Name: whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea at JoVE.com

This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

倫理の声明：動物を対象とする手順は、医学のサザンイリノイ大学での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 頭骨の1の抽出<ol><li>マウスの頭蓋骨13のベースに頭骨を識別し、標準パターン鉗子を使用して脳神経を削り取ります。 </li><li>カプセル化された蝸牛を取り除くために、耳のカプセルの先端に、下後部三半規管に反対ハンドプレスの親指で標準パターン鉗子を置きます。 </li><li>親指と人​​差し指で、または10.5センチメートル細かいハサミを使用して手動で頭蓋骨から頭骨の下半分を解放します。 </li></ol> 2.ポストフィックス頭骨<ol><li> 10mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4とincubで希釈し、500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA） - 250を含む2 mlのマイクロ遠心チューブに頭骨を配置20時間 - 2 RTで食べました。 注：円形または楕円形のウィンドウにPFAの頂端キャップまたは注射のいかなる開口部は必要ありません。ガラスバイアル中に16％の濃度で購入することができ、メタノール無料、超純、電子顕微鏡（EM）グレードPFAを使用することをお勧めします。バイアルを開け、1に希釈された後：PBS中4 4 O C（いくつかの抗体は、短い固定等を必要とする/ O（O / Nを許容することができるで保存した場合、4％の溶液を作り、それは最大2週間のために使用することができますN）固定）。 </li></ol> 3.脱灰頭骨<ol><li>固定後、ピペットを用いてPFAを削除し、120 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、少し以上の2mlで交換してください。管が閉じているときに空気が気泡を防ぐために、全体の2ミリリットルのマイクロチューブを記入してください。 <ol><li>すぐに脱灰されていない場合は、4 O℃で10mMのpH7.4のPBSと店舗のサンプルでPFAを交換 注：固定した後、側頭骨はvariab保存することができます検査されている抗原に応じて脱灰前の時間のル量。 </li></ol></li><li>転倒型回転器の上に置い管、室温で4 rpmで回転させます。ピペットを用いて毎日EDTA溶液を変更します。脱灰の長さは、サンプルの年齢および解剖をやって科学者の好みに依存します。 <ol><li>インキュベーション時間については、次のガイドラインを使用して、EDTA中で頭骨をインキュベート： 8 P15のサンプル生後日（P）の場合：2から4時間。 P21のサンプルP15の場合：O / N。 P30のサンプルP21の場合：2 O / N。 3以上のO / N：P30より古いサンプルについて。 注：脱灰時間は、ユーザーの好みの対象となり、必要に応じて拡張することができます。脱灰時間は約8時間離れて、一日二回EDTA溶液を変化させることによって低減することができます。汚染を防止するために、より長い3日間脱灰すると、一部のラボでは、EDTA溶液に1％PFAを追加します。 </li></ol></li><li>サンプルが十分に脱灰であるかどうかを判断するには、側頭骨のOを配置シリコンエラストマーで被覆された解剖皿をNAと優しくカタツムリ状の蝸牛に鉗子を押してください。組織がspongeyである場合、脱灰は完了です。 </li><li>脱灰が完了すると、ピペットを用いて、EDTAを除去し、10mMのpH7.4のPBSの500 -1000μlを添加します。解剖準備ができるまで4 O Cで保存サンプル。 </li></ol> 4.シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿を作成します。 <ol><li>ベースとシリコーンエラストマー封止キットの硬化剤は、製造者の指示に従って結合し、十分に混合します。 </li><li>ソリューションが黒になるまで粉末木炭の大さじ3、よく混ぜる - 約2を追加します。 注：液体インクまたは液体木炭を溶液と混合せず、使用することはできません。シリコーンエラストマー封止キットは、ステップ4.2を省略することができるように、黒で購入することができます。 </li><li>被覆に十分な底部を充填し、60 mmのガラスまたはプラスチック製のペトリ皿に溶液を注ぎます。 BU場合bblesは、表面上の空気とパフ存在しています。設定するには、室温で少なくとも24時間放置し。 注：シリコーンエラストマーで被覆された料理は何年も繰り返し使用することができます。これはシリコーンエラストマーに亀裂が発生しますしかし、洗浄のためにエタノールを使用しないでください。 </li></ol> （P7と古いサンプル用）蝸牛の5ホールマウント解剖<ol><li>頂端/ミドルターンから基底回転を分離<ol><li> 10mMのpH7.4のPBSで三分の二のフル充填シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿に1脱灰頭骨を置き、次のステップのためのステレオ解剖顕微鏡を使用しています。 </li><li> ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を用いて前庭地域の頭骨を持ち、5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、側面に沿って頂点上記過剰耳のカプセル組織を切り取ります。 </li><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、楕円形のウィンドウに1ブレードを挿入し、スパイラル靭帯/横に沿っていくつかの小さなカットを作ります基底回転の壁。 </li><li> 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、ちょうど卵円窓に正中、側頭骨の外に他のブレードをカットし、配置領域に1ブレードを挿入します。このカットは、中間および頂端ターンから基底回転を分離します。 </li></ol></li><li>基底回転の完全解剖。 <ol><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、基底回転の緊張を解放し、前庭器官から分離するために基底回転の下にカットする蝸牛軸に接続し、螺旋神経節神経繊維をカット。 </li><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、コルチ器官の上および下の両方からスパイラル靭帯/側壁を除去するために、小さなカットのシリーズを作ります。組織を導くために、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子を使用してください。シリコーンエラストマー被覆解剖皿にらせん神経節神経線維をピンが、組織が裂けるように、この領域に保持していません。 </li><li>前の手順、ライスナーのmembranのいくつかの中にeは、多くの場合、削除されます。いずれかがまだ残っている場合は、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子でライスナーの膜を把握し、コルチ器官から引き離します。 注：被蓋膜がまれに表示され、一般的に除去するための具体的なステップを必要とせずに離れて浮きます。 </li><li>最後に、できるだけ平坦ターンを行い、スパイラル神経節の残りの軸索を把握することで、解剖基底回転を転送するために＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用するように、スパイラル神経節軸索の厚さを減らすためにいくつかのカットを作ります10mMのpH7.4のPBSの〜500μLを含む48ウェルプレート（またはチャンバースライド）。 </li></ol></li><li>個別の真ん中と頂端ターン<ol><li>蝸牛の残りの三分の二、頂端側を下に置きます。 </li><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、中間ターンは基底回転に接続するために使用される中央階に1ブレードを挿入して、目のスパイラル靭帯/側壁に沿っていくつかの小さなカットを作ります電子真ん中のターン。 </li><li> 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、単に刃の上に置かミドルターンで切断領域に1ブレードを挿入し、先端チップ部から90 Oの角度で、骨迷路の外に他のブレードを配置します。これは、頂回転の中からターンを分離します。 </li></ol></li><li>基底回転と同様に、中間ターンの完全な解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。 </li><li>頂回転の完全解剖。 <ol><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、頂回転を覆うキャップを開きます。基底回転と同様に完全解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。 注：解剖蝸牛ターンは免疫染色の前に数週間4°Cの時に48ウェルプレート（またはチャンバースライド）に10mMのpH7.4のPBSに格納することができます。しかし、PBS長い2よりも蒸発し、定期的に補充する必要があり、記憶されます - 3週間で、細菌または真菌の増殖をもたらすことができます画像の品質を低下させることができる組織。我々はundissected頭骨などの試料の長期保存をお勧めします。 </li></ol></li></ol>蛍光タグ付き抗体による免疫染色6. <ol><li>解剖後、10mMのpH7.4のPBSの〜500μlの中に沈め、48ウェルプレート（またはチャンバースライド）で別々のウェル中の各蝸牛ターンを格納します。以下の各ステップについて蝸牛ターンは、液体中に浸漬されなければならない上に浮いていないか、ウェルの側面に付着しました。 注：各ウェルから液体を除去すると、それは蝸牛のターンを失うか、ピペットチップでそれを吸うのは簡単です。解剖スコープを使用して、200μlのピペットチップでソリューションを変更すると、これを防ぐことができます。 </li><li>ピペットを用いて、各ウェルからPBSを除去し、置き換える〜200と - /ブロッキング透過化溶液（ウェルあたり300μlの1％トリトンX-100、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、及び10％正常ヤギ血清（NGS） 10mMのPBS Pに希釈H 7.4）。 3D回転体に室温で1時間インキュベートします。 注：使用される任意の一次抗体は、ヤギのホストで行われた場合、二次抗ヤギ抗体が必要とされ、NGSは、ステップのいずれかに使用することはできません。正常ウマ血清をNGSの代替として使用することができます。 </li><li>ピペットを用いてブロッキング/透過処理溶液を除去し、一次抗体溶液をウェル当たり〜100μlで置き換える（0.1％トリトンX-100、10mMのPBS（pH7.4）中に希釈し、1％BSAおよび5％NGS）。各一次抗体のための希釈率が変化します。 3D回転体に4 O℃で O / N（最低14時間）インキュベートします。 注：複数の一次抗体を使用している場合は、すべてのインキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができ、ちょうど各一次抗体は、別のホストを持っていることを確認してください。 </li><li>ピペットを用いて、一次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。各洗浄は、3D回転体に室温で5分間の最小値をインキュベートします。 </li><li>最後のPを削除しますBSは、ピペットを用いて洗浄し、二次抗体溶液（0.1％トリトンX-100、1％BSAおよび5％の10mM PBS pH7.4中で希釈したNGS）のウェル当たり〜100μlで置き換えます。それぞれについて、希釈係数は、蛍光二次抗体をタグ付け、通常は1：500または1：1,000。光から蛍光タグ付き二次抗体を保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを置きます。 3D回転体に室温で3時間 - 2をインキュベートします。 注：複数の二次抗体を必要とする場合は、インキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができます。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギおよびニワトリ抗ヤギ二次抗体を用いて）は、クロス標識の可能性がないことを確認してください</li><li>ピペットを用いて、二次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 </li><li>ピペットを使用して、最後のPBS洗浄を外し、Hoecのウェル当たり〜100μlの置き換え核を標識する：HST 33342（10mMのpH7.4のPBSで2000倍に希釈）。 3D回転体に室温で20分 - 15インキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 20分以上インキュベートしないでください。 </li><li>ピペットを用いて、ヘキスト溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 </li><li>必要に応じて、すべてのステップは、数時間、ヘキストインキュベーション以外は、拡張することができます。 2日後に-ちょうど10mMのPBS pH7.4のの〜500 ulの中のサンプルを沈め、プロトコル時間を再開する準備または1まで4°Cの時に48型ウェルプレート（またはチャンバースライド）を保存、いずれかの段階で反応を一時停止するには。 </li></ol> 7.マウント蝸牛は、スライドをオンにします<ol><li>ラベルは、使用した試料と抗体に関する適切な情報を摺動します。 </li><li>ピペット取り付けメディアの〜50μlの各スライドの上にと注意してください気泡を防止します。任意の気泡を除去するために取り付けたメディアを含むチューブを遠心。 </li><li> ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用して、ゆっくりと取り付けメディアにスライドし、場所に48ウェルプレートから1蝸牛ターンを転送するために、螺旋神経節の軸索を把握。