Name: post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Achtung: Bitte beachten Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) für alle Materialien und Reagenzien vor der Verwendung (dh MSDS für Methanol). Achten Sie darauf, den Einsatz aller geeigneten Praktiken Sicherheit bei Lösungsmitteln und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Eluent Handhabung. Stellen Sie sicher, angemessene Nutzung von Engineering-Kontrollen von HPLC, Analysenwaage und Detektor Instrumentierung, und sorgen für die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe). Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt 3 Methoden der Reaktionsströmungs Nachsäulenderivatisierung (RF-PCD) -Techniken, die jeweils mit einem anderen Reagenz, spezifisch für die Art einer chemischen Verbindung von Interesse. Gehen Sie für die Analyse von ROS Abschnitt &quot;1. Detektion von ROS mit DPPH •&quot; für die Analyse von primären Aminen Abschnitt &quot;2. Nachweis von primären Aminen unter Verwendung von Fluorescamin&quot; und für die Analyse von phenolischen Verbindungen gehen in Abschnitt &quot;3 sehen . Nachweis von PhenolenVerwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid &quot;. Verwenden von ultrareinem Wasser (zB Milli-Q - Wasser) im gesamten Gebäude . Hinweis: Der Anschluss der RF-Säule wird in fast der gleichen Weise wie eine herkömmliche HPLC-Säule mit dem wichtigen Unterschied, die Anzahl der Endarmaturen auf einer RF-Säule erreicht. verwendeten Armaturen eine Standard-HPLC-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden, können verwendet werden, um eine RF-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden. 1. Nachweis von ROS Mit DPPH • <ol><li> Einrichten von HPLC - Instrument <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit 100% Wasser auf der Linie A und 100% Methanol auf Linie B als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpen gemäß Herstelleranforderungen. </li><li> Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt. </li><li> Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 520 nm zu analysieren. </li></ol></li><li> Einrichten vonRF-Säule <ol><li> Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument. </li><li> Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass. </li><li> Schließen Sie einen Ausgang Peripherieschnittstelle an die UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden. </li><li> Schließen Sie die DPPH • Pumpenleitung an einen Peripherie - Anschluss am Ausgang des HF - Säule. </li><li> Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird. </li><li> Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie B - 100% Methanol. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit 100% Methanol mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit sollte entsprechend den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann. </li></ol></li><li> Herstellung von DPPH • Reagenz <ol><li> Bereiten Sie eine 0,1 mg / ml Lösung von DPPH • in Methanol. </li&gt; <li> Beschallen den Kolben , der die DPPH • Reagenz für 10 min enthält. </li><li> Decken Sie den Kolben in Folie Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Spülen Sie die DPPH • Pumpe mit dem vorbereiteten DPPH • Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen. </li></ol></li><li> Einstellen des HF - Kolonnenauslaß <ol><li> Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher. </li><li> Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert. </li><li> Wieder wiegen den Zentralbehälter Port und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie folgt: Gewicht des Zentralanschluss (g) = Endgewicht Zentral Hafen Schiffs (g) - Anfangsgewicht von Zentral Hafen Schiffs (g) </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2 und 1.4.3 für das Abwasser Austritt aus dem UV-Vis, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für die Peripherieschnittbehälter angebracht ist, wiefolgt: Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) = Endgewicht Peripherieschnittbehälter (g) - Anfangsgewicht von Peripherieschnittbehälter (g) </li><li> Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie folgt: % Zentral Port = Gewicht der Zentralanschluss (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100 % Peripherieschnitt = Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100 </li><li> Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 30:70 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb von 30% liegt, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömungs unter 30% ist, die Länge von 0,13 mm Schlauch von dem zentralen Port verringern. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.4.1 bis 1.4.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 30:70 (Zentral: periphere) erreicht wird. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des DPPH • Reagenzienpumpe auf 0,5 ml min -1. Hinweis: Die HF - Säule mit DPPH • Reagenz einrichten nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden. </li></ol></li><li> Beitrag laufen Abschaltbedingungen <ol><li> Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Strömungspumpe Derivatisierungsreagenzes. </li><li> Entfernen Sie die DPPH • Reagenz Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper auf den Hafen. </li><li> Durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min -1 für 10 min Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase , in der sie , indem die mobile Phase gespeichert werden soll. </li><li> Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument. </li><li> Ersetzen Sie das DPPH • Reagenz mit Methanol und spülen Sie das zusätzliche Pumpe. Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann. </li></ol></li></ol> 2. Nachweis von primären Aminen FluorescAmin <ol><li> Vorbereitung der mobilen Phase <ol><li> Vorbereitung 1 l einer 10 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird. </li><li> In 52,6 ml Acetonitril (ACN) mit dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95:05 (Puffer: ACN) zu erreichen. </li></ol></li><li> Einrichten von HPLC - Instrument <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe gemäß Herstelleranforderungen. </li><li> Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt. </li><li> Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an die Derivatisierung Pumpe. </li><li> Set-up der Fluoreszenzdetektor (FLD) mit einer Anregungswellenlänge von 390 nm und Emissionswellenlänge von 475 nm. </li></ol></li><li> Einrichten von HF - Säule <ol><li> Schließen Sie the Einlass der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument. </li><li> Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass. </li><li> Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem FLD Detektor eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden. </li><li> Verbinden der Derivatisierung Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF-Säule. </li><li> Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird. </li><li> Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie A - 10 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% ACN. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann. </li></ol></li><li> Herstellung von Fluorescamin Reagenzes <ol><li> Stellen Sie 100 ml einer 0,1 mg ml -1 Fluorescamin Reagenz. </li> &lt;li&gt; Ultraschallbad für 1 min. </li><li> Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Spülen Sie die Reagenzienpumpe mit dem vorbereiteten Fluorescamin Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen. </li></ol></li><li> Einstellen des HF - Kolonnenauslaß <ol><li> Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher. </li><li> Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert. </li><li> Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.5.2 für das Abwasser zu 2.5.3 die FLD austretende, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für periphere angebracht ist, wie in Schritt 1.4.4 folgt. </li><li> Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt. </li><li> Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripherenFlow ist 43:57 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb 43% ist, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömung unter 43% ist, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.5.1 bis 2.5.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 43:57 (Zentral: periphere) erreicht wird. </li><li> Stellen Sie die Durchflussrate der mobilen Phase Pumpe auf 0,7 ml min -1. </li><li> Stellen Sie die Derivatisierung Pumpe bei 0,1 ml min -1 fließen. Hinweis: Die HF-Säule mit Fluorescamin Reagenz eingerichtet für die Analyse ist nun fertig. Proben können nun eingespritzt werden. </li></ol></li><li> Beitrag laufen Abschaltbedingungen <ol><li> Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Derivatisierung Pumpe. </li><li> Entfernen Sie die Derivatisierung Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper. </li><li> Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase indie es gespeichert werden soll , indem die mobile Phase durch die Säule passieren bei 1 ml min -1 für 10 min. </li><li> Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe. </li><li> Ersetzen Sie das Fluorescamin Reagenz mit Acetonitril und spülen Sie das Derivatisierung Pumpe. Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann. </li></ol></li></ol> 3. Nachweis von Phenolen Unter Verwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid <ol><li> Vorbereitung der mobilen Phase <ol><li> Vorbereitung 1 l eines 100 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird. </li><li> Hinzufügen 52,6 ml Methanol zu dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95 zu erreichen: 5 (Puffer: Methanol). </li></ol></li><li> Einrichten von HPLC - Instrument <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe nach Hersteller; S Anforderungen. </li><li> Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die beiden zusätzlichen Reagenzienpumpen , wie in 4B dargestellt. </li><li> Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an jedem der Reagenzienpumpen. </li><li> Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 500 nm zu analysieren. </li></ol></li><li> Einrichten von HF - Säule <ol><li> Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument. </li><li> Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass. </li><li> Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden. </li><li> Verbinden jedes Reagenz (dh 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid) Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF - Säule. </li><li> Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie A - 100 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% Methanol. </li><li> Äquilibrieren der Säule wit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 Minuten für eine 4,6 mm ID x 100 mm Länge Spalte. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann. </li></ol></li><li> Herstellung von 4-Aminoantipyren Reagenzes <ol><li> Vorbereiten eines Ammoniumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 9 durch Schritt 3.1.1 folgende. </li><li> Wiegen 150 mg 4-Aminoantipyren und lösen sich in 100 ml der vorbereiteten Ammoniumacetat-Puffer (pH 9). </li><li> Beschallen für 1 min. </li><li> Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Spülen Sie die erste Reagenz Pumpe mit der hergestellten 4-Aminoantipyren Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen. </li></ol></li><li> Herstellung von Kaliumferricyanid Reagenzes <ol><li> Wiegen 150 mg Kaliumferricyanid und lösen sich in 100 ml Ammoniumacetatpuffer (pH 9), hergestellt gemäß Schritt 3.1.1. </li><li> Beschallen für 1 min. </li><li> Decken Sie in Folie Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Purge das zweite Reagenz Pumpe mit dem vorbereiteten Kaliumferricyanid Reagenz nach den Anforderungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Tuning von HF - Säule <ol><li> Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher. </li><li> Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert. </li><li> Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.6.2 für das Abwasser zu 3.6.3 die UV-Vis-Austritt aus, die an die Peripherieschnitt der HF-Säule angebracht ist, und berechnen Gewicht für periphere wie in Schritt 1.4.4 folgt. </li><li> Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt. </li><li> Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 50:50 (Zentral: periphere). Wenn der zentrale Strömungs über 50% liegt, verringert sich dieStrömungsmenge durch Addieren einer Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass zentrale Öffnung austritt. Wenn der zentrale Strömung unter 50% liegt, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis 3.6.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 50:50 (Zentral: periphere) erreicht wird. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des 4-Aminoantipyren Pumpe auf 0,5 ml min -1. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des Kaliumferricyanid Pumpe auf 0,25 ml min -1. Hinweis: Die HF-Spalte mit den Zweikomponenten-Reagenzien aufgebaut nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden. </li></ol></li><li> Beitrag laufen Abschaltbedingungen <ol><li> Sobald alle Proben der Lauf beendet injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, beide der Reagenz Pumpen stoppen. </li><li> Entfernen Sie die Reagenzienpumpleitungen von den peripheren Ports und ersetzen Sie sie mit einem 15 cm Stück 0,13-mm-Schlauch. </li><li> Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase in WHIch ist es , indem die mobile Phase gespeichert werden , durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min -1 für 10 min. </li><li> Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument. </li><li> Ersetzen Sie beide die Reagenzien auf dem Reagenz Pumpen mit Methanol und spülen die zusätzlichen Pumpen gemäß Hersteller Anforderung. Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann. </li></ol></li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD ermöglicht die effiziente Durchmischung des Derivatisierungsreagens mit dem HPLC Abstrom säulennachgeordneten ohne die Verwendung von Reaktionsspulen, die Effekte der Bandverbreiterung zu minimieren und die Trennleistung verbessert. RF-PCD Methoden wurden auch Verbesserungen in der Signalantwort in Bezug auf Nachweisverfahren gezeigt. Camenzuli et al. 28 war die erste die Verwendung von Reaktionsströmungsspalten mit DPPH • zum Nachweis von ROS in einer Espressokaffeeprobe zu me...

