This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Tıp Southern Illinois University School Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Temporal Bones 1. Ekstraksiyon <ol><li> Fare kafatası 13 tabanındaki zamansal kemikler tespit ve standart model forseps kullanılarak kranial sinirler kazınması. </li><li> Kapsüllü koklea çıkarmak için otik kapsül ucunda aşağı posteriyor semisirküler kanal üzerinde ters elle basının başparmak ile standart model forseps yerleştirin. </li><li> El başparmak ve işaret parmağı ile ya da 10.5 cm ince makas kullanarak kafatası temporal kemiğin alt yarısı boşaltın. </li></ol> 2. Geçici Bones Post-fix <ol><li> 10 mM fosfat tamponlanmış tuzlu su içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) pH 7.4 ile inkubasyondan - 250 ihtiva eden 2 ml mikrosantrifüj tüpleri içine zamansal kemikler yerleştirin20 saat - 2 RT&#39;de yedik. NOT: yuvarlak veya oval pencereye PFA apikal kap veya enjeksiyon Hiçbir açılması gereklidir. Cam şişe içinde% 16 konsantrasyonda satın alınabilir metanol ücretsiz, ultra saf, elektron mikroskobu (EM) notu PFA kullanmanızı öneririz. Bir şişe açıldı ve 1 seyreltilmiş sonra:% 4 çözelti haline PBS 4 (Bazı antikorlar tolere edebilir kısa tespiti ve diğerleri gerektiren 4 o C&#39;de saklandığında, o kadar 2 hafta boyunca kullanılabilecek O / N (O / N) tespit). </li></ol> 3. decalcify Temporal Bones <ol><li> Tespit edildikten sonra, bir pipet kullanılarak, PFA çıkarın ve 120 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), biraz daha fazla 2 ml ile değiştirin. Tüp kapalı olduğunda hava kabarcıkları önlemek için tüm 2 ml&#39;lik ependorf tüp doldurmak için emin olun. <ol><li> Hemen dekalsifiye Eğer değilse, o 4 ° C&#39;de 10 mM PBS, pH 7,4 ve mağaza örnekleri ile PFA yerine Not: Tespit edildikten sonra, temporal kemik variab saklanabilirle antijenleri bağlı dekalsifikasyon incelenmeden önce zaman tutarındadır. </li></ol></li><li> Uçtan aşırı uca rotator yerleştirin tüpler ve RT&#39;de 4 rpm&#39;de döndürün. Bir pipet kullanarak günlük EDTA çözeltisi değiştirin. Dekalsifikasyon uzunluğu numunesinin yaş ve diseksiyon yaparak bilim adamı tercihine bağlıdır. <ol><li> Inkübasyon sürelerinde aşağıdaki yönergeleri kullanarak EDTA temporal kemikler inkübe: 8 P15 numunelerin doğum sonrası gün (P): 2-4 saat; P21 için numuneler P15 için: O / N; P30 örnekleri P21 için: 2 O / N; 3 ya da daha fazla, O / N: P30 daha büyük numuneler için. NOT: Decalcification süreleri kullanıcıların tercihine tabidir ve gerektiği gibi uzatılabilir. Decalcification süresi yaklaşık 8 saat arayla, günde iki kez EDTA çözeltisi değiştirerek düşürülebilir. Bulaşmasını önlemek için daha uzun bir süre için 3 gün dekalsifiye Bazı laboratuarlar EDTA solüsyonuna% 1 PFA ekleyin. </li></ol></li><li> Numune yeterince dekalsifiye ise o zamansal kemikler koyun belirlemek içinna silikon diseksiyonu çanak elastomer kaplamalı ve yavaşça salyangoz şeklindeki koklea üzerine forseps basın. Doku süngerimsi ise, yumuşatma işlemi tamamlanır. </li><li> Yumuşatma işlemi tamamlandıktan sonra, bir pipet kullanılarak EDTA çıkarın ve 10 mM PBS pH 7.4, 500 -1000 ul ekle. Kadar hazır 4 o C&#39;de saklayın örnekleri incelemek için. </li></ol> 4. Silikon Elastomer kaplı Diseksiyon Dish oluştur <ol><li> Taban ve üreticinin talimatlarına göre bir silikon elastomer kapsülleyici kitinin sertleştiriciyi birleştirin ve iyice karıştırın. </li><li> Çözüm siyah olana kadar toz kömür 3 yemek kaşığı ve iyice karıştırın - yaklaşık 2 ekleyin. NOT: Sıvı mürekkep veya sıvı kömür solüsyonu ile karıştırmak olmaz ve kullanılamaz. Silikon elastomer enkapsülant