성 코어를 형성하는 대칭 homotetramer을 보여준다. 각 서브 유닛은 모든 엽록소의 구성은 엽록소 - 단백질 복합체의 결합 및 조립을 공부 WSCPs에게 잠재적으로 유용한 모델 시스템을 만드는 간단한 core.This 내에서 네 밀접하게 포장 Chls의 꽉 배치 결과 하나의 엽록소 및 Chls 이웃의 효과를 결합 개별 Chls의 스펙트럼 및 전자 특성에 단백질 환경. 또한, 인공 광합성 소자에서 광 수확 모듈에 사용될 수있는 인공 엽록소 결합 성 단백질을 구성하는 템플릿을 제공 할 수있다. 식물로부터 정제 복합체는 항상 엽록소 (a)의 서로 다른 조합으로 사량의 이종 혼합물을 포함하기 때문에 기본 WSCPs의 엄격한 연구는 가능하지 않습니다와 엽록소 B (9). 따라서, 시험 관내 재조합 발현과 Chls WSCPs를 조립하는 방법이 요구된다. 이것은 (15)가 입증되었다 틸라코이드 막과 아포 단백질을 혼합하여. 불가능 단순히 수용액에 안료와 수용성 아포 단백질을 혼합하여 시험 관내 복잡한 조립하게 Chls의 무시할 수용성 의해 시험관 조립체 도전되지만 이 방법은 틸라코이드의 기본 Chls 존재로 제한됩니다. 슈미트는 등. 재조합 E.에 히스티딘 - 태그 단백질을 발현하여 콜리 플라워 (CaWSCP)에서 WSCP 여러 엽록소와 BChl 파생 상품을 조립보고 대장균은 니켈 친 화성 칼럼에 그것을 고정 및 세제 (11)에 용해 엽록소 유도체를 도입. 성공적으로 A.에서 재조합 WSCPs의 재구성 장대 6, 브뤼셀 콩나물 (BoWSCP), 일본어 야생 무 (RshWSCP)를비슷한 방법으로 D 버지니아 pepperweed (LvWSCP)도보고되었다. 여기, 우리는 소설 단백질을 태그가 필요하지 않습니다 WSCP와 Chls 조립 또는 고정 일반, 간단한 방법을 제시한다. 이 광유 수용성 아포 단백질들의 수용액에서 에멀젼의 제조에 의존한다. 단백질 따라서 부피 비율 16 유 중수 (W / O) 매우 높은 표면 미세 방울에 캡슐화됩니다. 소수성 공동 인자는 오일에 용해하고 용이 유상로부터 액적 내로 도입된다. 우리는 재조합 E. 표현 WSCP의 아포 단백질의 여러 변형의 조립 방법을 이용하여보고 엽록소 A의 대장균. 우리는 엽록소 신규 한 결합 단백질을 개발하기위한 스크리닝 시스템으로 사용될 수있다 WSCP 과발현 세균 조질 용 해물에서 어셈블리를 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.</td></tr><tr><td>His Trap HF column</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td><td>Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag</td></tr><tr><td>DEAE Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>Chromatography medium for chlorophyll purification</td></tr></tbody></table>

water in oil emulsions: a new system for assembling water-soluble chlorophyll-binding proteins with hydrophobic pigments

엽록소 (Chls) 및 bacteriochlorophylls (BChls)는 광합성 빛 수확 및 전자 수송을 수행하는 기본 보조 인자이다. 이들의 기능은 매우 크고 정교한 multisubunit 막 횡단 단백질 복합체 내에서 특정 조직에 따라 달라집니다. 이러한 복합체는 태양 에너지 변환을 용이하게하는 방법을 분자 수준에서 이해하기 위하여, 단백질 - 안료, 안료와 안료의 상호 작용 및 동력학 여기에 그 효과를 이해하는 것이 필수적이다. 이러한 이해를 얻는 방법 중 하나는 건설 및 단순 수용성 재조합 단백질과 Chls의 단지를 공부하는 것입니다. 그러나, 수용성 단백질에 친 유성 및 Chls BChls를 통합하는 것은 어렵다. 또한, 소수성의 안료와 수용성 단백질의 조립에 사용될 수있는 일반적인 방법이 없다. 여기서는 엉덩이 있도록 유 중수 에멀젼에 기초한 간단한 고 스루풋 시스템을 보여소수성 Chls와 수용성 단백질의 embly. 새로운 방법은 엽록소 A의 십자화과 식물 (WSCP)의 수용성 엽록소 결합 단백질의 재조합 버전을 조립하여 검증 하였다. 우리는 엽록소의 성공적인 조립에게 E.을 표현 WSCP의 사용 조 해물을 보여 신규 수용성 ​​엽록소 결합 단백질 유전자 스크린 시스템을 개발하는데 사용되며, 엽록소 - 단백질 결합 및 조립 공정을 연구 할 수있다 대장균 세포.

재조합 WSCP의 아포 단백질은 이전 섹션에 설명 된 프로토콜에 따라 W / O 에멀젼의 엽록소 a를 조립했다. 프로토콜은 순수한 WSCPs 또는 대장균 세포 용 해물 WSCP 과발현 (도 1)를 함유하는 수성 상을 이용하여 구현 하였다. 이 프로토콜은 빠르고, 간단하고 조직 균질 제외하고는 특별한 장비를 필요로하지 않습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together....