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), gekoppelt mit Nachsäulenderivatisierung (PCD) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das bei der Lösung einer Reihe von Fragen im analytischen Labor nützlich ist. Es kann verwendet werden , um Verbindungen zu detektieren , die ansonsten nicht nachweisbar mit der Suite von 1,2 verfügbaren Detektoren sind, um das Signal des Zielanalyten erhöhen, was niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs 3-5 oder selektiv ermöglicht Derivatisierung eines Zielanalyten , um zu vermeiden , Matrixeffekte 6. Üblicherweise verwendete PCD Reaktionen schließen die Reaktion von Aminen, wie Aminosäuren, mit ortho-phthaladehyde 7-9, Ninhydrin 9,10 oder Fluorescamin 11,12, die Derivatisierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit dem 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) • 13,14 oder 2,2&#39;-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) 15,16, und die Verwendung des Jodids-Azid - Reagenz Schwefel c zu derivatisierenontaining Verbindungen 17,18. Es gibt jedoch zahlreiche Nachteile bei der Verwendung von PCD Reaktionen mit HPLC - Systemen 6. Hauptsächlich unter diesen ist die Verwendung von Reaktionsspulen zwischen dem Punkt der Zugabe des Derivatisierungsreagenz (n) und dem Detektor, die Zeit für das Mischen und die Reaktion erlauben , 8 auftreten. Diese Reaktionsschleifen haben oft Volumina von 500 &amp; mgr; l oder mehr, was signifikant ist im Vergleich zu dem Volumen der Rest des HPLC - Systems 19. Die Verwendung dieser hohen Volumenreaktionsschleifen führt zu einer erhöhten Spitzenverbreiterung Vergleich zu dem, was ohne die Anwesenheit der Reaktionsschleife beobachtet werden würde. Dies führt zu kürzeren, breiteren Spitzen, die eine höhere Grenzen der Quantifizierung und Detektion haben und negativ bewirkt chromatographische Auflösung. 1 und 2 unterstreichen die Verschlechterung der Peakform , die aus der Zugabe von verschiedenen Nachsäulenderivatisierung Schleife Volumina zur Folge haben . Diese Analysewurde mit einer Zusammensetzung der mobilen Phase von 94% Methanol und 6% Milli-Q-Wasser durchgeführt. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1 ml / min, war das Injektionsvolumen 20 &amp; mgr; l und die Analyse Wellenlänge betrug 265 nm. Spulen unterschiedlicher Totvolumina von 20 &amp; mgr; l bis 1000 &amp; mgr; l wurden zwischen der Säule und dem Detektor eingesetzt, um die Auswirkungen der Reaktionsschleife Totvolumen in PCD Verfahren zu simulieren. Diese Schleifen wurden aus Edelstahlrohr von 0,5 mm Innendurchmesser hergestellt. Das Experiment wurde an einem HPLC-System durchgeführt, bestehend aus einer Steuereinheit (SCL-10AVP), eine Niederdruck-Gradient Ventil (FCL-10ALVP), eine Pumpe (LC-20AD), einem Injektor (SIL-10ADVP) und einem PDA-Detektor ( SPD-M10ADVP). Die mobile Phase war durch einen Entgaser vor der Einführung in das HPLC-System gepumpt. Die Trennung wurde unter Verwendung einer 250 mm x 4,6 mm ID-Säule 5 um durchgeführt. Versuchsbedingungen wurden gewählt, um die typisch für PCD Reaktionen, die vor kurzem in der Literatur veröffentlicht wurden. Daseinfachste, am häufigsten Nachsäulenreaktor Aufbau ist eine nicht-segmentierten Rohrreaktor bezeichnet, die die Flüssigkeit fließt, durch die effektiv eine lange, dünne Röhre ist und die Reaktion stattfinden kann. In diesem System Spitze ist Verbreiterung abhängig nicht nur das Totvolumen zu dem System hinzugefügt, sondern auch der Innendurchmesser des Rohres , wie durch Iijima hervorgehoben et al. 8. Darüber hinaus spielt Spulengeometrie eine Rolle bei der Marke Verbreiterung beobachtet. Stewart 20 festgestellt , dass die sekundären Strömungsprofile des Reaktors Aufwickeln ändert, in eine bessere Durchmischung ergibt, was bedeutet , dass das Totvolumen minimiert werden kann. Es wurde festgestellt , dass die Peakverbreiterung nicht signifikant ist , wenn eine offene röhrenförmige Spule 21 gestrickt werden. Wenn die Peakverbreiterung zu große, andere Arten von Reaktoren ist auch 20,22 angesehen werden kann. Diese können Bettreaktoren oder segmentierte Strömungsreaktoren umfassen. Diese Reaktoren sind besonders nützlich für langsame Reaktionen, die sonst require große Reaktionsschleifen. Als nicht-segmentierten Rohrreaktoren sind die häufigsten Arten von Reaktoren in PCD-Anwendungen verwendet werden, der Rest dieses Artikels befasst sich mit diesem Reaktortyp-Setup. Die Gestaltung der Reaktionsstrom (RF) Spalte enthält einen Multiport-Endanschlußstück, die mobile Phase (oder Eingabe) die Säule entweder durch einen einzelnen Port an dem radialen mittleren Bereich der Kolonne oder drei Öffnungen an der äußeren Lage angeordnet zu verlassen erlaubt Wandbereich der Säule (siehe Abbildung 3). Diese beiden Ströme werden getrennt Endfitting mit einer zentralen porösen Fritte enthält, die durch eine undurchlässige Ring umgeben ist, der wiederum durch eine äußere poröse Fritte umgeben ist, die an der Kolonnenwand heraus erstreckt. Aufgrund der zentralen Strömungs undurchlässige Ringquer ist zwischen den beiden porösen Bereichen nicht möglich. Während der Reaktionsströmungs Chromatographie das Derivatisierungsreagenz (s) gegen die Strömungsrichtung der mobilen Phase gepumpt in einen oder two der