マウントイメージングプロセス中に露光し、光退色を防止するために、スライドごとに1蝸牛ターン。 </li><li>蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確実にするために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、＃4を使用するか、＃5ストレート宝石商の鉗子は、蝸牛ターンを再配置します。 </li><li>スライド上のカバーガラスの一端を置き、静かにカバーガラスの落下させるために解放します。 </li><li>蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確認するために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、そっと蝸牛ターンを再配置するために、前後にカバースリップを移動します。 </li><li>場所スライドようにスライドフォルダにそれらが平らに横たわっていました。マウントしてみましょうメディア硬化O / RTでN（DARKておきます） </li><li> C O RTでマニキュアと店舗クリアまたは-20でシールしたカバー画像化まで。スライドは、スライドフォルダまたはスライドボックスに格納することができます。 注：スライドは、C O -20 O Cまたは -80で長期に保存することができ、蛍光は、数ヶ月のために維持されます。 </li><li>免疫染色の手順の間に使用される二次抗体に基づく適切な波長を有する共焦点顕微鏡を用いた画像スライド。明るさとコントラストの調整は、共焦点ベンダーによって提供イメージングソフトウェアを用いて行うことができます。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html>成功した全体のマウント解剖および免疫染色のためにいくつかの重要なステップがあります。これらの方法のいずれかが実行される前に、しかし、蝸牛組織の適切な固定が必要とされています。我々は、超純粋な遊離メタノール、EMグレードPFAを使用することをお勧めします。 PFAは、メタノールおよび免疫蛍光の品質を低下させる不安定なpH値の痕跡を持つことができる粉末から作られました。他のグループも同様の解剖ホルムアルデヒド14-16を含まない固定剤を使用して可能であることを示しました。固定の長さも重要であり、特異的な抗体です。他の人がPFAでわずか1時間（ただし、これは稀である）とうまく動作しませんがいくつかの抗体は、O / Nの固定を許容することができます。組織が崩壊してしまうよう下で固定した組織は、解剖法に問題がある可能性があります。我々の経験では3から4時間の固定が十分な固定を提供し、一般的に聴覚分野で使用される一次抗体の大半を妨げることはありません。 jove_contentは &quot;&gt;これは、EDTAは一次抗体に干渉する可能性もある。このようにいくつかの抗体は、新生児組織ではなく、P7または脱灰された古い組織でうまく動作します固定後、頭骨は前の時間の可変量のために保存することができますいくつかの抗原が固定後数日から数週間内の脱灰と解剖が必要です。他は（脱灰の前または後のいずれか）年間保管することができるが、抗原に応じて脱灰は、免疫染色の品質を低下させることなく、検査されている。我々は、側頭骨として保存サンプルをお勧めします原因菌や細菌と48ウェルプレートおよび潜在的な汚染からの記憶媒体（PBS）の蒸発のリスクに。私たちは通常、免疫染色に事前に全体のマウント解剖1週間以内実行します。 一度固定し、脱灰し、ホールマウント切開を液体に沈め頭骨を用いて行われます。過剰な骨とソフトの削除解剖の早い段階で迷路の周囲の組織は、組織の操作を容易にし、重要な構造の少ない隠れたビューを提供して、後の段階でスパイラル靭帯/側壁の除去に役立ちます。最初のいくつかのステップを実行する場合、鉗子は前庭領域における組織を保持するために使用することができます。しかしターンが隔離されると、それはコルチまたはスパイラル靭帯/側壁の臓器に鉗子を配置しないようにすることが重要です。代わりに、鉗子を閉じておくと、シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿にらせん神経節神経線維ピン。組織が裂けるように、この領域に保持しないでください。一般的には、一度組織が把握し、3ターンに分割されていると引っ張っ演習は、多くの場合、コルチ器官に損傷を与えると、回避する必要があり、予期しない結果を引き起こす可能性があります。若い動物（P7-P21）からの組織はP21より古い動物からの組織よりもより寛容になる傾向があります。有毛細胞dで加えて、蝸牛サンプルamageは解剖するのがより困難です。マウスは騒音曝露を受けた場合、組織は特に脆弱です。かかわらず、組織の状態の、我々が提示解剖は、技術的に厳しいですし、習熟のための多くの練習試行を必要とします。 免疫染色の間、各蝸牛ターンが上に浮いていない、液体中に浸漬またはウェルの側面に貼り付けられていることが重要です。