This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

注意：（ すなわち 、メタノールのためのMSDS）は、使用する前に、すべての材料および試薬のための材料安全データシート（MSDS）をご参照ください。溶剤および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を溶離液を取り扱うときは、すべての適切な安全対策を使用することを確認してください。 HPLC、分析天びんと検出器計測器の技術的管理の適切な使用を確保し、個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）を使用することを保証します。 注：このプロトコルは、目的の化学化合物の性質に固有の異なる試薬と反応流ポストカラム誘導体化の3つの方法（RF-PCD）技術、それぞれについて説明します。 ROSの解析については、「DPPH•を使用してROSの1検出」に進み、第一級アミンの分析については、「カミンを使用して、第一級アミンの2検出」、およびフェノール化合物の分析のために」セクションに移動を参照してください3 。フェノール類の検出4-aminoantipyreneとフェリシアン化カリウム」を使用して。全体に超純水（ 例えば 、ミリQ水）を使用します。 注：RF列の接続が主な違いは、RF列の端金具の数であると従来のHPLCカラムとほぼ同じ方法で達成されます。 HPLCシステムに標準的なHPLCカラムを接続するために使用される継手は、HPLCシステムへRF列を接続するために使用されることが可能です。 DPPHを用いたROSの1検出• <ol><li> HPLC機器の設定 <ol><li>移動相としてのラインB上のラインA上の水100％と100％のメタノールでHPLC機器を準備します。メーカーの要件に従ってポンプをパージします。 </li><li> 図4（a）に示すように 、HPLC楽器の部品や追加の誘導体化ポンプを設定します。 </li><li> 520ナノメートルの波長で分析するために、UV-Visの検出器を設定します。 </li></ol></li><li> の設定RFコラム<ol><li> HPLC機器へのRFカラムの入口を接続します。 </li><li> RF列の中央のポートをコンセントに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを接続します。 </li><li> 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して、UV-Visの検出器に流出ペリフェラルポートに接続します。 </li><li> RFのカラムの出口上のペリフェラルポートにDPPH•ポンプラインを接続します。 </li><li>列のストッパーを用いたRFカラムの出口に未使用のペリフェラルポートをブロックします。 </li><li> 100％メタノール- 1分ml -1の100％の線BにまでHPLCポンプの流量をもたらします。 </li><li>内径4.6mm×100mmの長列の10分間、100％メタノールを移動相でカラムを平衡化します。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングされるべきです。 </li></ol></li><li> DPPH•試薬の調製 <ol><li>メタノールにDPPH•の0.1mg / mlの溶液を調製します。 </l私&gt; <li> 10分間DPPH•試薬を含有するフラスコを超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止するために箔でフラスコをカバーしています。 </li><li>メーカーの要件に従って準備されたDPPH•試薬とDPPH•ポンプをパージします。 </li></ol></li><li> RFのカラム出口のチューニング <ol><li>正確に2清潔で乾燥した船の重量を量ります。周辺機器など、中央およびその他のような1つの容器にラベルを付けます。 </li><li> 1.0分間、中央ラベル付き容器に中央ポートから出る廃液を収集します。 </li><li>中央ポート容器を再計量し、次のように中央のポートからの流れの重量を計算します。 中央港の重量（g）=中央ポート船（グラム）の最終重量 - 中央ポート容器の初期重量（g） </li><li>繰り返しは、UV-VisのRFカラムの周辺ポートに接続し、ペリフェラルポート容器としての重みを計算されて出た廃液用の1.4.2と1.4.3ステップ次のとおりです。 