äußeren Öffnungen des Reaktionsstromkolonne. Die Säule wird mit dem Eluens Derivatisierungsreagenz (s) in der äußeren Fritte vermischt und zu dem Detektor durch einen freien Außen Port geleitet. Die Reaktionsstrom kann entweder für ein einzelnes Reagenz Derivatisierung verwendet werden oder einem dualen Reagenzsystem (2 Anschlüsse für die Derivatisierungsreagenzien (1-Port für den Derivatisierungsreagenzes, 1 Anschluss des Säuleneluent an den Detektor und 1 Port blockiert passieren) und 1-Port passieren die Säuleneluent zum Detektor). Die Strömung aus dem zentralen Strom kann entweder verwendet werden , um die nicht derivatisierte Säuleneluent zu erfassen, effektiv Multiplexen Detektions 23 oder Abfall geleitet. Eine Hauptabstimmungstechnik, die verfügbar ist, wenn ausgeführt RF-PCD-Chromatographie ist das Verhältnis der zentralen und peripheren fließt. Das optimale Verhältnis für jede Derivatisierung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie beispielsweise, ob die zentralen Strömungs wird Abfall nachgewiesen oder übergeben werden. Daher einmal das optimale Verhältnis bestimmt worden istSollte es, dass die richtige Strömungsverhältnis wird jedem Lauf durchgeführt wird, bevor erreicht werden gewährleistet. Es wurde gefunden, dass die Verwendung einer Fritte in effizienter Vermischung im Vergleich zu herkömmlichen Mischtechniken, verwenden typischerweise einen Null Totvolumen T-Stück oder geringes Totvolumen der Säule Eluentenstrom und das Derivatisierungsreagenz in RF-PCD Ergebnisse zu mischen W- Stück die beiden Ströme zu mischen. Dies hat sich für die Verwendung von relativ kleinen Reaktionsschleifen, oder sogar die Eliminierung der Reaktionsschleife insgesamt erlaubt. Die Reduktion der Reaktionsschleife Größe führt zu schärferen Peaks im Vergleich zu herkömmlichen Nachsäulenderivatisierung Methoden. Das bedeutet, dass, trotz der Tatsache, dass nicht alle der Säule Eluent wird derivatisiert, größeres Signal-Rausch-Verhältnisse eingehalten werden und somit niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs erreicht werden. Die Reaktionsfluss-Chromatographie wurde Schwierigkeiten bei der Anpassung von PKD-Reaktion zu überwinden entwickelts zu modernen HPLC-Säulen und Systeme, insbesondere der Effizienzverlust durch Band verursachte Verbreiterung aufgrund der großen Post-Säule Toten durch die Notwendigkeit verursacht Volumina großes Volumen Reaktion zu verwenden Schleifen. Die effizientere Mischprozesse in RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD bedeuten, dass kleinere Reaktionsschleife Volumina verwendet werden in beobachteten Abscheideleistung zu einer Erhöhung führt. Weiterhin RF-PCD-Chromatographie zeigt sowohl Signal erhöht und verringert Lärm im Vergleich zu herkömmlichen Techniken PCD in unteren Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden PCD führt. Ein zusätzlicher Vorteil des RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD Methoden ist die Fähigkeit, den underivatisierten Strom zu überwachen, die von dem zentralen Port des RF-Säule sowie der derivatisierten Strom eluiert, die aus dem Umfangsbereich der Säule eluiert. RF-PCD ist ein relativ neues, aber vielversprechende Technik, die viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden PCD zeigt. <p class="jove_content"&gt; Anschluss der RF-Säule wird in fast der gleichen Weise wie eine herkömmliche HPLC-Säule mit dem wichtigen Unterschied, die Anzahl der Endarmaturen auf einer RF-Säule erreicht. verwendeten Armaturen eine Standard-HPLC-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden, können verwendet werden, um eine RF-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump(s) for derivatization system</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td><td>Non-commercial</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td></td><td></td><td>Provided with column</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td></td><td></td><td>4-point analytical balance</td></tr><tr><td>Stop watch</td><td></td><td></td><td>Non-Scientific equiptment</td></tr><tr><td>Eluent collection vials</td><td></td><td></td><td>Any Small vial with a flat bottom will do, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, HPLC vials</td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td></td><td></td><td>Will depend on instrument used</td></tr><tr><td>Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory glassware</td><td></td><td></td><td>Volumetric Flasks, pippettes, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; Quantity and volumes will depend on sample preparation method.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipyrene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide&amp;nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Die erste PCD - Verfahren, die zur Verwendung von RF-PCD wurde die Derivatisierung von Antioxidantien mit der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) • 24 angepasst. Diese Reaktion wurde durch Koleva et al vorgestellt. 25 und seit weit verbreitet ist. Die Detektion beruht auf der Entfärbung des DPPH • Radikale in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies, damit die Anwesenheit von Antioxidationsmitteln führt zu einem Abfall in der beobachteten Extinktion. D...