これは、組織へのトリトンおよび抗体のより完全な浸透を可能にします。各ウェルから液体を除去する際には、蝸牛のターンを失うか、ピペットチップにそれを描くことは容易です。解剖スコープを使用して、200μlのピペットチップでソリューションを変更すると、これを防ぐことができます。ゆっくりと液体を抽出し、蝸牛ターンが近づきすぎた場合にピペットの先端を移動します。また、きれいなチューブに廃液をpipettetingする順番が誤ってピペット内に引き上げられた場合、この廃液チューブを検索することができるように良い戦略であることができます。ターンは、ピペットチップで立ち往生している場合は、トン彼は先端がかみそりの刃で切り開いすることができますが、これが発生した場合、多くの場合、コルチ器官が損傷します。 トラブルシューティングのための免疫染色抗体を、このような抗原回復または信号強調などの追加のステップを追加することができます。低pHおよび高pHの抗原購入することができますアンマスキング試薬があります。抗体は、ここで説明した方法では動作しない場合は、しようとする最初のプロトコルの変更は、これらの抗原回復法の一つです。また、シグナルエンハンサーを使用しています。二次抗体からのシグナルを増幅するために使用することができる免疫染色の前に、またはチラミド増幅キットを使用するための商業的に入手可能な解決策があります。 我々は、本技術の重要性は、コルチ器官の三次元構造を維持し、臓器内のすべての細胞を可視化する能力です。蝸牛の全体の長さはわずか3ターンに分離される他の同様の技術、すなわち第一方免疫染色およびイメージングプロセスで操縦するサンプル数を増やす、10個6-8 -電子Bohneとリーベルマンの方法は、5への分割を必要とします。コスグローブとGrattonによって開発された蝸牛側壁の解剖は、スキルの同様のレベルを必要とし、脱灰組織内だけでなく、固定されていない、新鮮な組織で可能であるが、コルチ器官を単離する過程で剥離し、破棄され側壁17。別のグループは、無傷の臓器を残し、スパイラル靭帯/側壁を把握し、離れコルチ器官から取り除かれた3週齢のラットからの未定着、新鮮な蝸牛組織で同様の解剖を行いました。しかし、これは、頂端5順番で達成されました。離れコルチ器官からスパイラル靭帯/側壁を剥離する方法は、若いマウス（&lt;P7）13で固定された組織の解剖のためのルーチンです。しかし、固定AN後のマウスP6よりも古い、と私たちの経験ではD脱灰は、この演習では、多くの場合、信頼できないやり方でコルチ器官を涙。また、ここで説明する手順は、中間および基底の単離は、同様になりますことができます。 パラフィン包埋した後に得られる凍結切片と切片は、一般に、聴覚分野で使用されています。これらの方法は、血管条、ライスナーの膜、および被蓋膜として他の構造の可視化を可能に、まだ各セクションでは、各蝸牛順番にコルチ器官の小領域の可視化を可能にします。従って切片法により、かかる細胞の損失または細胞分裂などのモザイクパターンで発生するイベントを調査するために、50以上のスライドを染色し、蝸牛の全体の長さをキャプチャするために画像化される必要があります。これとは対照的に、全体のマウント解剖プロトコルは、わずか3バラバラにコルチ器官全体を準備するという利点があります。コルチ器官の長手アーキテクチャを維持することの利点に加えて、このTEChniqueを簡素化するデータの収集と保存を可能にします。全体マウント解剖の1つの制限は、そのようなスパイラル靭帯、血管条、ライスナーの膜、および被蓋膜などの周囲の構造を破壊することです。別の制限は、単一の切開のための技術的な難しさと時間の長さです。スパイラル靭帯/側壁を削除するときにこれは、エラーのためにコルチ器官と小さなマージンの脆弱性のために主にあります。 30分 - 一度習得一蝸牛全体マウント切開は、約20で行うことができます。 上記のプロトコルは、成体マウスのための全体のマウント解剖方法が記載されているが、我々は聴覚分野で使用される他のモデル生物にこの手法を適用したいと考えています。私たちの研究室では、現在、ラットの蝸牛の解剖のためにこの技術を変更しています。ラットの大きな蝸牛は、より密に石灰化マウスよりも厚い耳のカプセルに包まれています。したがって、側頭骨には、電子である必要があります大きなはさみでxcised。 EDTAで固定し、脱灰する前に、耳のカプセルは、蝸牛組織へのより良いアクセスを許可するようにハサミで開かれるべきです。また、脱灰工程が長くなり、サンプルの年齢に応じて3週間ほどかかる場合があります。全体のマウント解剖のために、骨迷路の大きさは、技術に影響を与えます。ラット蝸牛のサイズの増加は、個々のカットのためにエラーの大きなマージンを提供し、スパイラル靭帯/側壁とコルチ器官の間にわずかに大きい距離を提供します。しかし、より大きな組織試料の操作のために把握するより多くの材料を提供することができる一方で、それはまた、らせん靭帯/側壁の全長を除去するために、カットのより多くを必要とします。我々は、類似の修正がチンチラ、スナネズミ、およびモルモットの蝸牛の解剖のために作ることができると信じています。