ペリフェラルポートの重量（g）=ペリフェラルポート容器（G）の最終重量 - ペリフェラルポート容器の初期重量（g） </li><li>次のように中央と周辺機器ポートからの流れの割合を計算します。 中央ポートの％中央ポート=重量（g）/（中央ポー​​トの重量（g）+ペリフェラルポート（G）の重量）×100 ペリフェラルポート％のペリフェラルポート=重量（g）/（中央ポー​​トの重量（g）+ペリフェラルポート（G）の重量）×100 </li><li>中央流と周辺の流れの間のセグメンテーション比が30:70（：末梢中央）であることを確認してください。中央流が30％以上である場合には、中央のポートの出口0.13ミリメートルIDチューブの長さを追加することによって、出る流量を減少させます。中央流が30％未満である場合には、中央ポートから0.13ミリメートルのチューブの長さを減少させます。 </li><li> 1.4.6への手順を繰り返し1.4.1 30:70（中央：周辺）のセグメンテーション比がまで達成されています。 </li><li> Dの流量を設定します0.5ミリリットル分-1へのPPH•試薬ポンプ。 注：DPPH•試薬で設定RF列は現在、分析の準備ができています。サンプルは、現在注入されてもよいです。 </li></ol></li><li> ポスト実行停止条件 <ol><li>すべてのサンプルは、実行が終了したことを示す、注入された後、誘導体化試薬ポンプ流れを止めます。 </li><li>ペリフェラルポートからDPPH•試薬ポンプ行を削除し、ポートをストッパー。 </li><li>それは、移動相は1分ml -1の10分間でカラムを通過させることによって格納すべき移動相でカラムを平衡化します。 </li><li> HPLC機器上で、移動相ポンプの流れを停止します。 </li><li>メタノールでDPPH•試薬を交換して、追加のポンプをパージします。 注：HPLCシステムは現在、シャットダウンすることができます。 </li></ol></li></ol> Fluorescを使用した第一級アミンの2検出アミン<ol><li> 移動相の調製 <ol><li>ボリュームへの希釈前に5 M水酸化アンモニウムで9.0に溶液のpHを調整し、10mMの酢酸アンモニウム溶液の1リットルを調製します。 </li><li> 95:05（：ACN緩衝液）の予混合移動相を達成するために酢酸アンモニウム緩衝液にアセトニトリル52.6ミリリットル（ACN）を加えます。 </li></ol></li><li> HPLC機器の設定 <ol><li>移動相としてA線にプレミックス準備緩衝液を用いてHPLC機器を準備します。メーカーの要件に従ってポンプをパージします。 </li><li> 図4（a）に示すように 、HPLC楽器の部品や追加の誘導体化ポンプを設定します。 </li><li>誘導体化ポンプにパルスダンパーコイルを取り付けます。 </li><li>セットアップ蛍光検出器（FLD）を475 nmで390 nmおよび発光波長の励起波長を有します。 </li></ol></li><li> RF列の設定 <ol><li>目を接続しますHPLC装置にRF列のE入口。 </li><li> RF列の中央のポートをコンセントに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを接続します。 </li><li> 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して、FLD検出器へのRFカラムの出口周辺ポートを接続します。 </li><li> RFのカラムの出口上のペリフェラルポートに誘導体化ポンプラインを接続します。 </li><li>列のストッパーを用いたRFカラムの出口に未使用のペリフェラルポートをブロックします。 </li><li> 5％ACNと予備混合の10mM酢酸アンモニウム緩衝液pH 9、 - 1分ml -1の100％の線AににHPLCポンプの流量をもたらします。 </li><li>内径4.6mm×100mmの長列の10分間100％ラインA、移動相でカラムを平衡化します。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングすることができます。 </li></ol></li><li> カミン試薬の調製 <ol><li> 0.1ミリグラムミリリットル-1カミン試薬の100ミリリットルを加えます。 </li> &lt;1分間のLI&gt;超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止するためにホイルで覆います。 </li><li>メーカーの要件に従って準備されたフルオ試薬と試薬ポンプをパージします。 </li></ol></li><li> RFのカラム出口のチューニング <ol><li>正確に2清潔で乾燥した船の重量を量ります。周辺機器など、中央およびその他のような1つの容器にラベルを付けます。 </li><li> 1.0分間、中央ラベル付き容器に中央ポートから出る廃液を収集します。 </li><li>中央の容器を再計量し、ステップ1.4.3で以下のように中央のポートからの流れの重量を計算します。 </li><li>繰り返しは、RF列のペリフェラルポートに取り付けられ、ステップ1.4.4で以下のように周辺の重みを計算されたFLDを出る流出物のために2.5.3に2.5.2を繰り返します。 </li><li>ステップ1.4.5で以下のように、中央と周辺機器ポートからの流れの割合を計算します。 </li><li>中央流と周辺の間のセグメント化率を確認流れは43:57（：末梢中央）です。中央流が43％以上である場合には、中央のポートの出口0.13ミリメートルIDチューブの長さを追加することによって、出る流量を減少させます。中央流が43％未満である場合には、中央のポートから0.13ミリメートルのチューブの長さを減少させます。 </li><li> 2.5.6への手順を繰り返し2.5.1 43:57（中央：周辺）のセグメンテーション比がまで達成されています。 </li><li> 0.7 mlの分、移動相ポンプの流量を設定-1。 </li><li> 0.1ミリリットル分で流れるように誘導体化ポンプを設定-1。 注：フルオレサミン試薬で設定RF列は現在、分析の準備ができています。サンプルは、現在注入されてもよいです。 </li></ol></li><li> ポスト実行停止条件 <ol><li>すべてのサンプルは、実行が終了したことを示す、注入された後、誘導体化ポンプを停止します。 </li><li>ペリフェラルポートとストッパから誘導体化ポンプ行を削除します。 </li><li>移動相中でカラムを平衡化しますそれは、移動相は1分ml -1の10分間でカラムを通過させることによって格納されます。 </li><li>移動相ポンプの流れを停止します。 </li><li>アセトニトリルでフルオレサミン試薬を交換し、誘導体化ポンプをパージします。 注：HPLCシステムは現在、シャットダウンすることができます。 </li></ol></li></ol> 4-Aminoantipyreneとフェリシアン化カリウムを用いたフェノール類の3検出<ol><li> 移動相の調製 <ol><li>ボリュームへの希釈前に5 M水酸化アンモニウムで9.0に溶液のpHを調整し、100 mMの酢酸アンモニウム溶液の1リットルを調製します。 </li><li> （：メタノールバッファー）5：95の予混合移動相を達成するために酢酸アンモニウム緩衝液にメタノール52.6ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li> HPLC機器の設定 <ol><li>移動相としてA線にプレミックス準備緩衝液を用いてHPLC機器を準備します。メーカーごとのように、ポンプをパージ」; sの要件。 </li><li> HPLC楽器のコンポーネントと、図4（b）に示すように、2つのさらなる試薬ポンプを設定します。 </li><li>試薬ポンプのそれぞれにパルスダンパーコイルを取り付けます。 </li><li> 500nmの波長で分析するために、UV-Visの検出器を設定します。 </li></ol></li><li> RF列の設定 <ol><li> HPLC機器へのRFカラムの入口を接続します。 </li><li> RF列の中央のポートをコンセントに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを接続します。 </li><li> 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して、UV-Visの検出器へのRFカラムの出口周辺ポートを接続します。 </li><li>各試薬（ すなわち 、4-aminoantipyreneとフェリシアン化カリウム）のRFカラムの出口上のペリフェラルポートへのポンプラインを接続します。 </li><li> 1 mlの分をHPLCポンプの流量をもたらす-1 100％の線Aに-の5％メタノールで予め混合100mMの酢酸アンモニウム緩衝液pH 9、。 </li><li>列Wの平衡内径4.6mm×100mmの長カラムの10分間の100％A線移動相i番目。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングすることができます。 </li></ol></li><li> 4 aminoantipyrene試薬の調製 <ol><li>ステップ3.1.1に従うことによって、9のpHを有する酢酸アンモニウム緩衝液を準備します。 </li><li> 150mgの4- aminoantipyreneを秤量し、準備された酢酸アンモニウム緩衝液（pH 9）100mlに溶解します。 </li><li> 1分間超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止するためにホイルで覆います。 </li><li>メーカーの要件に従って準備された4-aminoantipyrene試薬と第1試薬ポンプをパージします。 </li></ol></li><li> フェリシアン化カリウム試薬の調製 <ol><li>フェリシアン化カリウム150mgのを秤量し、ステップ3.1.1に従って調製酢酸アンモニウム緩衝液（pH 9）100mlに溶解します。 </li><li> 1分間超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止することがホイルでカバーしています。 </li><li> PURGメーカーの要件に従って準備されたフェリシアン化カリウム試薬とE第2試薬ポンプ。 </li></ol></li><li> RF列のチューニング <ol><li>正確に2清潔で乾燥した船の重量を量ります。周辺機器など、中央およびその他のような1つの容器にラベルを付けます。 </li><li> 1.0分間、中央ラベル付き容器に中央ポートから出る廃液を収集します。 </li><li>中央の容器を再計量し、ステップ1.4.3で以下のように中央のポートからの流れの重量を計算します。 </li><li>繰り返しは、RF列のペリフェラルポートに取り付けられ、ステップ1.4.4で以下のように周辺の重みを計算されたUV-Visのを出る流出物のために3.6.3に3.6.2を繰り返します。 </li><li>ステップ1.4.5で以下のように、中央と周辺機器ポートからの流れの割合を計算します。 </li><li>中央流と周辺の流れの間のセグメンテーション比が50:50（：末梢中央）であることを確認してください。中央流が50％以上である場合には、減少アウトレット中央のポートに0.13ミリメートルのIDチューブの長さを追加することで、出て行く流れの量。中央流が50％未満である場合には、中央のポートから0.13ミリメートルのチューブの長さを減少させます。 </li><li> 3.6.6への手順を繰り返し3.6.1 50:50（中央：周辺）のセグメンテーション比がまで達成されています。 </li><li> 0.5ミリリットル分に4-aminoantipyreneポンプの流量を設定して-1。 </li><li> 0.25ミリリットル分にフェリシアン化カリウムポンプの流量を設定して-1。 注：二成分試薬を用いて設定したRF列は現在、分析の準備ができています。サンプルは、現在注入されてもよいです。 </li></ol></li><li> ポスト実行停止条件 <ol><li>一旦、全てのサンプルが実行が終了したことを示す、実行が終了した注入された、試薬ポンプの両方を停止します。 </li><li>周辺機器ポートから試薬ポンプ行を削除し、0.13ミリメートルチューブの15cmのピースに置き換えます。 </li><li> WHIで移動相でカラムを平衡化しますCHは移動相を1ml分でカラムに通過さ-1 10分間可能にすることによって格納されます。 </li><li> HPLC機器上で、移動相ポンプの流れを停止します。 </li><li>メタノールで試薬ポンプ上の試薬の両方を交換して、製造業者の要件ごとのような追加のポンプをパージします。 注：HPLCシステムは現在、シャットダウンすることができます。 </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCDは、バンドの広がりの影響を最小化し、分離性能を向上させる、反応コイルを使用することなくHPLC廃液ポストカラムで誘導体化試薬の効率的な混合を可能にします。 RF-PCD法はまた、検出方法に対する信号応答の改善を示しています。 Camenzuli ら 28は、エスプレッソコーヒー、試料中のROSの検出のためのDPPH•との反応流列の使用を初めて報告しました。彼らの研究...