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Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

이 논문은 유 중수 에멀젼에 기초 소수성 안료와 수용성 단백질을 조립하기위한 간단하고 높은 처리량 방법을 설명한다. 우리는 브라 E. 식물에서 발현 재조합 수용성 엽록소 4 변형 결합 단백질 (WSCPs) 네이티브 엽록소의 조립에있어서의 효과를 입증 대장균.

오일 유제에서 물 : 소수성 안료와 수용성 엽록소 결합 단백질을 조립하기위한 새로운 시스템

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

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14.6K 조회수.  Weizmann Institute of Science.  이 논문은 유 중수 에멀젼에 기초 소수성 안료와 수용성 단백질을 조립하기위한 간단하고 높은 처리량 방법을 설명한다. 우리는 브라 E. 식물에서 발현 재조합 수용성 엽록소 4 변형 결합 단백질 (WSCPs) 네이티브 엽록소의 조립에있어서의 효과를 입증 대장균. 

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A 'Plug and Play' Method to Create Water-dispersible Nanoassemblies Containing an Amphiphilic Polymer, Organic Dyes and Upconverting Nanoparticles

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate amphiphilic polymers in situ, and describe a protocol to encapsulate the prepared UCNPs and different organic dye molecules (porphyrins and diarylethenes) using polymer shells to form stable water-dispersible nanoassemblies. The nanoassembly samples containing both the UCNPs and the diarylethene organic dyes have interesting photochemical and photophysical properties. Upon 365 nm UV irradiation, the diarylethene group undergoes a visual color change. When the samples are irradiated with visible light of another specific wavelength, the color fades and the samples return to the initial colorless state. The samples also emit visible light from the UCNPs upon irradiation with 980 nm near-infrared light. The emission intensity of the samples can be tuned through alternate irradiation with UV and visible light. Modulation of fluorescence can be performed for many cycles without observable degradation of the samples. This versatile encapsulation procedure allows for the transfer of hydrophobic molecules and nanoparticles from an organic solvent to an aqueous medium. The polymer helps to maintain a lipid-like microenvironment for the organic molecules to aid in preservation of their photochemical behavior in water. Thus this method is ideal to prepare water-dispersible photoresponsive systems. The use of near-infrared light to activate upconverting nanoparticles allows for lower energy light to be used to activate photoreactions instead of more harmful ultraviolet light.

Organic dye molecules and oleic acid coated upconverting nanoparticles are not water-soluble. This protocol describes a &#8216;plug and play&#8217; method that enables the transfer of organic dye molecules and upconverting particles from their initial hydrophobic solvent to water.

&#39;플러그 앤 플레이&#39;방법은 양친 매성 고분자, 유기 염료 및 업 컨버팅 나노 입자를 포함하는 수분 산성 Nanoassemblies 만들기

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate ...

연구

화학

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

분리 및 통합 규조류 Cyclotella Meneghiniana Thylakoid 지질으로 리에서에서 광 수확 안테나

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

생화학

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

생체공학

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

물/공기 인터페이스에서 소수성 유기 분자와 함께 도핑 하이브리드 지질 막의 자체 조립

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic properties allow them to dissolve hydrophobic compounds in the aqueous environment of the human body. However, self-assembling peptide solutions have poor blood compatibility (e.g., low osmolarity), hindering their clinical application through intravenous administrations. We have recently developed a generalized platform for hydrophobic drug delivery, which combines SAPs with amino acid solutions (SAP-AA) to enhance drug solubility and increase formulation osmolarity to reach the requirements for clinical uses. This formulation strategy was thoroughly tested in the context of three structurally different hydrophobic compounds &#8211; PP2, rottlerin, and curcumin &#8211; in order to demonstrate its versatility. Furthermore, we examined effects of changing formulation components by analyzing 6 different SAPs, 20 naturally existing amino acids at low and high concentrations, and two different co-solvents dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethanol. Our strategy proved to be effective in optimizing components for a given hydrophobic drug, and therapeutic function of the formulated inhibitor, PP2, was observed both in vitro and in vivo. This manuscript outlines our generalized formulation method using SAP-AA combinations for hydrophobic compounds, and analysis of solubility as a first step towards potential use of these formulations in more functional studies. We include representative solubility results for formulation of the hydrophobic compound, curcumin, and discuss how our methodology serves as a platform for future biological studies and disease models.

This protocol describes a clinically-applicable means of dissolving hydrophobic compounds in an aqueous environment using combinations of self-assembling peptide and amino acid solutions. Our method resolves a major limitation of hydrophobic therapeutics, which lack safe, efficient means of solubility and delivery methods into clinical settings.

자기 조립 펩타이드와 아미노산의 조합을 사용 하 여 수 용액에서 소수 성 화합물의 용 해도

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

의학

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

오일 유제에서 물 : 소수성 안료와 수용성 엽록소 결합 단백질을 조립하기위한 새로운 시스템

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'플러그 앤 플레이'방법은 양친 매성 고분자, 유기 염료 및 업 컨버팅 나노 입자를 포함하는 수분 산성 Nanoassemblies 만들기