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

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Chemistry

Unit 1

Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K Aufrufe.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Serie: Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstimmen eines Parallel Segmented Flow Säule und Aktivieren von Mehrfachanalysen

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Forschung

Chemie

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Vorhang-Flow-Säule: Optimierung der Effizienz und Empfindlichkeit

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

A Robust Method for Packing High Resolution C18 RP-nano-HPLC Columns

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. Here we introduce a robust, reproducible and inexpensive protocol for preparation of a nano-flow reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) columns for on-line separation of analytical peptides before introduction into and detection by a mass-spectrometer in traditional bottom-up proteomics workflows. Depending on the goal of the experiment and the chemical properties of the analytes being separated, optimal column parameters may differ in their internal or outer diameters, length, particle size, pore size, chemistry of stationary phase particles, and the presence or absence of an integrated electrospray emitter at the tip. An in-house column packing system not only enables the rapid fabrication of columns with the desired properties but also dramatically reduces the cost of the process. The optimized protocol for packing a C18 AQ (aqueous) fused silica column discussed here is compatible with a wide range of liquid chromatographic instruments for achieving effective separation of analytes.

Here, we present and evaluate a protocol for making low cost reversed phase nano-flow liquid chromatography columns for peptide characterization using LC-MS/MS proteomic workflows.

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. ...

Biochemie

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

Einfache Inhouse-Herstellung von Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen mit dem FlashPack-Ansatz

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlagen der analytischen Chemie

Column Chromatography

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This technique utilizes a stationary phase, which is packed in a column, and a mobile phase that passes through the column. This technique exploits the differences in polarity between compounds, allowing the molecules to be facilely separated.1 The two most common stationary phases for column chromatography are silica gel (SiO2) and alumina (Al2O3), with the most commonly used mobile phases being organic solvents.2 The solvent(s) chosen for the mobile phase are dependent on the polarity of the molecules being purified. Typically more polar compounds require more polar solvents in order to facilitate the passage of the molecules through the stationary phase. Once the purification process has been completed&#160;the solvent can be removed from the collected fractions using a rotary evaporator to yield the isolated material.

Column Chromatography: Principle, Separation of Compounds from a Mixture

Säulenchromatographie

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This ...

Grundlagen der organischen Chemie

Principles Of Column Chromatography

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. Further, in 1941, Archer John Porter Martin and R. L. M. Synge modified the technique by packing silica gel into a column. A mixture of amino acids was then separated on the packed column using chloroform and water mixture as the mobile phase. This was the first report on column chromatography. At present, column chromatography is a widely used technique for separating various types of compounds from a sample mixture.
Factors Influencing Efficient Separation of Proteins 
Various parameters like column material, packing, and operational conditions such as flow rates and temperature determine the efficiency of separation by column chromatography.
The choice of column material or matrix determines the extent of interaction with the sample. The matrix material must be tightly and uniformly packed in the column. Air bubbles, debris, large particles, and precipitates interfere with the uniform flow of the solvent through the column, affecting its separation efficiency. The column should also be free from particulate matter.
The sample injected into the column should be clear and free from aggregates that might clog the column, hindering solvent flow. The flow rate of solvent also affects the separation. Very high or very low flow rates of solvents result in inefficient separation of compounds and impure preparations. Very high rates may also disturb the column packing, affecting process efficiency. In addition, the composition of elution buffer is also an important factor. It should be non-corrosive and compatible with the sample and also the column material to prevent in situ precipitation or dissolution.
Another operational parameter, temperature, also plays an important role in the process. It decides the stability of the sample, column material, and solvent buffer. Also, a constant temperature throughout the column efficiently resolves compounds. After completing the separation process, the columns must be washed thoroughly by repeatedly passing a suitable solvent to avoid sample contamination in further runs. Occasionally, the solvent is passed in a column in the reverse direction to remove any clogged material.
Limitations
Though a very widely used technique, the method still has some limitations. It is a very time-consuming method as the flow rates need to be slower for better resolution of the compounds. Also, large quantities of highly pure solvents required in the mobile phase make the process expensive. This also raises the scaling-up cost when higher yields of pure compounds are needed.

