This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Cuidado: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para o metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, analítica equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados). Nota: Este protocolo descreve 3 métodos de fluxo de reacção de derivatização pós-coluna técnicas (RF-DCP), cada um com um reagente diferente específico para a natureza de um composto químico de interesse. Para a análise dos ROS vá para a seção &quot;1. Detecção de ROS usando DPPH •&quot;, para a análise de aminas primárias ver secção &quot;2. Detecção de aminas primárias usando fluorescamine&quot;, e para a análise de compostos fenólicos vá para a seção &quot;3 . Detecção de fenóisusando 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio &quot;. Use água ultra-pura (por exemplo, água Milli-Q) por toda parte. Nota: A ligação a coluna de RF é conseguida em quase da mesma maneira como uma coluna de HPLC convencional, com a principal diferença sendo o número de acessórios terminais numa coluna de RF. Acessórios utilizados para ligar uma coluna de HPLC padrão para o sistema de HPLC é capaz de ser utilizado para ligar uma coluna de RF para o sistema de HPLC. 1. Detecção de ROS Usando DPPH • <ol><li> Criação de instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com 100% de água na linha A e 100% de metanol em linha B como a fase móvel. Purgar as bombas como por exigências do fabricante. </li><li> Defina-se os componentes instrumentais HPLC e a bomba de derivatização adicional como ilustrado na Figura 4A. </li><li> Ajuste o detector de UV-Vis a analisar num comprimento de onda de 520 nm. </li></ol></li><li> Criação decoluna de RF <ol><li> Ligue a entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC. </li><li> Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF. </li><li> Conectar uma porta periférico de saída para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros. </li><li> Ligue o DPPH • linha da bomba para uma porta periférica na saída da coluna de RF. </li><li> Bloquear a porta periférica não utilizado na saída da coluna de RF usando uma rolha de coluna. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% da linha B - 100% de metanol. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel de metanol a 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo deve ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol></li><li> Preparação de DPPH • reagente <ol><li> Prepara-se uma solução / ml 0,1 mg de DPPH • em metanol. </li&gt; <li> Sonicar o balão contendo o DPPH • reagente durante 10 min. </li><li> Cobrir o balão em folha para evitar a exposição à luz. </li><li> Purgar o DPPH • bomba com o preparado DPPH • reagente como por exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Ajustando a saída de coluna RF <ol><li> Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico. </li><li> Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min. </li><li> Re-pesar o recipiente de porta central e calcular o peso do caudal da ligação central, como segue: Peso de Port Central (g) = peso final de navios no porto Central (g) - peso inicial de Port Central Vessel (g) </li><li> Repita os passos 1.4.2 e 1.4.3 para o efluente que sai do UV-Vis que é conectada à porta periférica da coluna de RF e calcular o peso em relação ao navio porta periférica comosegue: Peso de Peripheral Porto (g) = Peso final do vaso periférico Porto (g) - peso inicial de Peripheral Porto Veículo (g) </li><li> Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma: % Porto central = Peso da porta central (g) / (peso da porta central (g) + peso da porta periférica (g)) x 100 % Porta periférica = Peso da Peripheral Porto (g) / (peso de Port Central (g) + Peso do Peripheral Porto (g)) x 100 </li><li> Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e o fluxo periférico é 30:70 (central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 30%, diminuir a quantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central. Se o fluxo central estiver abaixo de 30% de redução do comprimento da tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central. </li><li> Repetir o passo 1.4.1 a 1.4.6, até uma proporção de 30:70 de segmentação (Central: periférica) é alcançado. </li><li> Definir a taxa de fluxo do DPPH • bomba do reagente a 0,5 ml min -1. Nota: A coluna RF configurado com DPPH • reagente está pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado. </li></ol></li><li> Pós-condições executar desligamento <ol><li> Uma vez que todas as amostras foram injetados, indicando que a execução foi concluída, interrompa o fluxo da bomba de reagente de derivatização. </li><li> Remova o DPPH • linha de bomba do reagente a partir do porto periférica e tapar a porta. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel, em que é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL min-1 durante 10 min. </li><li> Pare o fluxo da bomba de fase móvel de HPLC no instrumento. </li><li> Substitua o DPPH • reagente com metanol e purgar a bomba adicional. Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado. </li></ol></li></ol> 2. Detecção de aminas primárias Usando fluoresamina <ol><li> Preparação da fase móvel <ol><li> Prepare 1 L de uma solução de acetato de amónio 10 mM, ajustando o pH da solução a 9,0 com hidróxido de amónio 5 M, antes da diluição para o volume. </li><li> Adicionar 52,6 ml de acetonitrilo (ACN) para o tampão acetato de amónio para atingir uma fase móvel pré-misturada de 95:05 (tampão: ACN). </li></ol></li><li> Criação de instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com o tampão de pré-misturada preparada na linha A, tal como a fase móvel. Purgar a bomba como por exigências do fabricante. </li><li> Defina-se os componentes instrumentais HPLC e a bomba de derivatização adicional como ilustrado na Figura 4A. </li><li> Anexar uma bobina amortecedor de pulsações para a bomba de derivação. </li><li> Defina-se o detector de fluorescência (FLD) com um comprimento de onda de excitação de 390 nm de comprimento de onda e de emissão de 475 nm. </li></ol></li><li> Criação de coluna RF <ol><li> Ligue the de entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC. </li><li> Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF. </li><li> Conectar uma porta periférica saída da coluna de RF para o detector FLD utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros. </li><li> Ligar a bomba de linha de derivação para um porta periférica na saída da coluna de RF. </li><li> Bloquear a porta periférica não utilizado na saída da coluna de RF usando uma rolha de coluna. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% da linha A - 10 mM de tampão de acetato de amónio pH 9, pré-misturado com 5% de ACN. </li><li> Equilibrar a coluna com a linha de uma fase móvel de 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo pode ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de fluorescamina <ol><li> Adicione 100 ml de uma solução a 0,1 mg mL -1 fluorescamina reagente. </li> &lt;li&gt; Sonicate durante 1 min. </li><li> Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Purgar a bomba do reagente com o reagente fluorescamine preparado de acordo com as exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Ajustando a saída de coluna RF <ol><li> Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico. </li><li> Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min. </li><li> Re-pesar o recipiente central e calcular o peso do caudal da ligação central, como se segue no passo 1.4.3. </li><li> Repita os passos 2.5.2 a 2.5.3 para o efluente que sai do FLD que é conectada à porta periférica da coluna de RF e para calcular o peso periférico da seguinte forma no passo 1.4.4. </li><li> Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma no passo 1.4.5. </li><li> Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e periféricofluxo é 43:57 (Central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 43%, diminuir a quantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central. Se o fluxo central estiver abaixo de 43%, reduzir o comprimento de tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central. </li><li> Repita o passo 2.5.1 a 2.5.6 até um rácio de segmentação das 43:57 (central: periférica) é alcançada. </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de fase móvel a 0,7 ml min -1. </li><li> Defina a bomba de derivação a fluir a 0,1 ml min -1. Nota: A coluna RF configurado com reagente fluorescamine está agora pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado. </li></ol></li><li> Pós-condições executar desligamento <ol><li> Uma vez que todas as amostras foram injetados, indicando que a execução foi concluída, desligue a bomba de derivação. </li><li> Remova a linha da bomba de derivação a partir do porto periférica e rolha. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel emque é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL min-1 durante 10 min. </li><li> Pare o fluxo da bomba da fase móvel. </li><li> Substitua o reagente fluorescamine com acetonitrilo e purgar a bomba de derivação. Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado. </li></ol></li></ol> 3. Detecção de fenóis utilizando 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio <ol><li> Preparação da fase móvel <ol><li> Prepare 1 L de uma solução de acetato de amónio 100 mM, ajustando o pH da solução a 9,0 com hidróxido de amónio 5 M, antes da diluição para o volume. </li><li> Adicionar 52,6 ml de metanol ao tampão de acetato de amónio para atingir uma fase móvel pré-misturada de 95: 5 (tampão: metanol). </li></ol></li><li> Criação de instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com o tampão de pré-misturada preparada na linha A, tal como a fase móvel. Purgar a bomba de acordo com o fabricante &quot;; S exigências. </li><li> Defina-se os componentes instrumentais de HPLC e as duas bombas de reagentes adicionais, como ilustrado na Figura 4B. </li><li> Anexar uma bobina amortecedor de pulsações para cada uma das bombas de reagentes. </li><li> Ajuste o detector de UV-Vis a analisar num comprimento de onda de 500 nm. </li></ol></li><li> Criação de coluna RF <ol><li> Ligue a entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC. </li><li> Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF. </li><li> Conectar uma porta periférica saída da coluna de RF para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros. </li><li> Conectar cada reagente (isto é, 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio) A linha da bomba para uma porta periférica na saída da coluna de RF. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% da linha A - 100 mM de tampão de acetato de amónio pH 9, pré-misturado com 5% de metanol. </li><li> Equilibrar a coluna Wom a linha de uma fase móvel de 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo pode ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de 4-aminoantipireno <ol><li> Preparar um tampão de acetato de amónio com um pH de 9 seguindo a etapa 3.1.1. </li><li> Pesar 150 mg de 4-aminoantipireno e dissolve-se em 100 ml de tampão de acetato de amónio preparada (pH 9). </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Purgar a primeira bomba do reagente com o reagente 4-aminoantipireno preparado de acordo com as exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de ferricianeto de potássio <ol><li> Pesar 150 mg de ferricianeto de potássio e dissolve-se em 100 ml de tampão de acetato de amónio (pH 9) preparados como no passo 3.1.1. </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cobrir em papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Purge a segunda bomba do reagente com o reagente de ferricianeto de potássio preparada de acordo com as exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Ajustamento de coluna RF <ol><li> Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico. </li><li> Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min. </li><li> Re-pesar o recipiente central e calcular o peso do caudal da ligação central, como se segue no passo 1.4.3. </li><li> Repita os passos 3.6.2 a 3.6.3 para o efluente que sai do UV-Vis que é conectada à porta periférica da coluna de RF e para calcular o peso periférico da seguinte forma no passo 1.4.4. </li><li> Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma no passo 1.4.5. </li><li> Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e o fluxo periférico é 50:50 (central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 50%, diminuir oquantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros ao centro da porta de saída. Se o fluxo central estiver abaixo de 50%, reduzir o comprimento de tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central. </li><li> Repetir o passo 3.6.1 a 3.6.6, até uma proporção de 50:50 de segmentação (Central: periférica) é alcançado. </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de 4-aminoantipireno a 0,5 ml min -1. </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de ferricianeto de potássio a 0,25 ml min -1. Nota: A coluna RF configurado com os reagentes de dois componentes está agora pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado. </li></ol></li><li> Pós-condições executar desligamento <ol><li> Uma vez que todas as amostras foram injetados a corrida terminou, indicando que a execução foi concluída, pare de ambas as bombas dos reagentes. </li><li> Remova as linhas de bomba de reagente a partir dos portos periféricos e substituí-los com um pedaço 15 cm de tubo 0,13 mm. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel em WHICH é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL min-1 durante 10 min. </li><li> Pare o fluxo da bomba de fase móvel de HPLC no instrumento. </li><li> Substitua ambos os reagentes sobre o reagente bombas com metanol e purgar as bombas adicionais como por exigência do fabricante. Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado. </li></ol></li></ol>

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	<li>Srijaranai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+1-(2-pyridylazo)-2-naphthol+as+the+post+column+reagent+for+ion+exchange+chromatography+of+heavy+metals+in+environmental+samples.">Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples.</a> Microchem. J. 99, 152-158 (2011).</li><li>Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-VIS+detection+of+amino+acids+in+liquid+chromatography:+online+post-column+solid-state+derivatization+with+Cu(II)+ions.">UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions.</a> J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).</li><li>Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+aflatoxins+in+cereal+flours+by+solid-phase+microextraction+coupled+with+liquid+chromatography+and+post-column+photochemical+derivatization-fluorescence+detection.">Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection.</a> J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).</li><li>Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+N-nitrosamines+and+other+nitro(so)+compounds+in+water+by+high-performance+liquid+chromatography+with+post-column+UV+photolysis/Griess+reaction.">Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction.</a> Water Res. 47, 4893-4903 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+isoflavonoids+in+Radix+Puerariae+for+quality+control+using+on-line+high+performance+liquid+chromatography-diode+array+detector-electrospray+ionization-mass+spectrometry+coupled+with+post-column+derivatization.">Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization.</a> Food Res Int. 48, 528-537 (2012).</li><li>Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+coupled+to+on-line+post+column+derivatization+for+the+determination+of+organic+compounds:+a+review+on+instrumentation+and+chemistries.">Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries.</a> Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).</li><li>Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrophilic+interaction+chromatography+determination+of+lysine+in+pharmaceutical+preparations+with+fluorescence+detection+after+postcolumn+derivatization+with+o-phtaldialdehyde.">Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde.</a> J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).</li><li>Iijima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Online+Post-Column+Derivatization+System+for+Ultra+High-Performance+Liquid+Chromatography+(UHPLC)+and+Its+Applications+to+Analysis+of+Biogenic+Amines.">Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines.</a> Anal Sci. 29, 539-545 (2013).</li><li>Cunico, R. L., Schlabach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Ninhydrin+and+o-Phthalaldehyde+Postcolumn+Detection+Techniques+for+High+Performance+Liquid+Chromatography+of+Free+Amino.">Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino.</a> J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).</li><li>Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Measurement+of+Leucine-specific+Activity+in+Biological+Fluids+by+Ion-exchange+Chromatography+and+Post-column+Ninhydrin+Detection.">Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection.</a> J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+A+Reagent+for+Assay+of+Amino+Acids,+Peptides,+Proteins+and+Primary+Amines+in+the+Picomole+Range.">Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range.</a> Science. 1972, 871-872 (1972).</li><li>Samejima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Fluorescamine+Derivitices+of+Aliphatic+Diamines+and+Polyamines+by+High+Speed+Liquid+Chromatography.">Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+antioxidant+activity+of+ten+compounds+in+different+tea+samples+by+means+of+an+on-line+HPLC-DPPH+assay.">Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay.</a> Food Res Int. 53, 847-856 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+anti-oxidants+in+Flos+Chrysanthemi+by+HPLC-DAD-ESI/MS(n)+and+HPLC+coupled+with+a+post-column+derivatisation+system.">Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system.</a> Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).</li><li>Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+validation+of+post-column+assay+for+screening+of+radical+scavengers+in+herbal+raw+materials+and+herbal+preparations.">Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).</li><li>Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+post-column+free+radical+scavenging+and+ferric+reducing+antioxidant+power+assays+for+screening+of+antioxidants+in+strawberries.">Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries.</a> J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Methimazole+in+Pharmaceutical+Preparations+using+an+HPLC+Method+Coupled+with+an+Iodine-Azide+Post-Column+Reaction.">Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction.</a> J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+with+post-column+iodine-azide+reaction+for+the+determination+of+thioguanine.">Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine.</a> J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).</li><li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurements+of+the+true+column+efficiency+and+of+the+instrument+band+broadening+contributions+in+the+presence+of+a+chromatographic+column.">Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column.</a> J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).</li><li>Stewart, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+cotumn+derivatization+methodology+in+high+performance+liquid+chromatography+(HPLC).">Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC).</a> Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).</li><li>Rigas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography.">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li><li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid:+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent.">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (2015).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD permite a mistura eficiente do reagente de derivatização com o efluente pós-coluna de HPLC, sem a utilização de bobinas de reacção, minimizando os efeitos de alargamento de banda e melhorar o desempenho da separação. métodos de RF-PCD também mostraram melhorias na resposta de sinal em relação ao método de detecção. Camenzuli et al. 28 foi o primeiro a reportar o uso de colunas de fluxo de reacção com DPPH • para a detecção de ROS em uma amostra de café espress...

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com pós-coluna de derivação (PCD) é uma poderosa ferramenta que é útil para resolver uma série de questões em laboratório analítico. Ele pode ser usado para detectar compostos que são de outra forma indetectável, com o conjunto de detectores disponíveis 1,2, aumentar o sinal do analito alvo, o que permite que os limites inferiores de detecção e quantificação 3-5 ou derivatizar selectivamente um analito alvo, a fim de evitar efeitos de matriz 6. PCD reacções comumente usados ​​incluem a reacção de aminas, tais como aminoácidos, com orto-phthaladehyde 7-9, ninidrina 9,10 ou 11,12 fluorescamina, a derivatização de espécies reactivas de oxigénio (ROS) com a 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicais DPPH (•) 13,14 ou 2,2&#39;-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) 15,16, e o uso do reagente de iodeto-azida para derivatizar enxofre ccompostos ontaining 17,18. Existem, no entanto, numerosos inconvenientes para a utilização de reacções de PCD com sistemas de HPLC 6. Principalmente entre estes é a utilização de bobinas de reacção entre o ponto de adição do reagente de derivatização (s) e o detector, que permite que o tempo para a mistura e a reacção ocorra 8. Estes laços de reacção muitas vezes têm volumes de 500 uL ou mais, o que é significativo em comparação com o volume do restante do sistema de HPLC 19. A utilização destes reacção alto volume ciclos resulta em aumento de alargamento do pico em relação ao que seria observada sem a presença do circuito de reacção. Isto resulta em picos menores, mais largas que têm limites superiores de quantificação e de detecção e resolução cromatográfica negativamente os efeitos. As Figuras 1 e 2 destacar a deterioração da forma do pico que resultam da adição de vários volumes de coluna de ansa reacção pós. esta análisefoi realizado com uma composição de fase móvel de 94% de metanol e 6% de água Milli-Q. O caudal da fase móvel foi de 1 ml / min, o volume de injecção foi de 20 pi e o comprimento de onda análise foi 265 nm. foram inseridos bobinas de diferentes volumes mortos a partir de 20 uL a 1.000 ul entre a coluna e o detector para simular os efeitos de volume morto ciclo de reacção em métodos de PCD. Estes laços foram preparados a partir de tubagem de aço inoxidável de diâmetro interno de 0,5 mm. A experiência foi realizada num sistema de HPLC consiste de um controlador (SCL-10AVP), uma pressão baixa Gradiente válvula (FCL-10ALVP), uma bomba (LC-20AD), um injector (SIL-10ADVP), e um detector de PDA ( SPD-M10ADVP). A fase móvel foi bombeada através de um desgaseificador, antes da introdução no sistema de HPLC. A separação foi efectuada utilizando um x 4,6 mm ID 5? M 250 milímetros. As condições experimentais foram escolhidas para ser típica de reacções de PCD que foram recentemente publicados na literatura. omais simples, mais comum pós configuração do reactor de coluna é denominado um reactor tubular não segmentada que é efectivamente um tubo longo, fino, através do qual o líquido pode fluir e a reacção pode ter lugar. Neste sistema de alargamento de pico é dependente não apenas o volume morto adicionado ao sistema, mas também o diâmetro interno do tubo, como realçado por Iijima et al. 8. Além disso, a geometria da bobina desempenha um papel na ampliação da marca observada. Stewart 20 indicou que enrolamento do reactor muda os perfis de fluxo secundário, o que resulta em uma melhor mistura, o que significa que o volume morto pode ser minimizada. Tem sido afirmado que o pico ampliação não é significativo quando se usa um tubo aberto malha bobina 21. Quando o alargamento do pico é excessivamente grande, outros tipos de reactores também podem ser considerados 20,22. Estes podem incluir reatores de leito ou reatores de fluxo segmentado. Estes reactores são particularmente úteis para reacções lentas que de outra forma protece grande reação laços. Como reactores tubulares não-segmentadas são os tipos mais comuns de reatores utilizados em aplicações de PCD, o resto deste artigo lida com este tipo de configuração do reator. O desenho da coluna de fluxo de reacção (RF) incorpora uma montagem final de multi-porta que permite fase móvel para sair (ou enter) a coluna, quer através de uma única porta situada na região central radial da coluna ou três portas localizadas no exterior zona da parede da coluna (ver Figura 3). Estes dois fluxos são separados usando uma montagem final contendo uma frita porosa central que está rodeada por um anel impermeável que é por sua vez rodeado por uma frita porosa externa que se estende para fora da parede da coluna. Devido ao fluxo de anel de cruzeta impermeável central não é possível entre as duas regiões porosas. Durante a cromatografia de fluxo reacção, o reagente (s) de derivatização são bombeados contra a direcção do fluxo da fase móvel em um ou TWo das portas exteriores da coluna de fluxo reacção. O eluente da coluna é misturado com o reagente (s) derivatização na frita exterior e passado para o detector por meio de uma porta exterior livre. fluxo reacção pode ser utilizada tanto para uma derivatização reagente único (uma porta para o reagente de derivatização, uma porta para passar o eluente da coluna para o detector e uma porta bloqueada) ou um sistema de reagentes dupla (2 portas para os reagentes de derivatização e uma porta de passar o eluente da coluna para o detector). O fluxo da corrente central pode ser usado para detectar o eluente da coluna não derivatizado, de forma eficaz de detecção de multiplexação 23, ou passado para o lixo. Uma técnica importante de sintonização que é disponível quando executado cromatografia RF-PCD é a razão entre os fluxos de centrais e periféricos. A razão óptima para cada derivação depende de um número de factores tais como se o fluxo central irá ser detectado ou passado para o lixo. Por conseguinte, uma vez que a razão óptima foi determinada, Deve garantir-se que o rácio fluxo correto é alcançado antes de cada corrida a ser realizada. Verificou-se que a utilização de uma frita para misturar o fluxo de eluente de coluna e o reagente de derivatização em RF-PCD resulta em uma mistura mais eficiente em comparação com técnicas de mistura tradicionais que empregam tipicamente uma peça em T volume morto zero ou de baixo volume morto W- peça de misturar as duas correntes. Isto permitiu a utilização de relativamente pequenas laçadas de reacção, ou mesmo a eliminação da laçada de reacção completamente. A redução dos resultados de reacção de tamanho de malha em mais nítidas picos em comparação com métodos tradicionais de derivatização pós-coluna. Isto significa que, apesar do facto de nem todo o eluente da coluna é derivatizado, maior sinal para relações de ruído são observados e, portanto, os limites inferiores de detecção e de quantificação pode ser conseguida. cromatografia de fluxo reacção foi desenvolvido para ultrapassar as dificuldades com a adaptação de reacção PCDs a colunas de HPLC modernos sistemas e, em particular a perda de eficiência causada por banda alargando devido a volumes mortos pós-coluna grandes causadas pela necessidade de empregar um grande volume de reacção de laços. Os processos de mistura mais eficientes na FR-PCD em comparação com PCD convencional significa que os volumes de ansa de reacção mais pequenas podem ser empregues levando a um aumento na eficiência de separação observada. Além disso cromatografia RF-PCD mostra tanto o aumento do sinal e ruído diminuiu em comparação com técnicas convencionais de PCD, resultando em limites inferiores de detecção e quantificação, em comparação com os métodos convencionais de PCD. Uma vantagem adicional de RF-PCD em comparação com os métodos convencionais de PCD é a capacidade de controlar o fluxo não derivatizado, que elui a partir da porta central da coluna de RF, assim como o fluxo de derivatizado que elui a partir da região periférica da coluna. RF-PCD é uma técnica relativamente nova, mas promissora que apresenta muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais de PCD. <p class="jove_content"&gt; Conexão da coluna de RF é conseguida em quase da mesma maneira como uma coluna de HPLC convencional, com a principal diferença sendo o número de acessórios terminais numa coluna de RF. Acessórios utilizados para ligar uma coluna de HPLC padrão para o sistema de HPLC é capaz de ser utilizado para ligar uma coluna de RF para o sistema de HPLC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HPLC instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Series HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Pump(s) for derivatisation system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>LC-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF colum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z227307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided with column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tube cutter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z290882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-point analytical balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-Scientific equiptment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eluent collection vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will depend on instrument used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Laboratory glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoantipyrene&#160;</td>
			<td>Acros Organics BVBA</td>
			<td>AC103151000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide&#160;</td>
			<td>AnalaR</td>
			<td>B10204-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

O primeiro método de PCD que foi adaptado para utilização por RF-CPD foi a derivatização de antioxidantes, utilizando o radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Esta reacção foi introduzido por Koleva et al. 25, e tem sido amplamente utilizada desde então. A detecção se baseia na descoloração do radical DPPH • na presença de espécies de oxigénio reactivas, portanto, a presença de antioxidantes resulta numa queda na absorvância observada. ...

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

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