kitleri adım 4.2 atlanabilir sağlayan siyah satın alınabilir. </li><li> Kaplamak için yeterli alt doldurma 60 mm cam veya plastik petri kaplarının içine solüsyonu dökülür. Bu takdirdebbles, mevcut yüzey üzerinde hava ile puf. Ayarlamak için oda sıcaklığında en az 24 saat bekletilir. Not: Silikon elastomer kaplı tabaklar yıl tekrar tekrar kullanılabilir. Bu silikon elastomer çatlamasına neden olur Ancak, temizlik için etanol kullanmayın. </li></ol> (P7 ve Yaşlı Örnekleri için) Kohlea 5. Tüm Dağı Diseksiyon <ol><li> Orta / apikal döner bazal dönüş ayırın <ol><li> 10 mM PBS pH 7.4 ile üçte ikisi dolu dolu bir silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak bir dekalsifiye zamansal kemik yerleştirin ve aşağıdaki adımlar için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. </li><li> 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ve 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanılarak vestibüler bölgede zamansal kemiği tutun, kenarları boyunca ve apeks yukarıda aşırı otik kapsül doku kesip. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, oval pencere içine bir bıçak takın ve spiral ligament / yanal boyunca birkaç küçük kesikler yapmakBazal dönüş duvarı. </li><li> 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve temporal kemik dışında diğer bıçağı yerleştirin oval pencereye medial. Bu kesim, orta ve apikal döner gelen bazal dönüş ayırır. </li></ol></li><li> Bazal dönüş tam diseksiyonu. <ol><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, bazal sırayla gerginliği ve vestibüler organların ayrılması bazal dönüş kesim için modiolus bağlanmak spiral ganglion sinir liflerini kesti. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, Corti organı yukarıda ve aşağıda hem spiral ligament / lateral duvar kaldırmak için küçük kesikler bir dizi yapmak. Doku rehberlik 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanın. Silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak spiral ganglion sinir liflerini Pin, ancak doku gözyaşı gibi bu bölgede tutunmaya yok. </li><li> Önceki adımlarda, Reissner en membranın bazı sırasındae sık sık silinecektir. Herhangi hala kalırsa, 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ile Reissner en zarı kavramak ve Corti organı uzak çekin. NOT: örtü oluşturan zar nadiren görülür ve genellikle kaldırılması için özel bir adım gerektirmeden uzak yüzer. </li><li> Sonunda için, mümkün olduğunca düz dönüş yapmak ve spiral ganglion kalan aksonlar tutarak, disseke bazal dönüşü aktarmak için 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanmak için, spiral ganglion akson kalınlığını azaltmak için çeşitli kesimler yapmak Bir 48-yuvalı plaka (veya odacık slayt) 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul ihtiva etmektedir. </li></ol></li><li> Ayrı orta ve apikal dönüşler <ol><li> Koklea, aşağı apikal tarafında kalan üçte ikisini yerleştirin. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, kullanılan orta dönüş bazal dönüş bağlanacak scala ortamı içine bir bıçak yerleştirin ve th spiral ligament / yan duvar boyunca birkaç küçük kesikler yapmake orta dönüş. </li><li> 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece bıçağın üstüne yerleştirilir orta çevirmek ile kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve apikal ucundan 90 o açıyla, kemikli labirent dışında diğer bıçağı yerleştirin. Bu tepe dönüş gelen orta dönüş ayırır. </li></ol></li><li> Bazal da benzer bir şekilde, orta dönüş tam diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız). </li><li> Apikal dönüş tam diseksiyonu. <ol><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, apikal dönüş kapsayan kapağı açın. Bazal da benzer bir şekilde komple diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız). Not: Dissected koklear döner immün önce birkaç hafta içinde 4 o C&#39;de 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) içinde 10 mM PBS, pH 7.4 içinde saklanabilir. Üzerine bakteriyel veya mantar büyümesi neden olabilir 3 hafta - Ancak PBS uzun 2&#39;den buharlaşması ve periyodik olarak doldurulan gerekiyor ve depolama olacakgörüntünün kalitesini düşürebilir doku. Biz undissected temporal kemik olarak numunelerin uzun vadeli depolama öneririz. </li></ol></li></ol> Floresan Tagged Antikorlar 6. immün <ol><li> Diseksiyon sonra, 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul batırılmış bir 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) ayrı bir kuyunun her koklear dönüş depolar. Aşağıdaki adımlardan her biri için koklear dönüş, sıvı batık gereken üstte yüzen değil ya da kuyunun yanına yapışmış. NOT: her bir sıvının sökerken, bu koklear dönüşler kaybetmek ya da pipet o kadar emmek için kolaydır. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak 200 ul pipet ile çözümler Değişen bu önlemeye yardımcı olur. </li><li> Bir pipet kullanarak, her bir oyuğa PBS çıkarıp yerine ~ 200 - / bloke permeabilizasyon çözeltisi (oyuk başına 300 ul% 1 Triton X-100,% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS) 10 mM PBS içinde seyreltilmiş pH 7.4). 3B rotator oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Not: kullanılan herhangi bir birincil antikor, bir keçi konukçuda yapılmış ise, o zaman ikinci bir anti-keçi antikoru gerekli olacak ve NGS herhangi bir aşaması için kullanılmamalıdır gerekir. Normal at serumu NGS için bir yedek olarak kullanılabilir. </li><li> Bir pipet kullanılarak bloke / geçirimli hale çözeltisini çıkarın ve primer antikor çözeltisi, oyuk başına 100 ul ~ ile değiştirin (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). Her primer antikor için sulandırma faktörü değişir. 3D döndürücüde 4 o C&#39;de O / N (en az 14 saat) inkübe edin. Not: birden çok birincil antikoru kullanıldığında, tüm sadece her birincil antikor farklı ev sahibi olduğundan emin olun, inkübasyon için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. </li><li> Bir pipet kullanılarak birincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. Her bir yıkama 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum kuluçkaya. </li><li> Geçen P kaldırBS, bir pipet kullanılarak ve ikincil antikor çözeltisinin oyuk başına 100 ul ile ul yerine yıkama (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). 500 ya da 1: 1000 her biri için sulandırma faktörü floresan ikincil antikor, genellikle 1 olan etiketli. Floresan ışıktan korumak sekonder antikorlar etiketli bir kara kutu 48-plaka koyun. 3B rotator oda sıcaklığında 3 saat - 2 inkübe edin. Not: birden fazla ikincil antikor ihtiyaç varsa, inkubasyondan için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. Çapraz etiketleme imkanı yoktur emin olun (örn., Keçi anti-tavşan ve tavuk anti-keçi ikincil antikorlar kullanarak) </li><li> Bir pipet kullanılarak ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. </li><li> Bir pipet kullanarak son PBS yıkama çıkarın ve Hoec oyuk başına ~ 100 ul ile değiştirinçekirdekleri etiketlemek için: hst 33.342 (10 mM PBS pH 7.4 2,000 1 seyreltilmiş). 3B rotator oda sıcaklığında 20 dakika - 15 inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. Uzun 20 dakika inkübe yapmayın. </li><li> Bir pipet kullanılarak Hoechst çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. </li><li> Gerekirse tüm adımlar birkaç saat, Hoechst inkübasyon hariç uzatılabilir. Herhangi bir aşamada reaksiyonu durdurmak için, sadece 10 mM PBS pH 7.4 ~ 500 ul örnekleri batırmayın ve protokol saat veya 1 sürdürmek için hazır olana kadar 4 o C&#39;de 48 eh plaka (veya bölme slayt) saklamak - 2 gün sonra . </li></ol> 7. Dağı Koklear slaytlar açar <ol><li> Etiket kullanılan örnek ve antikorlar konusunda ilgili bilgiler slaytlar. </li><li> Pipet montaj medya ~ 50 ul her slayt üzerine ve dikkatli olmakkabarcıklarını engellemek için. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için montaj ortamı içeren tüp santrifüj. </li><li> 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanarak, hafifçe montaj medyada slayt ve yere 48 plaka itibaren bir koklear dönüş transfer spiral ganglion aksonları kavramak. Slayt başına Dağı tek koklear dönüş görüntüleme işlemi sırasında ışığa maruz ve photobleaching önlemek için. </li><li> Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, kullanım # 4 ya da 5. düz kuyumcu forseps koklear dönüş yeniden konumlandırmak için. </li><li> Slayt üzerinde bir lamel bir ucunu yerleştirin ve yavaşça lamel düşmesine izin için bırakın. </li><li> Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, yavaşça koklear dönüş yeniden konumlandırmak için ileri ve geri lamel hareket ettirin. </li><li> Yer slaytlarböylece bir slayt klasörüne onlar düz koymak. Montaj edelim medya kür O / oda sıcaklığında N (DARK tutmak) </li><li> Net oje ve mağaza oda sıcaklığında veya -20 o C Seal lamelleri kadar görüntülenmiş. Slaytlar slayt klasör veya slayt kutusunda saklanabilir. NOT: Slaytlar -20 o C veya -80 o C ve floresan uzun süreli saklanabilir birkaç ay için muhafaza edilecektir. </li><li> Immün işlemi sırasında kullanılan ikincil antikorlar göre uygun dalga boyunda bir konfokal mikroskop kullanılarak Görüntü slaytlar. Parlaklık ve kontrast ayarı konfokal satıcı tarafından sunulan görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li>
<li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li>
<li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+damage+in+the+C57BL%2FCBA+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li>
<li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstrom%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti.+A+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist and Wiksell. (1966).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells%3A+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442(2011).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+BA+%22Handbook+of+Mouse+Auditory+Research%22">Handbook of Mouse Auditory Research</a>. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).</li>
<li>Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/">http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/</a> (2015).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li>
<li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters%27+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth%2C+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li>
<li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Başarılı tüm montaj diseksiyonu ve immün için birkaç kritik adımlar vardır. Bu yöntemlerden birini gerçekleştirilir Ancak önce, koklear dokusunun uygun sabitleme gereklidir. Biz metanol, ücretsiz, ultra saf, EM dereceli PFA kullanmanızı öneririz. PFA metanol ve immünofloresan kalitesini düşüren dengesiz bir pH izlerini olabilir toz yaptı. Diğer gruplar, benzer diseksiyon formaldehit 14-16 içermeyen kullanılarak mümkün olan sabitleyiciler olduğunu göstermiştir. Sabitleme uzu...

Temporal kemik içinde yer alan iç kulağın spiral şekilli koklea, Corti, memelilerde işitsel duyu uç organ organı ev sahipliği yapmaktadır. Koklea tonotopically düzenlenen ve yaygın olarak apikal ortadan ayrılır ve bazal tepesi 1 taban ve düşük frekans tespiti yüksek frekanslı ses algılama ile farklı frekans bölgelerine tekabül eden döner bir. Saç hücreleri, Corti organı mechanosensory hücreleri, farelerin 2,3 yaklaşık 6 mm uzunluğunda koklea, uzunluğu çalıştırın. Bu hücreler, merkezi işitsel yapıları tarafından işlenen sinirsel sinyalleri içine, sıvı dolu Membranöz labirent aracılığıyla iletilen ses dalgalarının, mekanik enerjiyi dönüştürmek. Burada anlatılan teknik, (yaş bir hafta yetişkinliğe kadar numuneler için) koklea kalsifikasyonu sonra Corti organı tüm bağlar hazırlanması için bir yöntem, tamamlandığında içerir. Ayrıca immunosta için bir yöntem mevcutbütün ining koklear doku monte edilebilir. Koklear bütün bağlar tüm saç hücrelerinin görselleştirme ve doğal uzamsal düzenlemeler destekleyici hücrelerin çevredeki için çok önemlidir ve konfokal mikroskopi kullanılarak üç boyutlu olarak analiz için izin. Dr. Hans Engstrom ve Harlow Ades aslında onlar hızla mikroskopik analiz 4 Corti organı kısa bozulmamış kesimleri koruyarak, düzeltmek ve memelilerin çeşitli sıvı batık kalsifiye cochleae incelemek için bir teknik detaylı 1966 yılında bir bütün montaj koklear diseksiyon yöntemi tarif. Bir sabitlenmemiş, kalsifiye sıçan Kokleanın diseksiyonu da bir öğretim video 5&#39;te gösterilen edilmiştir. Dr. Barbara Bohne ve Washington Üniversitesinde Gary Harding bu yönteme pek çok önemli değişiklikler yaptı. Koklear tüm montaj yönteminin kendi versiyonunda, temporal kemik, dekalsifiye oldu plastik gömülü ve beş yarım dönüşler veya on çeyrek dönüşler dissec edildited 6,7. O plastik gömme 8 gerekli değildi bu yüzden Dr. Charles Liberman ve Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Göz ve Kulak Infirmary&#39;de meslektaşları, bu tekniği modifiye. Tekniğin daha da modifikasyon Burada sunulan diseksiyon yöntemi haberdar St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi 9-12 Dr. Jian Zuo&#39;nun laboratuarında meydana geldi. Biz tam apikal, orta ve bazal dönüşler izolasyonuna izin veren Bohne ve Liberman daha Corti, organı erişmek için farklı bir strateji kullanın. Böylece disseke doku büyük ve diseksiyon veya immün işlemleri sırasında kayıp ya da hasar olasılığı daha azdır. Buna ek olarak, güncel yöntem apikal uç veya frekans bölgesini tanımlamak için bazal kanca mesafenin ölçülmesini kolaylaştırır. Birçok laboratuarları koklear dokusunun immün gerçekleştirin rağmen bu yöntem nereden geldiğini, bu belli değildir. Bunun sonucunda Buffe engellemek için çeşitli tarifler vardırrs ve bireysel birincil antikor performansını etkileyebilir antikor inkübasyon tamponları. Burada, işitsel alanda en yaygın olarak kullanılan antikorlar için de geçerlidir floresan isim levhası antikor ile immünboyama için bir yöntem sunulmaktadır. Koklea karmaşık şekli, Corti organı hassas yapısı ve kemik kapatma histolojik ve biyokimyasal analiz için bir meydan okuma sağlamak. Çeşitli teknikler şu anda bu zor özellikleri aşmak ve Corti, kendi avantajları ve dezavantajları ile her tekniğin organı içindeki hücreleri görselleştirmek için işitme alanında kullanılmaktadır. Burada sunulan protokol küçük bir değişiklikle, potansiyel olarak bu alanda kullanılan diğer model organizmaların çeşitli cochleae içindeki kritik yapılara incelemek için kullanılabilir, yetişkin fare koklea bütün montaj diseksiyon sağlar ve.