側頭骨内に含まれている内耳の螺旋状の蝸牛は、コルティ、哺乳類における聴覚感覚終末器官の器官を収容します。蝸牛はtonotopically編成、一般頂端、中間に分割され、基礎ベースの高周波音検出と頂点1における低周波検出に異なる周波数領域に対応するオン。れます有毛細胞、コルチ器官の機械刺激細胞は、マウス2,3で約6mmの長さである蝸牛の長さを実行します。これらの細胞は、中枢聴覚構造によって処理された神経信号に、液体で満たされた膜迷路を介して送信された音波の機械的エネルギーを変換します。ここに記載された技術は、蝸牛の石灰化は、（1週齢から成人期までのサンプルのため）が完了した後にコルチ器官の全体のマウントを製造する方法を提供します。また、immunostaための方法を提示全体ining蝸牛組織を搭載しています。蝸牛全体のマウントは、その自然の空間配置内のすべての有毛細胞と周囲の支持細胞の可視化のために重要であると共焦点顕微鏡を用いた三次元で分析が可能。 博士。ハンス・エングストロームハーローアデスは、もともと彼らは急速に顕微鏡分析4のためにコルチ器官の短い無傷のセグメントを維持し、固定し、哺乳類の様々な液体に浸さ石灰化蝸牛を分析する手法を詳述し1966年に全体のマウント蝸牛切開法を説明しました。未固定、石灰化したラットの蝸牛の解剖も教育ビデオ5に示されています。博士。バーバラBohneとワシントン大学のゲーリー・ハーディングは、この方法にはいくつかの重要な修正を行いました。蝸牛全体のマウント方法の彼らのバージョンでは、側頭骨は、脱灰したプラスチックに埋め込まれ、5ハーフターンまたは10四半期ターンはdissecましたテッド6,7。プラスチック埋め込 ​​みが8を必要としていなかったように、イートンピーボディ研究所、マサチューセッツ州アイ、耳診療所での博士チャールズ・リーベルマンらは、この手法を変更しました。技術のさらなる変更はここに提示解剖法を知らさセントジュード小児研究病院9-12博士建祚の研究室で発生しました。我々は完全な頂端、中間、基底ターンの単離を可能にするBohneとリーベルマンよりコルチ器官へのアクセスを得るために異なる戦略を使用しています。したがって、解剖組織が大きく、解剖や免疫染色工程中に紛失または破損しにくくなります。さらに、現在の方法は、周波数領域を特定するために先端チップ部または基底フックとの距離の測定を容易にします。 多くのラボでは蝸牛組織の免疫染色を行うが、この方法は、元の場所、それは不明です。その結果、ブフェを遮断するための様々なレシピがあります個々の一次抗体の性能に影響を与える可能性のRSおよび抗体インキュベーションバッファー。ここでは、聴覚分野において最も一般的に使用される抗体に適用することができる蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための1つの方法を提示します。 蝸牛の複雑な形状、コルチ器官の繊細な構造、および骨の箱詰めは、組織学的および生化学分析のための課題を提供しています。種々の技術は、現在、これらの困難な特徴を克服し、それ自身の利点と欠点を有するコルチ、各技術の臓器内の細胞を可視化するために聴覚分野で使用されています。ここに提示されたプロトコルは、全体の成体マウス蝸牛の解剖マウントを可能にし、わずかな修正を加えて、潜在的な分野で使用される他のモデル生物の様々な蝸牛内の重要な構造を調べるために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Standard&amp;nbsp; pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>10.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>2 ml microcentrifuge tubes</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>end-over-end tube rotator</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>60 mm petri dish</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>activated charcoal</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>stereo dissection microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dumont #4 jeweler&#039;s forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 jeweler&#039;s forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>curved&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>straight</td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>BSA, fraction V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>3D rotator</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Western blot incubation box XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mounting media</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>coverslips 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>clear nail polish</td><td>Local drug store</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>cardboard slide folder</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr></tbody></table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

