騒音性難聴に関する研究はあるが、これほど詳細に記録したものはなく、重要な手技である。この方法は、マウスに騒音性難聴を効果的に引き起こし、ABRによる聴力閾値の実際の変化を観察します。騒音性難聴の動物モデルは、科学者が騒音性難聴のメカニズムを完全に理解し、その後、対応する治療戦略を最適化するのに役立ちます。
手順を実演するのは、私の研究室の非常に才能のある学生であるDian-Shiue Leeです。実験マウス用のケージを準備するには、ラットトラップケージを使用し、4枚の波形プラスチックボードを適切なサイズにカットして、ケージに収まるようにします。マウスがメッシュグリッドで足を切るのを防ぐために、2つのピースをそれぞれ底面と裏面に置きます。
他の2つのピースを互いに垂直に連動させて配置し、ケージ内のスペースを四分の一に分割します CLIOアプリケーションソフトウェアを開きます。カーソルをスピーカーアイコンに移動し、TwoSinをクリックします。周波数1を1, 000ヘルツ、周波数2を6, 000ヘルツの値を入力して変更し、[OK]をクリックしてサウンドの再生を開始します。
Leq タブで、dBV を dBSPL に変更します。ソフトウェアインターフェイスで時間を設定した後、緑色の三角形のボタンをクリックしてサウンドを再生します。スピーカーの前にマイクを8.5センチメートルの距離に置いて、ノイズレベルを調整します。
ノイズレベルを125デシベルSPL-Aに調整し、少なくとも3分間継続的に監視して、ノイズレベルが十分に安定していることを確認します。発生器、アナライザ、アンプを使用して、ノイズを生成および制御します。4匹の雄のC57ブラック6Jマウスを、騒音にさらされるために、各四半期に1つずつケージに入れます。
ノイズ曝露中にマウスを各四半期にランダムに割り当てます。ケージの上部にマイクを置き、騒音にさらされている間の騒音レベルを監視します。ケージをスピーカーの前に防音ボックス内に置き、スピーカーがケージから8.5センチメートル離れた位置にあることを確認します。
マウスを1キロヘルツと6キロヘルツの周波数で1日6時間、5日間連続してノイズにさらします。ABRを測定することにより、6日目および13日目のマウスの聴力閾値を測定する。 ABR測定用に小動物用に特別に設計された市販のABR検査システムを使用し、動物を全身麻酔下に維持します。
左耳介の背後、尾付近の頂点に12mmの皮下針電極を配置し、聴力閾値を測定した。スピーカーを動物の左耳から1センチ離した後、スピーカーを使用して音響刺激を提示します。刺激には正弦波を選択し、ウィンドウスケールには10kを選択します。
周波数ノブを回して、音響刺激の目的の周波数を取得します。ファンクションジェネレーターのAMLPノブを回して刺激強度を調整します。AMLPノブをキャリブレーションから計算された適切な電圧に回して、目的の刺激強度を取得します。
10デシベルステップサイズで、10〜100デシベルSPLの一連の刺激強度の下でABR測定値を収集します。識別可能な波Vを引き起こす可能性のある最小刺激強度レベルをABRしきい値としてマークします。ABR測定後にマウスを屠殺し、安楽死させたマウスから蝸牛を採取した。
組織を採取した直後に、固定のために10%ホルムアルデヒドに浸し、摂氏4度で少なくとも8時間休ませます。本文で説明されているように、脱灰にはEDTAを使用します。PBSで満たされたペトリ皿に蝸牛を置きます。
組織染色のために、コルティ(OC)のらせん状の器官を、基底ターン、中ターン、および頂端ターンの3つのセクションに切断します。8倍から35倍の倍率で解剖顕微鏡下で、脱灰した蝸牛のスカラ前庭、スカラティンパニ、モディオラスを含む骨構造を取り除き、OCを含む軟組織を取得します。騒音曝露の1日後に、12キロヘルツ、24キロヘルツ、および32キロヘルツで聴覚閾値の有意な増加が観察されました。部分的な聴力回復は騒音曝露の1週間後に起こったが、聴力閾値は対照群と比較してすべての周波数で30デシベル以上上昇した。
この研究では、聴覚は高周波でより損傷を受けました。6日目と13日目の両方で、対照群と実験群の間で12キロヘルツと32キロヘルツの聴力閾値に有意差が観察されました。NIHLマウスから取得した顕微鏡画像では、対照マウスと比較して、外有毛細胞の損失が一貫して観察されました。
すべての画像で内有毛細胞は無傷のままでしたが、OCの基底および中ターンの外有毛細胞は深刻な損傷を受けました。対照的に、頂端ターンの外有毛細胞はほとんど無傷でした。このプロトコルの最も重要なステップには、ノイズ曝露、ABI測定、蝸牛の収穫が含まれます。
この手順は、さまざまな種類の音を使用して、難聴に対するさまざまな周波数での騒音曝露の影響を調べるために適用できます。