<table><tbody><tr><td>Standard&amp;nbsp; pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>10.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>2 ml microcentrifuge tubes</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>end-over-end tube rotator</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>60 mm petri dish</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>activated charcoal</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>stereo dissection microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dumont #4 jeweler&#039;s forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 jeweler&#039;s forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>curved&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>straight</td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>BSA, fraction V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>3D rotator</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Western blot incubation box XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mounting media</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>coverslips 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>clear nail polish</td><td>Local drug store</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>cardboard slide folder</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr></tbody></table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve tabanı) Şekil 1&#39;de sunulan anahtar diseksiyon adımlarla, kalsifiye olan koklear dokudan olarak Corti organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Gelişiminin ilk doğum sonrası haftasında, kalsifikasyon sırasında Fare koklea eksiktir ve daha basit bir diseksiyon yöntemi 13 kullanılabilir. Corti organı P7 gelen kokleadaki ve gözyaşları içinde eski fareler sonuçları ve parçalama ile neon...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea at JoVE.com

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası &#39;antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

55.4K Görüntüleme.  Southern Illinois University, School of Medicine.  Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar. 

Video: Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

Nörobilim

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Gelişim Biyolojisi

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Tıp

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The most common method for detecting the loss of ribbon synapses is immunolabeling because it allows for quantitative sampling from several tonotopic locations in an individual cochlea. However, the structures of interest are buried deep inside the bony cochlea. Gerbils are used as an animal model for age-related hearing loss. Here, routine protocols for fixation, immunolabeling gerbil cochlear whole mounts, confocal imaging, and quantifying ribbon synapse numbers and volumes are described. Furthermore, the particular challenges associated with obtaining good material from valuable aging individuals are highlighted. 
Gerbils are euthanized and either perfused cardiovascularly, or their tympanic bullae are carefully dissected out of the skull. The cochleae are opened at the apex and base and directly transferred to the fixative. Irrespective of the initial method, the cochleae are postfixed and subsequently decalcified. The tissue is then labeled with primary antibodies against pre- and postsynaptic structures and hair cells. Next, the cochleae are incubated with secondary fluorescence-tagged antibodies that are specific against their respective primary ones. The cochleae of aged gerbils are then treated with an autofluorescence quencher to reduce the typically substantial background fluorescence of older animals' tissues. 
Finally, cochleae are dissected into 6-11 segments. The entire cochlear length is reconstructed such that specific cochlear locations can be reliably determined between individuals. Confocal image stacks, acquired sequentially, help visualize hair cells and synapses at the chosen locations. The confocal stacks are deconvolved, and the synapses are either counted manually using ImageJ, or more extensive quantification of synaptic structures is carried out with image analysis procedures custom-written in Matlab.

A protocol for processing young adult and aged gerbil cochleae by immunolabeling the afferent synaptic structures and hair cells, quenching autofluorescence in aged tissue, dissecting and estimating the length of the cochleae, and quantifying the synapses in image stacks obtained with confocal imaging is presented.

Genç Yetişkin ve Yaşlı Gerbil Cochleae'de İmmünoetiketleme ve Şerit Sinapslarının Sayılması

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly understand the mechanism of NIHL, and subsequently optimize the corresponding treatment strategies. This study aims to create an improved protocol for developing a mouse model of NIHL. Male C57BL/6J mice were used in this study. Unanesthetized mice were exposed to loud noises (1 and 6 kHz, presented simultaneously at 115-125 dB SPL-A) continuously for 6 h per day for 5 consecutive days. Auditory function was assessed 1 day and 1 week after noise exposure, using auditory brainstem response (ABR). After the ABR measurement, the mice were sacrificed, and their organs of Corti were collected for immunofluorescence staining. From the auditory brainstem response (ABR) measurements, significant hearing loss was observed 1 day after noise exposure. After 1 week, the hearing thresholds of the experimental mice decreased to ~80 dB SPL, which was still a significantly higher level than the control mice (~40 dB SPL). From the results of immunofluorescence imaging, outer hair cells (OHCs) were shown to be damaged. In summary, we created a model of NIHL using male C57BL/6J mice. A new and simple device for generating and delivering pure-tone noise was developed and then employed. Quantitative measurements of hearing thresholds and morphological confirmation of OHC damage both demonstrated that the applied noise successfully induced an expected hearing loss.

Here, we present a protocol for a mouse model of noise-induced hearing loss (NIHL). To induce NIHL, we developed a new and simple device using corrugated plastic, a rat trap cage, and a speaker. Auditory brainstem response and immunofluorescence imaging were employed to assess the hearing function and outer hair cell damage, respectively.

Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...