我々は、開発の出生後第1週の間に。の石灰化を図1に示すキー解剖の手順で、石灰化である蝸牛組織から3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）とコルチ器官を単離するための方法を提示マウス蝸牛は不完全であり、より簡単な切開方法13を使用することができます。新生児全体を使用すると、P7から蝸牛と涙とコルチ器官の細断の高齢マウスの結果と解剖法をマウントします。スパイラル靭帯/側壁は今より強固に結合しており、ダメージを与えることなく、離れ感覚上皮から剥離することはできません。このように「大人」全体マウント解剖方法は、P6より古いサンプルのために必要とされます。我々は解剖し、有毛細胞と支持細胞のマーカー（ 図2）を用いて免疫染色されたP15マウス蝸牛のミドルターンの例を提示します。光クロスセクションCまた、全体のマウント技術（ 図3）で得られたこと。 いくつかの問題が全体のマウント解剖中に発生または蝸牛をマウントするときには、スライドをオンにすることができます。スパイラル靭帯/側壁の除去時には、あまりまたは十分ではないの切断との間の狭い窓があります。外有毛細胞の最後の行に次の発生カットは、この最後の行にある有毛細胞は、様々な角度（ 図4A）でマウントすることがあります。大きすぎるカットは、コルチ（ 図4B）の器官のセクションを削除することができます。ピンセットでサンプルの取り扱いに細心の注意を取り、多くの場合、鉗子が置き忘れたコルチ器官（ 図4C）の穴があります。蝸牛ターンをマウントするときに最後に、コルチ器官は、画像（ 図4D）を不明瞭にする折り畳むことができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53561/53561fig1.jpg" /> 図プロトコルステップ5.1.4の後に「大人」のホールマウント解剖マウス蝸牛。（A）1.重要なステップは 、蝸牛の基底回転は、中間/頂端ターンから分離し、それでも前庭領域に結合されます。スパイラル靭帯/側壁が削除された中央のターンの完成解剖のプロトコルステップ5.3.3、ミドルターンが頂回転から分離されている。（C）は、実施例の後（B）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53561/53561fig1large.jpg" target="_blank">拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53561/53561fig2.jpg" /> 中央の図2.共焦点スライス画像P15マウスから分離された電源を入れます。四20X画像は全体ミドルターンを再構築するために重ねられます。 （1,000倍希釈）（マゼンタ）、ロバ抗ウサギアレクサ488結合二次抗体と組み合わせた（200倍希釈）、有毛細胞を一次抗体VIIa因子ウサギ抗ミオシンで標識されます。 （：1,000希釈1）（緑）ロバ抗ヤギアレクサ568結合二次抗体と結合し（1：500希釈）支持細胞を、ヤギ抗Sox2の一次抗体で標識されています。ヘキスト（青）は、すべての核を標識します。画像は405、488、および555の波長のツァイスLSM 700共焦点顕微鏡を用いて撮影されました。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53561/53561fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53561/53561fig3.jpg" /> 中央の図3.光クロスセクションでは、分離されたターン<html> 6週齢のマウスから。 （A）のトップパネルの製剤全体（下）とXZ平面（上）の光の断面をマウントします。（B）の増加倍率（A）共焦点スライス画像、十字線は削除で。 （1,000倍希釈）（マゼンタ）、ロバ抗ウサギアレクサ647結合二次抗体と組み合わせた（200倍希釈）、有毛細胞を一次抗体VIIa因子ウサギ抗ミオシンで標識されます。 （：1,000希釈1）（緑）ロバ抗ヤギアレクサ568結合二次抗体と結合し（1：500希釈）支持細胞を、ヤギ抗Sox2の一次抗体で標識されています。画像は405、555、および647の波長のツァイスLSM 700共焦点顕微鏡を用いて撮影されました。スケールバー=20μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53561/53561fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg &quot;/&gt; マウント蝸牛はスライドをオンにし、図4ホールマウント解剖時に発生する可能性のある問題の例や。画像の左側（A）は 、蝸牛組織の多くを引き起こして次の外有毛細胞の最後の行にカットし、様々な角度で装着されるこれらの細胞（B）画像の左側にコルチ器官の部分が切断されている。（C）の中央に外有毛細胞領域にパンチ穴があります画像は、（D）、コルチ器官は、いくつかの場所に折り畳まれます。 8週齢のマウス蝸牛 - 画像は4から採取しました。有毛細胞は、一次抗体VIIa因子ウサギ抗ミオシンで標識され（1：200希釈）、ヤギ抗ウサギアレクサ488と組み合わせた結合二次抗体（1：1,000希釈）またはロバ抗ウサギアレクサ488結合二次抗体（1：1,000希釈）（マゼンタ）。 C外有毛セル画で（1,000希釈1）（緑）、ロバ抗ウサギアレクサ568結合二次抗体と組み合わせた（200倍希釈）LSはヤギ抗プレスチン一次抗体で標識されます。画像は、405と488、および555 nmの波長をライカSP5共焦点顕微鏡を用いて撮影しました。スケールバー：ABで= 20ミクロン; CDに= 40ミクロン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53561/53561fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