Grundlagen der Säulenchromatographie

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. ...

Zellbiologie

Analysieren von Zellen und Proteinen

SCHLÜSSELBEGRIFFE UND KONZEPTE

Types Of Column Chromatography

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating parameters such as pH, temperature, or solvent affect the packing of the column material, thereby determining the purification efficiency. The choice of column material also plays an essential role in deciding the operating parameters and can be modified based on the proteins that need to be purified.
Gel Filtration Chromatography 
When the protein&#39;s chemical nature is unknown, gel filtration chromatography is used for purification based on size. Matrices such as agarose, polyacrylamide, dextran derivatives, or silica beads are used for low-pressure systems, whereas polymeric resins are used for higher flow rates. The varying degree of cross-linking of these polymeric materials determines the pore size of the matrix, which decides the size range of proteins that can be separated.
Ion Exchange Chromatography
Ion-exchange chromatography can purify proteins based on their net charge at a particular pH determined by their isoelectric point or pI. The net charge on matrix resin is used to purify oppositely charged proteins by replacing the cations or anions from the matrix resin with the charged proteins. The resins are categorized based on the type of ion that is exchanged &#8212; positively charged proteins replace cations from cation-exchange resins, and vice versa. Strong ion exchangers with stability over a wide range of buffer pH include quaternary ammonium, sulfonate, and sulfopropyl resins. In contrast, weak ion exchangers that are effective only in a narrow pH range include diethyl aminoethyl (DEAE) or carboxymethyl (CM) resins.
Affinity Chromatography
Affinity chromatography involves immobilizing protein-specific antibodies or enzyme-specific substrates to the column material, usually agarose beads. For example, a column with the immobilized antibody of choice is prepared to separate specific antigens. When the mixed antigen sample is passed through the&#160; column, the target antigens bind to the immobilized antibodies and separate from the mixture. To separate recombinant proteins tagged with enzymes such as beta-galactosidase, the corresponding substrate Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG) is immobilized on the column to purify the enzyme.
High-pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) are the most commonly used column chromatography techniques. In HPLC, the solvent flows at high pressure through a tightly packed column that improves efficiency. Gas chromatography analyzes volatile compounds by converting them to their gaseous forms upon heating. The volatilized sample is pushed through the column by inert gasses such as nitrogen and helium.

Arten der Säulenchromatographie

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating ...

High-Performance Liquid Chromatography: Introduction

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, identify, and quantify components in complex mixtures. The term &#34;high pressure&#34; refers to using high pressure to push the liquid mobile phase through the tightly packed columns.
In HPLC, two phases play a critical role in the separation process:
<ol>
	<li>Mobile Phase: This is a liquid solvent that flows through the system, carrying the sample with it. The solvent is chosen based on its polarity to optimize the interaction with the analytes and the stationary phase. The &#34;polarity index&#34; serves as a guide to selecting the suitable solvent for separation.</li>
	<li>Stationary Phase: The stationary phase is a solid material, often silica-based, packed within the column. In reverse-phase HPLC, the stationary phase is typically derivatized silica, such as octadecyl (C18) silica. The small particle size of the packed material creates a high surface area, enhancing interactions with the analytes. To reduce undesirable interactions, such as those with unreacted silanol groups, the stationary phase is often end-capped with reagents like trimethylchlorosilane</li>
</ol>
Separation occurs as the analytes interact differently with both the mobile and stationary phases, depending on their chemical properties, which leads to differential migration through the column.
Sometimes, solute molecules bind irreversibly to the stationary phase, clogging the analytical column and decreasing its performance. To prevent this, a guard column is placed before the analytical column. A precolumn called a scavenger column may also be placed between the mobile phase reservoir and the injector. This ensures that the solvent enters the analytical column, which is already saturated with silica from the scavenger column, preventing unwanted reactions and extending the lifetime of the analytical column.
After the separation, analytes are detected by various detectors, depending on the characteristics of the compounds. The results are visualized as chromatograms, with peaks corresponding to the different components of the mixture. This provides both qualitative and quantitative data about the sample.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Einführung

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, ...

Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

Zusammenfassung

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Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Säulenchromatographie

Grundlagen der Säulenchromatographie

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Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Einführung

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