フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造。この手順の目的は、LC-MSプロテオミクス分析のための高速かつ容易な超高性能キャピラリーカラムパッキングのための最適化されたプロトコルを導入することです。現代のプロテオミクスは、超高性能キャピラリー液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析に基づいています。
ペプチド分離は、主に75マイクロメートルの内径の毛細血管カラムで行われます。市販品と同等に、キャピラリーカラムを社内で用意することが可能です。カスタムで用意されたカラムは、商業的な類推に似た分離品質を示す一方で、多くのお金を節約し、吸着剤やカラムサイズのカスタマイズを可能にします。
ここでは、FlashPack と呼ぶ社内キャピラリーカラム製造用の最適化されたパッキング手順を示します。最適化の背後にある考え方は、同じ共通の100棒圧力爆弾のパッキング設定を使用しながら、非常に高い吸着スラリー濃度から梱包することです。これは、高い吸着濃度でカラムの入り口の周りに形成され、新しい吸着材料が毛細血管に入るのを防ぐ吸着クラスターを連続的に分解する必要があります。
技術的には、磁石バーをハンマーとして使用し、常に吸着線の中の毛細血管の周りを常に加熱し、移動することによってそれを達成します。適切に適用された FlashPack は、最大 10 回の梱包率を増加させます。これは、より柔らかいマイクロメトリックビートサイズの超高性能吸着剤を梱包し、合理的な時間でメートルの長さまでの非常に長い列を製造するのに適しています。
列の準備手順は、5 つのステップで構成されます。3つの準備ステップは、パッキングステーションアセンブリとキャピラリーと吸着スラリー製剤を含みます。その後、キャピラリーは、最初に60〜100バー圧力で圧力爆弾に詰め込まれます。
その後、パックされたキャピラリーをHPLCシステムに接続し、高圧で吸着剤を詰め、カラムの切断を大きさにします。FlashPack プロシージャーでは、共通プロトコルのステップ 3 と 4 で変更を行う必要があります。まずは梱包ステーションを用意します。
それは少なくとも50棒出口圧力が付いている窒素のガスタンクから成っている。タンクは、磁気攪拌機に置かれる圧力爆弾のベントバルブに接続されています。ベント弁の出口は狭いID PEEK毛細管を通して水のびんに挿入され、減圧の細かい制御が可能になる。
次に毛細血管を用意します。パッキングは、カシルとフォルマミドから形成された統合ガラスフリットを備えたフリットキャピラリーのいずれかに行うことができます。別のオプションは、サッターレーザープーラーで調製された引っ張られた毛細血管にパックすることです。
毛細管は、意図した列の長さよりも10〜15センチメートル長くする必要があります。次のビデオは、引っ張られたエミッタキャピラリーパッキングの例で準備されています。カットされたゲルローディングピペットチップで引っ張られたエミッタの端を保護します。
詳しくは原稿のテキスト版をご覧ください。次の段階は、吸着スラリー製剤です。まず、約50ミリグラムの乾燥吸着剤を1.5ミリリットル遠心管に入れます。
それはストック吸着バイアルになります。このビデオは、Dr.MaischのReprosil Pur C18 AQ 1.9マイクロメトリック吸着剤を使用して作成されました。ストックの吸着剤バイアルに1ミリリットルのメタノールを加えます。
10秒間渦を起分させます。そして、さらに10秒間超音波処理浴で超音波処理。ソルベントを20〜30分間徹底的に浸し、その後、渦を再び超音波処理します。
働く吸着剤バイアルを準備します。それは爆弾に収まる円錐形の底のバイアルでなければなりません。それは特定の圧力爆弾の設計に応じて別の1.5ミリリットル遠心管または他のバイアルのいずれかである場合があります。
我々は、圧力爆弾の高さにカットスカート円錐ボトムスクリューキャップチューブを使用しています。ストック吸着バイアルの吸着剤を再び中断し、500マイクロリットルをマグネットバー2 x 3ミリメートルの大きさで作業用の吸着剤バイアルに移します。メタノールで1ミリリットルに働くバイアルに上に。
作業バイアルは、吸着剤が重力によって解決するために10分間テーブルの上に立たせます。このステップの結果は、高さ4ミリメートルの周りの緩い吸着剤の底層を持つ円錐底バイアルでなければなりません。層が低すぎる場合、およびストックバイアルからいくつかのより多くの吸着剤。
したがって、準備された作業バイアルは、数ヶ月の時間にわたって複数の列の準備のために意図されています。作業吸着バイアルが2時間以上かき混ぜることなく滞在する場合は、充填する前に渦巻き、超音波処理し、重力によって再び落ち着かなければなりません。すべてが準備されたら、ステージ4に進み、圧力爆弾に詰めます。
融合したシリカ毛細血管と圧力爆弾を使用する場合は、常に保護メガネを着用してください。同時に、保護手袋はお勧めできません。小径毛細血管の適切な取り扱いに必要な触覚を著しく低下させ、ミスを招く。
圧力爆弾に吸着バイアルを置き、すべての結び目をしっかりと固定します。毎分60〜100ラウンドで回転を開始し、フリットまたは引っ張られたエミッタキャピラリーを爆弾に挿入します。バイアルの一番下に押し込み、2〜3ミリメートルまで持ち上げて結び目を固定します。
毛細血管を固定するために必要な最小限の力を適用します。毛細血管が正しく固定されていることを確認します。毛細血管を手で引っ張り出して動かすことは不可能でしょう。
非常にゆっくりと、あなたの顔から離れて指し、毛細血管の開いた端を保ちながら、圧力爆弾バルブを開きます。梱包プロセスの初期手順をご覧ください。加圧の際、吸着剤は毛細管を満たし、全長に対して透明化しなくなります。
吸着剤が遠位端の内側に詰め込み始めるとすぐに、背圧が増加し、流れが減速し、毛細管内の吸着スラリーでさえ、吸着剤の自由なギャップで区切られたいくつかの吸着パケットに変わります。既にパックされた吸着剤は、密集した着色連続成長領域として見える。充填された部分は、充填プロセス全体の間、小さな吸着剤の空き隙を持つキャピラリー長さの少なくとも70%に保ちます。
梱包プロセス中に注意すべきいくつかの一般的な問題があります。それらは毛細管への有効な吸着物の配達を保つために機内のセットアップの調節を要求する。最も頻繁な問題は、すでに内部の吸着剤が動き続けている間に新しい吸着剤が毛細血管に入るのを止めるときである。
ほとんどの場合、毛細血管の入り口は自己凝集する吸着クラスタによってブロックされます。これらのステップを、吸着フローが復元されるまで 1 つずつ適用してから、問題に関連する残りのステップをスキップします。回転速度を毎分500ラウンドに上げ、すぐに60RPMに戻します。
ほとんどの場合、吸着剤の流れを復元します。残りの梱包プロセスでは、回転速度が 60 RPM 以上であることを確認します。それが役に立たない場合は、簡単に梱包爆弾を発散し、すぐにそれを加圧します。
それが役に立たない場合、またはブロッキングが再び起こる場合は、吸着剤層の内側に毛細血管を再配置します。吸着剤の不在は、キャピラリーのオープンエンドがマグネットバーの上に高すぎるか、したがって、柱の端がそれに触れない可能性があります。または毛細血管が低すぎる位置にあり、バイアル底部にくっつきます。
まず、爆弾を完全に通気し、ナットを緩め、毛細管を底に押し付け、2ミリメートル戻します。ナットを固定します。バルブを開けて爆弾を加圧し、梱包を続けます。
パッキングの問題の詳細については、メソッドのテキストバージョンで説明します。目標列の長さと 5 ~ 7 センチが達成されるまで、列を梱包し続けます。回転を停止し、非常にゆっくりと爆弾を減圧します。
爆弾弁を少し開けて、水筒の中でバブルが破裂するのを待ちます。その後、バルブを少し広く開き、再びバブルが減速するのを待ちます。したがって、段階的なステップでは、バルブからガスが出なくなるまで圧力を放出します。
バルブを一度に開けないでください。それは毛細血管の中でバブリングし、吸着剤がバイアルに戻ります。その場合は、爆弾を加圧し、列が再びパックされるのを待ちます。
ガスがベントバルブから出てくるのを止めたら、詰まった毛細管を圧力爆弾から取り出します。カラムを乾かさないで下してください。HPLCシステムに直ちに接続されていない場合は、パックしたキャピラリーを10%エタノール溶液に完全に浸して保存します。
切断されたHPLCカラムも同様に保存されます。今日の梱包がこれ以上計画されていない場合は、爆弾から吸着バイアルを取り出し、しっかりと閉じます。さらに列の梱包のためにそれを保ちます。
ステージ5、HPLCパッキング。パックされたキャピラリーをHPLC接続でHPLCシステムに接続します。高有機溶剤の流れを開始します。
約300本をターゲットにしたパック長さに応じて流量を調整します。40センチメートルパック毛細血管のために毎分200〜300の通常のリットルの流量を使用してください。キャピラリーの中の緩い吸着物が詰め込まれているのを見て、詰まった長さの合計に加えます。
流れを止めずに、カラム本体を超音波浴に2回浸します。列本体の一部のみを浸漬することが重要です。柱の端部と毛細管接続を浸さない。
吸着剤のベッドが収縮を停止したら、流れを止めずにカラム本体を超音波浴に2倍以上浸します。300 バーで 10 分の追加の列を実行します。流れを止め、圧力が3本のバーを下回るのを待ち、列を切り離します。
ギャップや変色が欠けているかどうかを視覚的に検査します。もし見つかったら、流れの下で超音波処理を繰り返すことができます。重要な実験の場合は、新しい列を作成することを検討してください。
列を目的の長さに切り取ります。適切に行われた切断は、カラム効率の前提条件です。ポリアミドコーティングのノッチを筆記者で作ります。
毛細管を部分的に割り、2個離して引き離します。セラミックウエハーまたはラッピングフィルムで列のフロントエンドを磨きます。超高圧接続を使用して、列をLCシステムに再接続します。
作業流量を 2%B で開始し、作業流量は列パラメータに従って調整します。たとえば、100 マイクロメートルの ID カラムは、毎分 500 ナノリットルで実行されます。
圧力が平衡化するのを待ち、列の背圧を確認します。適切に準備されたカラムは、長さと吸着特性に比例したバックプレッシャーを与えます。例えば、2マイクロメートルの吸着剤を詰めた30センチメートルのキャピラリーカラムは、2%の溶媒Bで450〜500バーの背圧を有する。
バックプレッシャーが期待範囲外である場合、列またはLCシステムのいずれかで何か問題があります。FlashPackを使用したパッキングは、100バーの充填圧力で1時間未満で1.9マイクロメートルの吸着剤を備えた50センチメートルに詰め込まれたキャピラリーを生成します。一例として、1.9マイクロメートルReprosilPur C18 AQ吸着剤を用いた引き出されたエミッタキャピラリーに詰め込まれた30センチメートル100マイクロメートルID超高圧カラムを製造しています。
パッキングは、長いエミッタ毛細管を50センチメートルに60バーで行われました。毛細血管は40分で40センチメートルに詰め込まれ、キャピラリーの中にもう少し吸着剤が詰め込まれていませんでした。パックされたキャピラリーはHPLCシステムに接続され、溶媒Bで毎分300ナノリットルで動作し、私たちの場合は80%アセトニトリル、0.1%のギ酸でした。
最終的なパック長さは43センチメートルでした。柱は30センチカットされた。99%の溶媒Bを用いた毎分500ナノリットルの作業流量で、カラムは予想値に近い275本のバーのバックプレッシャーを与えた。
カラムをテストするために、2〜50%Bから15分間の勾配でシトクロムCタンパク質のトリプティック消化器の50 fmolを分離した。平均FWHMは約3秒でした。
記載されたプロトコルは、合理的な時間で設定された共通の100バーパッキングでUHPLCカラムを生成することができます。短いHPLCまたはUPLCカラムは数分でパックすることができ、長い30〜50センチメートルのカラムは1時間未満でパックされます。この方法は、RP と任意の列 ID に他の化学を使用して吸着剤を梱包するために効率的です。
生産されたカラムは、同じようなサイズおよび吸着変数の他の商業コラムと同じくらい効果的である。