ポストカラム誘導体化（PCD）と結合された高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、分析研究室で多くの問題を解決するのに有用である強力なツールです。これは、利用可能な検出器1,2のスイートとさもなければ検出不能である化合物を検出し、選択的検出および定量3-5の下限を許可または標的分析物のシグナルを増加させることができることを避けるために、標的分析物を誘導体化マトリックス効果6。一般的に使用されるPCD反応は、9,10またはフルオレサミン11,12ニンヒドリン、2,2-ジフェニルと反応性酸素種（ROS）の誘導体をオルト-フタルアルデヒド7-9を有するアミノ酸などのアミンとの反応を含みます1- picrylhydrazilラジカル（DPPH•）13,14、または2,2&#39;-アジノ-ビス（3-ethylbenzothiazoline -6-スルホン酸（ABTS）15,16、および硫黄cを誘導体化するためにヨウ化アジド試薬の使用ontaining化合物17,18。 HPLCシステム6を有するPCD反応の使用には多くの欠点は、しかし、存在します。主にこれらの間混合し、8を発生するための反応時間を可能にする誘導体化試薬（単数または複数）の添加の時点と検出器との間の反応コイルの使用です。これらの反応は、多くの場合、HPLCシステム19の残りの部分の容積に比べて有意である500μlあるいはそれ以上の容積を有するループ。これらの大量の反応の使用は、反応ループの存在なしで観察されるものと比較して増加したピークの広がりをもたらすループ。これは、定量および検出の高い限界が短く、幅の広いピークになると負のクロマトグラフィー分解能をもたらす。1および図 2は 、様々なポストカラム反応ループのボリュームの追加に起因するピーク形状の悪化を強調表示します。この分析94％メタノールおよび6％のMilli-Q水の移動相組成を用いて行きました。移動相の流速は1ml /分であり、注入量は20μlであったと分析波長は265 nmでした。千μlに20μlのからデッドボリュームを変化させるコイルはPCD法における反応ループデッドボリュームの影響をシミュレートするために、カラムと検出器との間に挿入しました。これらのループは、0.5 mmの内径のステンレス鋼管から調製しました。実験は、コントローラ（SCL-10AVP）からなるHPLCシステム上で実施した、低圧グラジエントバルブ（FCL-10ALVP）、ポンプ（LC-20AD）、インジェクター（SIL-10ADVP）、およびPDA検出器（ SPD-M10ADVP）。移動相は、従来のHPLCシステムに導入する脱気装置を通してポンプ輸送しました。分離250ミリメートル×内径4.6 mm 5ミクロンカラムを用いて行きました。実験条件は、最近、文献に発表されているPCD反応の典型であるように選択しました。 ザ最も簡単なのは、最も一般的なポストカラム反応器の設定は、効果的に液体を流すことができ、反応が起こることができ、それを通して細長いチューブである非セグメント管状反応器と呼ばれます。このシステムピークに広がりがないだけで、システムに追加デッドボリュームだけでなく、飯島ら 8によって強調されているように、管の内径に依存しています。また、コイル形状が観察されたブランドの広がりで役割を果たしています。スチュワート20は、反応器の巻取りがデッドボリュームを最小化することができることを意味し、より良好な混合が得られ、二次流れのプロファイルを変更することを述べました。 21コイルニット開管を使用するときにピークの広がりが重要ではないことを述べました。ピークの広がりが大きすぎる場合は、反応器の他のタイプも20,22と考えることができます。これらは床反応器またはセグメント流反応器を含むことができます。これらの反応器は、そうでなければrequirだろう遅い反応のために特に有用です電子大きな反応がループします。非セグメント化された管状反応器は、PCDのアプリケーションで使用される原子炉の中で最も一般的なタイプであるため、この記事の残りの部分は、反応器のセットアップのこのタイプを扱います。 反応流（RF）列の設計は、移動相が外側に位置し、半径方向の中央列の領域または3のポートに配置された単一のポートのいずれかを介してカラムを出る（または入力）することを可能にするマルチポートエンドフィッティングを組み込んカラムの壁領域（ 図3参照 ）。これらの二つの流れを順番にカラム壁に張り出し、外側多孔質フリットに囲まれている不透過性のリングに囲まれている中央の多孔質フリットを含むエンドフィッティングを用いて分離されています。中央不透過性リングクロスフローに2多孔性領域の間では不可能です。 反応流クロマトグラフィーの間に、誘導体化試薬（複数可）は一つ又はTWに移動相の流れ方向に対してポンピングされます反応流列の外側ポートのO。カラム溶出液は、外側のフリットで誘導体化試薬（複数可）と混合し、無料の外側ポートを介して検出器に渡されます。反応流は、単一の試薬誘導体（誘導体化試薬のための1ポート、1ポートは、検出器とブロックされた1ポートに、カラム溶離液を通過させるように）またはデュアル試薬系誘導体化試薬とを1ポート（2ポートのいずれかのために使用することができます）検出器にカラム溶離液を通過させます。中央ストリームからの流れは、いずれかの誘導体化されていないカラム溶離液、効果的に多重化検出23、または無駄に渡さを検出するために使用することができます。 RF-PCDクロマトグラフィーを実行するときに利用可能である一つの主要なチューニング技術は、中央と周辺の流れの比率です。各誘導体化のための最適な比率は、中央フローが検出されたり無駄に渡されるかどうかなど、多くの要因に依存します。したがって、最適な比率が決定された後正確な流量比は、各ランが実行される前に達成されることが保証されるべきです。 フリットの使用が一般的にゼロデッドボリュームのTピースまたは低デッドボリュームを採用し、従来の混合技術と比較して、より効率的な混合でRF-PCD結果の列溶離液流と誘導体化試薬を混合することが見出されていますW-作品は、2つのストリームを混合します。これは、比較的小さな反応ループの使用、または全く反応ループのさえ排除を可能にしました。伝統的なポストカラム誘導体化法に比べてシャープなピークで反応ループサイズの結果の減少。これは、全てのカラム溶離液のが誘導体化されるという事実にもかかわらず、対雑音比より高いシグナルが観察され、したがって検出及び定量化の下限を達成することができる、ということを意味します。 反応流クロマトグラフィーは、PCD反応の適応の困難を克服するために開発されました現代のHPLCカラムやシステムへの、による大容量の反応ループを採用する必要性に起因する大規模なポストカラムデッドボリュームに広げるバンドに起因する効率の特に損失。従来のPCDと比較して、RF-PCDで、より効率的な混合プロセスは、より小さな反応ループ量が観測された分離効率の上昇につながる使用されてもよいことを意味します。さらに、RF-PCDクロマトグラフィーは両方の増加したシグナルを示し、従来のPCD法に比べて検出および定量の下限をもたらす従来のPCDの技術に比べ、ノイズを減少させました。従来のPCD法に比べてRF-PCDのさらなる利点は、RF列の中央のポートだけでなく、列の周辺領域から溶出する誘導体化されたストリームから溶出する非誘導体化ストリームを監視する機能です。 RF-PCDは、従来のPCDの方法に比べて多くの利点が表示され、比較的新しいが、有望な技術です。

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump(s) for derivatization system</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td><td>Non-commercial</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td></td><td></td><td>Provided with column</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td></td><td></td><td>4-point analytical balance</td></tr><tr><td>Stop watch</td><td></td><td></td><td>Non-Scientific equiptment</td></tr><tr><td>Eluent collection vials</td><td></td><td></td><td>Any Small vial with a flat bottom will do, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, HPLC vials</td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td></td><td></td><td>Will depend on instrument used</td></tr><tr><td>Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory glassware</td><td></td><td></td><td>Volumetric Flasks, pippettes, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; Quantity and volumes will depend on sample preparation method.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipyrene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide&amp;nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

RF-PCDによる使用のために適合された第一のPCD法は、2,2-ジフェニル-1- picrylhydrazilラジカル（DPPH•）24を用いて、酸化防止剤の誘導体でした。この反応は、25。コーレバらによって導入された、広く以来使用されています。検出は、活性酸素種の存在下でDPPHラジカル•の脱色、観察された吸光度の低下で抗酸化物質の結果のそれ故に存在に?...

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

post-column-derivatization-using-reaction-flow-high-performance

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K ビュー.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

ビデオ: Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

パラレル・セグメントフローカラムをチューニングし、多重化された検出のイネーブル化

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

化学

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

カーテンフローカラム：効率の最適化と感度

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

生化学

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the cell&#39;s survival requirements. Alternatively, carrying out DBTL cycles in cell-free environments can accelerate this process and alleviate concerns with host compatibility. A promising approach to cell-free metabolic engineering (CFME) leverages metabolically active crude cell extracts as platforms for biomanufacturing and for rapidly discovering and prototyping modified proteins and pathways. Realizing these capabilities and optimizing CFME performance requires methods to characterize the metabolome of lysate-based cell-free platforms. That is, analytical tools are necessary for monitoring improvements in targeted metabolite conversions and in elucidating alterations to metabolite flux when manipulating lysate metabolism. Here, metabolite analyses using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with either optical or mass spectrometric detection were applied to characterize metabolite production and flux in E. coli S30 lysates. Specifically, this report describes the preparation of samples from CFME lysates for HPLC analyses using refractive index detection (RID) to quantify the generation of central metabolic intermediates and by-products in the conversion of low-cost substrates (i.e., glucose) to various high-value products. The analysis of metabolite conversion in CFME reactions fed with 13C-labeled glucose through reversed-phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (MS/MS), a powerful tool for characterizing specific metabolite yields and lysate metabolic flux from starting materials, is also presented. Altogether, applying these analytical methods to CFME lysate metabolism enables the advancement of these systems as alternative platforms for executing faster or novel metabolic engineering tasks.

The protocols describe high-performance liquid chromatography methods coupled to refractive index or mass spectrometric detection for studying metabolic reactions in complex lysate-based cell-free systems.

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

生物工学

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

JoVE Science Education

分析化学

Purification of a Total Lipid Extract with Column Chromatography

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
The product of an organic solvent extraction, a total lipid extract (TLE), is often a complex mixture of hundreds, if not thousands, of different compounds. The researcher is often only interested in a handful of compounds. The compounds of interest may belong to one of several classes of compounds, such as alkanes, ketones, alcohols, or acids (Figure 1), and it may be useful to remove the compound classes to which it does not belong in order to get a clearer view of the compounds you are interested in. For example, a TLE may contain 1,000 compounds, but the Uk&#39;37 sea surface temperature proxy is based on only two compounds (alkenones) and the TEX86 sea surface temperature proxy is based on only four (glycerol dialkyl glycerol tetraethers). It would behoove the researcher to remove as many of the compounds they are not interested in. This makes the instrumental analysis of the compounds of interest (alkenones or GDGTs) less likely to be complicated by other extraneous compounds.
In other cases, an upstream purification technique may have produced compounds you wish to now remove from the sample, such as the production of carboxylic acids during saponification in our previous video. In both of the above cases the purification technique called column chromatography is very useful.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/10159/10159fig1.jpg" /> 
Figure 1. Geochemically important functional groups. From Killops and Killops1.

カラム ・ クロマトグラフィで総脂質抽出物の精製

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
The product of an organic solvent extraction, a total lipid extract (TLE), ...

環境科学

地球科学

Column Chromatography

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This technique utilizes a stationary phase, which is packed in a column, and a mobile phase that passes through the column. This technique exploits the differences in polarity between compounds, allowing the molecules to be facilely separated.1 The two most common stationary phases for column chromatography are silica gel (SiO2) and alumina (Al2O3), with the most commonly used mobile phases being organic solvents.2 The solvent(s) chosen for the mobile phase are dependent on the polarity of the molecules being purified. Typically more polar compounds require more polar solvents in order to facilitate the passage of the molecules through the stationary phase. Once the purification process has been completed&#160;the solvent can be removed from the collected fractions using a rotary evaporator to yield the isolated material.

Column Chromatography: Principle, Separation of Compounds from a Mixture

カラム ・ クロマトグラフィ

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This ...

有機化学

Principles Of Column Chromatography

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. Further, in 1941, Archer John Porter Martin and R. L. M. Synge modified the technique by packing silica gel into a column. A mixture of amino acids was then separated on the packed column using chloroform and water mixture as the mobile phase. This was the first report on column chromatography. At present, column chromatography is a widely used technique for separating various types of compounds from a sample mixture.
Factors Influencing Efficient Separation of Proteins 
Various parameters like column material, packing, and operational conditions such as flow rates and temperature determine the efficiency of separation by column chromatography.
The choice of column material or matrix determines the extent of interaction with the sample. The matrix material must be tightly and uniformly packed in the column. Air bubbles, debris, large particles, and precipitates interfere with the uniform flow of the solvent through the column, affecting its separation efficiency. The column should also be free from particulate matter.
The sample injected into the column should be clear and free from aggregates that might clog the column, hindering solvent flow. The flow rate of solvent also affects the separation. Very high or very low flow rates of solvents result in inefficient separation of compounds and impure preparations. Very high rates may also disturb the column packing, affecting process efficiency. In addition, the composition of elution buffer is also an important factor. It should be non-corrosive and compatible with the sample and also the column material to prevent in situ precipitation or dissolution.
Another operational parameter, temperature, also plays an important role in the process. It decides the stability of the sample, column material, and solvent buffer. Also, a constant temperature throughout the column efficiently resolves compounds. After completing the separation process, the columns must be washed thoroughly by repeatedly passing a suitable solvent to avoid sample contamination in further runs. Occasionally, the solvent is passed in a column in the reverse direction to remove any clogged material.
Limitations
Though a very widely used technique, the method still has some limitations. It is a very time-consuming method as the flow rates need to be slower for better resolution of the compounds. Also, large quantities of highly pure solvents required in the mobile phase make the process expensive. This also raises the scaling-up cost when higher yields of pure compounds are needed.

カラムクロマトグラフィーの原理

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. ...

細胞生物学

ユニット １

細胞とタンパク質の分析

KEY TERMS AND CONCEPTS

High-Performance Liquid Chromatography: Introduction

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, identify, and quantify components in complex mixtures. The term &#34;high pressure&#34; refers to using high pressure to push the liquid mobile phase through the tightly packed columns.
In HPLC, two phases play a critical role in the separation process:
<ol>
	<li>Mobile Phase: This is a liquid solvent that flows through the system, carrying the sample with it. The solvent is chosen based on its polarity to optimize the interaction with the analytes and the stationary phase. The &#34;polarity index&#34; serves as a guide to selecting the suitable solvent for separation.</li>
	<li>Stationary Phase: The stationary phase is a solid material, often silica-based, packed within the column. In reverse-phase HPLC, the stationary phase is typically derivatized silica, such as octadecyl (C18) silica. The small particle size of the packed material creates a high surface area, enhancing interactions with the analytes. To reduce undesirable interactions, such as those with unreacted silanol groups, the stationary phase is often end-capped with reagents like trimethylchlorosilane</li>
</ol>
Separation occurs as the analytes interact differently with both the mobile and stationary phases, depending on their chemical properties, which leads to differential migration through the column.
Sometimes, solute molecules bind irreversibly to the stationary phase, clogging the analytical column and decreasing its performance. To prevent this, a guard column is placed before the analytical column. A precolumn called a scavenger column may also be placed between the mobile phase reservoir and the injector. This ensures that the solvent enters the analytical column, which is already saturated with silica from the scavenger column, preventing unwanted reactions and extending the lifetime of the analytical column.
After the separation, analytes are detected by various detectors, depending on the characteristics of the compounds. The results are visualized as chromatograms, with peaks corresponding to the different components of the mixture. This provides both qualitative and quantitative data about the sample.

高速液体クロマトグラフィー:はじめに

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, ...

反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

要約

さらに動画を探す

パラレル・セグメントフローカラムをチューニングし、多重化された検出のイネーブル化

カーテンフローカラム：効率の最適化と感度

フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

カラム・クロマトグラフィで総脂質抽出物の精製

カラム・クロマトグラフィ

カラムクロマトグラフィーの原理

高速液体クロマトグラフィー:はじめに

高速液体クロマトグラフィー:はじめに

反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

要約

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パラレル・セグメントフローカラムをチューニングし、多重化された検出のイネーブル化

カーテンフローカラム：効率の最適化と感度

フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

カラム ・ クロマトグラフィで総脂質抽出物の精製

カラム ・ クロマトグラフィ

カラムクロマトグラフィーの原理

高速液体クロマトグラフィー:はじめに

高速液体クロマトグラフィー:はじめに

カラム・クロマトグラフィで総脂質抽出物の精製

カラム・クロマトグラフィ