54.9K ビュー.  Southern Illinois University, School of Medicine. 私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。 

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Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

神経科学

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデル システム

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

発生生物学

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

医学

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The most common method for detecting the loss of ribbon synapses is immunolabeling because it allows for quantitative sampling from several tonotopic locations in an individual cochlea. However, the structures of interest are buried deep inside the bony cochlea. Gerbils are used as an animal model for age-related hearing loss. Here, routine protocols for fixation, immunolabeling gerbil cochlear whole mounts, confocal imaging, and quantifying ribbon synapse numbers and volumes are described. Furthermore, the particular challenges associated with obtaining good material from valuable aging individuals are highlighted. 
Gerbils are euthanized and either perfused cardiovascularly, or their tympanic bullae are carefully dissected out of the skull. The cochleae are opened at the apex and base and directly transferred to the fixative. Irrespective of the initial method, the cochleae are postfixed and subsequently decalcified. The tissue is then labeled with primary antibodies against pre- and postsynaptic structures and hair cells. Next, the cochleae are incubated with secondary fluorescence-tagged antibodies that are specific against their respective primary ones. The cochleae of aged gerbils are then treated with an autofluorescence quencher to reduce the typically substantial background fluorescence of older animals' tissues. 
Finally, cochleae are dissected into 6-11 segments. The entire cochlear length is reconstructed such that specific cochlear locations can be reliably determined between individuals. Confocal image stacks, acquired sequentially, help visualize hair cells and synapses at the chosen locations. The confocal stacks are deconvolved, and the synapses are either counted manually using ImageJ, or more extensive quantification of synaptic structures is carried out with image analysis procedures custom-written in Matlab.

A protocol for processing young adult and aged gerbil cochleae by immunolabeling the afferent synaptic structures and hair cells, quenching autofluorescence in aged tissue, dissecting and estimating the length of the cochleae, and quantifying the synapses in image stacks obtained with confocal imaging is presented.

若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly understand the mechanism of NIHL, and subsequently optimize the corresponding treatment strategies. This study aims to create an improved protocol for developing a mouse model of NIHL. Male C57BL/6J mice were used in this study. Unanesthetized mice were exposed to loud noises (1 and 6 kHz, presented simultaneously at 115-125 dB SPL-A) continuously for 6 h per day for 5 consecutive days. Auditory function was assessed 1 day and 1 week after noise exposure, using auditory brainstem response (ABR). After the ABR measurement, the mice were sacrificed, and their organs of Corti were collected for immunofluorescence staining. From the auditory brainstem response (ABR) measurements, significant hearing loss was observed 1 day after noise exposure. After 1 week, the hearing thresholds of the experimental mice decreased to ~80 dB SPL, which was still a significantly higher level than the control mice (~40 dB SPL). From the results of immunofluorescence imaging, outer hair cells (OHCs) were shown to be damaged. In summary, we created a model of NIHL using male C57BL/6J mice. A new and simple device for generating and delivering pure-tone noise was developed and then employed. Quantitative measurements of hearing thresholds and morphological confirmation of OHC damage both demonstrated that the applied noise successfully induced an expected hearing loss.

Here, we present a protocol for a mouse model of noise-induced hearing loss (NIHL). To induce NIHL, we developed a new and simple device using corrugated plastic, a rat trap cage, and a speaker. Auditory brainstem response and immunofluorescence imaging were employed to assess the hearing function and outer hair cell damage, respectively.

マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

要約

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この動画の章

ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデルシステム

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数

ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

要約

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ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデル システム

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数

ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデルシステム