This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Escola de Medicina da Universidade de Southern Illinois. 1. Extração de ossos temporais <ol><li> Identificar ossos temporais na base do crânio do rato 13 e raspar os nervos cranianos, usando uma pinça padrão normal. </li><li> Coloque uma pinça padrão normal na ponta da cápsula ótica e com o polegar da mão oposta a imprensa para baixo no canal semicircular posterior para desalojar a cóclea encapsulado. </li><li> Liberte a metade inferior do osso temporal a partir do crânio manualmente com o polegar eo dedo indicador ou usando 10,5 cm tesoura fina. </li></ol> 2. Pós-fix temporais Bones <ol><li> Coloque ossos temporais em 2 ml de tubos de microcentrífuga contendo 250 - 500 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) diluído em solução salina tamponada com fosfato 10 mM (PBS) pH 7,4 e incubComeram à temperatura ambiente durante 2 - 20 horas. NOTA: Não é necessário qualquer abertura da tampa apical ou injeção de PFA para a rodada ou janela oval. Recomendamos o uso livre, ultra-pura, microscopia eletrônica (EM) grau metanol PFA que podem ser comprados em uma concentração de 16% em frascos de vidro. Uma vez que o frasco é aberto e diluído 1: 4 em PBS, fazer uma solução a 4%, ele pode ser usado por até 2 semanas, quando armazenadas a 4 ° C (Alguns anticorpos requerem curta fixação e outros podem tolerar S / N (O / N) Fixação). </li></ol> 3. descalcificação dos ossos temporais <ol><li> Após a fixação, remover PFA utilizando uma pipeta e substituir com 120 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), um pouco mais do que 2 ml. Certifique-se de preencher todo o tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar bolhas de ar quando o tubo é fechado. <ol><li> Se não descalcificação imediatamente, recoloque PFA com pH 7,4 e armazenar amostras de PBS 10 mM a 4 o C. NOTA: Após a fixação, os ossos temporais podem ser armazenadas para variable quantidades de tempo antes da descalcificação dependendo dos antigénios a ser examinado. </li></ol></li><li> Colocar os tubos no fim-over-end rotador e rodar a 4 rpm à temperatura ambiente. Alterar solução EDTA diariamente usando uma pipeta. Comprimento de descalcificação depende da idade da amostra e da preferência do cientista fazendo a dissecção. <ol><li> Incubar ossos temporais em EDTA usando as seguintes diretrizes para tempos de incubação: Para amostras de dia pós-natal (P) a 8 P15: 2 - 4 horas; Para amostras de P15 a P21: O / N; Para amostras de P21 a P30: 2 O / N; Para amostras mais velhas do que P30: 3 ou mais S / N. NOTA: Os tempos de descalcificação estão sujeitos a preferência dos usuários e pode ser estendido conforme necessário. A descalcificação tempo pode ser reduzida alterando a solução de EDTA a duas vezes por dia, cerca de 8 horas de intervalo. Alguns laboratórios adicionar 1% PFA para a solução de EDTA quando descalcificação por mais de 3 dias para evitar a contaminação. </li></ol></li><li> Para determinar se a amostra é adequadamente descalcificados, coloque o ossos temporaisna silício elastômero revestido dissecção prato e pressione suavemente fórceps na cóclea em forma de caracol. Se o tecido é spongey, em seguida, descalcificação é completa. </li><li> Uma vez descalcificação é completa, remover o EDTA usando uma pipeta e adicionar 500 ul -1.000 de PBS 10 mM pH 7,4. Armazene as amostras a 4 ° C até que esteja pronto para dissecar. </li></ol> 4. Criar Silicone Elastomer-revestido Dish Dissection <ol><li> Combinar a base e o agente de cura de um kit encapsulante elastómero de silicone de acordo com as instruções do fabricante e homogeneiza-se. </li><li> Adicionar cerca de 2 - 3 colheres de sopa de carvão em pó até que a solução é preto e misturar bem. NOTA: tinta líquida ou carvão vegetal líquido não se mistura com a solução e não pode ser utilizado. Kits de elastómero de silicone encapsulantes pode ser comprado em preto, permitindo que o passo 4.2 ser omitido. </li><li> Despeje a solução no 60 milímetros de vidro ou placas de Petri de plástico, enchendo o suficiente para cobrir o fundo. Se bubbles estão presentes, sopro de ar sobre a superfície. Deixar repousar pelo menos 24 horas à temperatura ambiente para ajustar. NOTA: pratos revestido de elastômero de silicone pode ser usado repetidamente por anos. No entanto, não usar álcool para limpeza, pois isso fará com que o elastômero de silicone de crack. </li></ol> 5. Monte todo Dissecção da cóclea (para P7 e amostras mais antigas) <ol><li> Separe o giro basal do giro médio / apical <ol><li> Coloque um osso temporal descalcificadas em um prato de dissecação elastómero de silicone com revestimento preenchido dois terços cheio com PBS 10 mM pH 7,4 e usar um microscópio de dissecção estéreo para as seguintes etapas. </li><li> Segure o osso temporal na região vestibular com # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta e com 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, corte o excesso de tecido cápsula ótica ao longo dos lados e acima do ápice. </li><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina para a janela oval e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral lateral /parede do giro basal. </li><li> Usando 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região apenas cortar e coloque a outra lâmina na parte externa do osso temporal, medial à janela oval. Este corte separa o giro basal de voltas médio e apical. </li></ol></li><li> Dissecção completa do giro basal. <ol><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, cortar as fibras nervosas do gânglio espiral que se conectam à modiolus para liberar a tensão no giro basal e corte abaixo do giro basal se separar de órgãos vestibulares. </li><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, fazer uma série de pequenos cortes para remover / parede lateral do ligamento espiral de ambos acima e abaixo do órgão de Corti. Use # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para orientar o tecido. Pin as fibras nervosas do gânglio espiral ao silicone revestido com elastômero dissecção prato, mas não agarrar esta região como o tecido vai rasgar. </li><li> Durante os passos anteriores, alguns dos Membran de Reissnere, muitas vezes, ser removido. Se alguma ainda permanece, segure a membrana de Reissner com uma pinça # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta e se afastar do órgão de Corti. NOTA: A membrana tectorial é raramente visível e tipicamente flutua para longe sem a necessidade de uma etapa específica para a remoção. </li><li> Finalmente fazer vários cortes para reduzir a espessura dos axônios do gânglio espiral, para fazer a volta mais plano possível e usar # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para transferir o giro basal dissecado, segurando os axônios restantes do gânglio espiral, para uma placa de 48 poços (ou corrediça câmara) contendo ~ 500 mL de 10 mM de PBS a pH 7,4. </li></ol></li><li> Meio e voltas apicais separado <ol><li> Coloque os restantes dois terços da cóclea, lado apical para baixo. </li><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina na escala média, onde o giro médio costumava ser conectados ao giro basal, e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral / parede lateral do the giro médio. </li><li> Utilizando 5 mm Vannas-Tubingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região imediatamente cortada com a espira média colocada em cima da lâmina, e colocar a outra lâmina do lado de fora do labirinto ósseo, com um ângulo de 90 ° a partir da extremidade apical. Isso separa o giro médio do giro apical. </li></ol></li><li> Dissecção completa do giro médio de um modo semelhante ao giro basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4). </li><li> Dissecção completa do giro apical. <ol><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, abra a tampa que cobre o giro apical. Dissecção completa de uma forma semelhante à espira basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4). NOTA: dissecado cada espira pode ser armazenado em 10 mM de PBS a pH 7,4 numa placa de 48 poços (ou corrediça câmara) a 4 ° C durante várias semanas antes de imunocoloração. No entanto PBS irá evaporar e necessita de ser reabastecido periodicamente e de armazenagem superior a 2 - 3 semanas pode resultar em crescimento de bactérias ou fungos notecido, que pode diminuir a qualidade da imagem. Recomendamos armazenamento de longo prazo de amostras como ossos temporais não dissecado. </li></ol></li></ol> 6. Immunostaining com fluorescente etiquetado anticorpos <ol><li> Após a dissecção, armazenar cada espira em um bem separado em uma placa de 48 poços (ou slide câmara), submerso em ~ 500 mL de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada um dos seguintes passos a espira deve ser submersa em líquido, não flutuante no topo ou preso ao lado do poço. NOTA: Ao remover o líquido de cada bem, é fácil perder os giros cocleares ou chupar-lo na ponta da pipeta. Mudando soluções com uma ponta de pipeta de 200 mL usando um escopo dissecção vai ajudar a evitar isso. </li><li> Usando uma pipeta, remover PBS de cada poço e substitui com ~ 200 - 300 ul por poço de bloqueio / solução de permeabilização (1% de Triton X-100, 1% de albumina sérica bovina (BSA), e 10% de soro de cabra normal (NGS) diluído em PBS 10 mM de pH 7,4). Incubar 1 hora à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. NOTA: Se qualquer anticorpo primário utilizado foi feita num hospedeiro de cabra, em seguida, um anticorpo anti-cabra secundário irá ser necessário e NGS não deve ser utilizado para qualquer uma das etapas. Soro normal de cavalo pode ser utilizado como um substituto para o NGS. </li><li> Remover solução de bloqueio / permeabilização usando uma pipeta e substituir com 100 ul ~ por poço de solução de anticorpo primário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada anticorpo primário varia. Incubar O / N (mínimo 14 horas) a 4 ° C em um rotador 3D. NOTA: Se mais de um anticorpo primário é usado, todos podem ser combinados na mesma solução para incubação, apenas certifique-se de que cada anticorpo primário tem um host diferente. </li><li> Remoção da solução de anticorpo primário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Cada lavagem incuba um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. </li><li> Retirar última PBS uma lavagem usando uma pipeta e substitua com ~ 100 ul por poço de solução de anticorpo secundário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada fluorescente etiquetado o anticorpo secundário é usualmente 1: 500 ou 1: 1.000. Coloque de 48 poços em uma caixa preta para proteger fluorescente etiquetado anticorpos secundários da luz. Incubar 2 - 3 horas à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. NOTA: Se for necessário mais do que um anticorpo secundário, eles podem ser combinados na mesma solução durante a incubação. Certifique-se de que não há possibilidade de rotulagem cruzada (por exemplo., Usando cabra anti-coelho e frango anti-cabra anticorpos secundários) </li><li> Remoção da solução de anticorpo secundário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. </li><li> Retirar última lavagem PBS com uma pipeta e substituir com ~ 100 ul por poço de HoecHST 33342 (diluído 1: 2000 em 10 mM de PBS, pH 7,4) para rotular núcleos. Incubar 15 - 20 min à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. Não incubar mais tempo do que 20 min. </li><li> Remover Hoechst solução utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. </li><li> Todos os passos podem ser estendidos, excepto incubação a Hoechst, por várias horas, se necessário. Para pausar a reação em qualquer fase, apenas submergir amostras em ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 e armazenar a placa de 48 -bem (ou slide câmara) a 4 ° C até que esteja pronto para retomar as horas de protocolo ou 1 - 2 dias depois . </li></ol> 7. Monte Coclear Liga Slides <ol><li> Etiqueta de slides com informações pertinentes sobre a amostra e os anticorpos utilizados. </li><li> Pipeta ~ 50 ul de mídia montagem em cada slide e ter cuidadopara evitar as bolhas. Centrifuga-se o tubo contendo os meios de montagem para remover quaisquer bolhas. </li><li> Usando # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta, segure os axônios do gânglio espiral para transferir suavemente uma vez coclear a partir da placa de 48 poços para o slide e lugar nos meios de montagem. Monte uma espira por lâmina para evitar a exposição à luz e fotodegradação durante o processo de criação de imagens. </li><li> Use um microscópio de dissecção estéreo para garantir que espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se qualquer uma dessas condições ocorrer, fórceps uso # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta para reposicionar a espira. </li><li> Colocar uma extremidade de uma lamela sobre a lâmina e libertar suavemente para permitir a queda lamela. </li><li> Usar um microscópio de dissecção estéreo para assegurar que a espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se alguma dessas condições ocorrer, mova suavemente a lamela para trás e para reposicionar a espira. </li><li> Colocar as lâminasem uma pasta slide para que eles colocar o plano. Vamos montar cura mídia O / N à temperatura ambiente (manter no escuro) </li><li> Lamelas Selo com clara unha polonês e armazenar a RT ou -20 ° C até trabalhada. Slides podem ser armazenados em uma pasta ou caixa de slides slide. NOTA: Os slides podem ser armazenados a longo prazo a -20 ° C ou -80 ° C e fluorescência será mantida por vários meses. </li><li> Lâminas de imagem usando um microscópio confocal com o comprimento de onda apropriado com base nos anticorpos secundários utilizados durante o procedimento de imunocoloração. Ajustes de brilho e contraste pode ser realizada utilizando o software de imagem fornecida pelo vendedor confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+the+mammalian+cochlea.">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li><li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing.">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li><li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+damage+in+the+C57BL/CBA+mouse+cochlea.">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li><li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells:+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse.">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442 (2011).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice.">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li><li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells.">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters'+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression.">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth,+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones.">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li><li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs.">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li><li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium.">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li><li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome:+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology.">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Há vários passos críticos para toda bem sucedido dissecção montagem e immunostaining. Contudo, antes de qualquer um destes métodos são realizados, é necessária a fixação adequada do tecido coclear. Recomendamos a utilização de metanol livre, ultra-pura, EM grau PFA. PFA feita a partir de pó pode ter vestígios de metanol e um pH instável o que diminui a qualidade de imunofluorescência. Outros grupos também mostraram que dissecções semelhantes são possíveis usando fixadores que não contêm for...

A cóclea em forma de espiral do ouvido interno, contida dentro do osso temporal, abriga o órgão de Corti, o órgão auditivo final sensorial em mamíferos. A cóclea é tonotopically organizado e comumente dividido em apical, médio e basal voltas correspondente a regiões de frequência diferentes, com a detecção de som de alta freqüência na base e detecção de baixa frequência no ápice 1. As células ciliadas, as células mecanosensorial do órgão de Corti, executar o comprimento da cóclea, que é de aproximadamente 6 mm de comprimento de ratos 2,3. Estas células converter a energia mecânica de ondas sonoras, que são transmitidas através do labirinto membranoso cheio de fluido, em sinais neurais que são processadas pelas estruturas auditivas centrais. A técnica aqui descrita fornece um método para a preparação de peças inteiras de o órgão de Corti, após a calcificação da cóclea está completa (para as amostras que vão desde uma semana de idade até à idade adulta). Nós também apresentamos um método para immunostaining tudo montado tecido coclear. Cocleares peças inteiras são cruciais para a visualização de todas as células do cabelo e que envolve as células de suporte nos seus arranjos espaciais naturais e permitir a análise em três dimensões, com a utilização de microscopia confocal. Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originalmente descrito um método de montar todo dissecção coclear em 1966. Eles detalhado uma técnica para corrigir rapidamente e dissecar cócleas calcificada submersa no líquido a partir de uma variedade de mamíferos, preservando curtos segmentos intactos do órgão de Corti para análise microscópica 4. A dissecção de um unfixed, calcificada cóclea de rato também foi ilustrado em um vídeo instrutivo 5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding na Universidade de Washington fez várias modificações importantes a este método. Em sua versão da coclear método montar todo, o osso temporal foi descalcificado, embutido no plástico, e cinco meias-voltas ou dez quartos-de-voltas foram dissecçãoted 6,7. Dr. Charles Liberman e colegas Eaton Peabody, Massachusetts Eye Laboratories e Ear Infirmary, modificou esta técnica para que a incorporação de plástico não foi necessário 8. Além disso modificação da técnica ocorreu no laboratório do Dr. Jian Zuo no Hospital de Pesquisa St. Jude Children 9-12 que informou o método de dissecação aqui apresentada. Nós usamos uma estratégia diferente para obter acesso ao órgão de Corti que Bohne e Liberman, que permite o isolamento completo da apical, média e basal voltas. Assim, o tecido dissecado é maior e menos susceptível de ser danificado ou perdido durante os processos de dissecção ou imunocoloração. Além disso, o método actual de facilitar a medição da distância a partir da extremidade apical ou gancho basal para identificar uma região de frequência. Embora muitos laboratórios realizar immunostaining de tecido coclear, não está claro onde este método foi originada. Como resultado, há várias receitas para o bloqueio da-manhãrs e tampões de incubação de anticorpos que podem afetar o desempenho de anticorpos primários individuais. Aqui, nós apresentamos um método para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência que é aplicável aos anticorpos mais comumente utilizados no campo auditivo. A forma complexa da cóclea, delicada estrutura do órgão de Corti, e encaixe ósseo proporcionar um desafio para análise histológica e bioquímica. Uma variedade de técnicas são actualmente usados ​​no campo de audiência para superar estas características difíceis e visualizar as células dentro do órgão de Corti, cada técnica com as suas próprias vantagens e desvantagens. O protocolo aqui apresentado permite a montagem de dissecção toda a cóclea de rato adulto e, com ligeira modificação, pode potencialmente ser usado para examinar as estruturas críticos dentro do cócleas a partir de uma variedade de outros organismos modelo utilizados no campo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:377px;">Standard&#160; pattern forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11000-12</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">10.5 cm fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814</td>
			<td style="width:395px;">TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">end-over-end tube rotator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">activated charcoal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC134372500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereo dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #4 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mm Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td>curved&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-52</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8 well chamber slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1256518</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, fraction V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NHS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D rotator</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>R3D-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot incubation box XL</td>
			<td>Licor</td>
			<td>929-97401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Prolong gold antifade mounting media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coverslips 22 x 22 x 1</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clear nail polish</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cardboard slide folder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base) a partir de tecido da cóclea que é calcificada, com passos de dissecação chave apresentados na Figura 1. Durante a primeira semana pós-natal de desenvolvimento, a calcificação do do mouse cóclea é incompleta e um método de dissecação mais simples pode ser usado 13. Usando todo o método de dissecação montagem neonatal com cóclea...

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

54.5K visualizações.  Southern Illinois University, School of Medicine.  Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea. 

Vídeo: Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Neurociência

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

Dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus Infecção mediada por células Coadjuvante

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...