D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant program.

注：画像の前日1と2テイク場所をステージ。イメージングの日前またはで使用するすべてのメディアやサプリメントが平衡化されていることを確認します。平衡は、5％CO 2に設定したインキュベーター中で37℃にメディアやサプリメントの加温することによって達成されます。全ての細胞培養作業やカバーガラスメッキ工程は層流フードの下で無菌状態で行われます。 1.細胞トランスフェクション<ol><li>蛍光融合は、F-アクチンGFP標識及びイメージングのために構築コードするプラスミドを用いた実験の前に24時間を画像化するT細胞をトランスフェクション。注：細胞トランスフェクションの前に24時間を分割する必要があります（前の画像へ48時間）は、細胞が最適な健康状態で、それらの対数増殖期にあることを確認します。 <ol><li>平衡化インキュベーターに6ウェルプレートの1ウェルにRPMIサプリメントの5ミリリットル（RPMI 1640 + 10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（オプション））を配置します。 </li><li> 2×10 7のT細胞のカルトをペレット5分間327×gで遠心分離管を使用して、RPMIサプリメントで37°C +5％CO 2でured及び予熱したエレクトロポレーション培地の等量で洗います。注：エレクトロ媒体（消耗品を参照）緩衝液および補助剤を含有する低血清培地です。 </li><li> 5分間327×gで再ペレット化した後、エレクトロポレーションメディア500μlの細胞を再懸濁し、ゆっくりと、キュベットに追加の標識F-アクチンのためのPCRグレードのdH 2 O中に 5μgのプラスミドを追加します。 </li><li>静かに電気のアーク放電を引き起こす可能性があり、メディア内の細胞を均一に分配するために、メディア内の気泡の除去を確実にするためにフードワークスペース上のキュベットをタップします。 </li><li> 290Ωへのエレクトロポレーション装置と設定された電圧300 Vへと容量をオンにします。 20ミリ秒のための指数関数的減衰を使用してエレクトロポレーションサンプル。注：最適化は、異なるセル、異なるプラスミド構築のために必要とされてもよいです。 </li><li>トランスフェクションのプロトコルは、一旦続行する前に、完全な1分間氷上で、店舗の細胞。 </li><li>慎重にステップ1.1.1から平衡化したRPMIサプリメントの5 mLを含む6ウェルプレートにキュベットから細胞を転送します。 </li><li> 37°C〜+ 5％CO 2で細胞O / Nインキュベートします。 </li></ol></li></ol> 2.コートカバーガラスとプリ暖かいイメージングサプリメント<ol><li>抗体で被覆カバースリップは、T細胞刺激を誘導します。 <ol><li>コー​​ト200μlのPBS中1μg/ mlのαCD3およびαCD28で8ウェルカバースリップの各チャンバ。 </li><li> 4°のCO / Nで保存します。あるいはまた、コートカバースリップを2時間前にカバースリップに温度変化を最小にすることによって画像化プロセス中にドリフトを低減するために画像化し、37℃のインキュベーター中で維持します。 </li></ol></li><li> 0.1μmのサブ回折蛍光マイクロスフェアとカバーガラスの試験サンプルを作成します。 <ol><li>塊を避けるために、ビーズの渦原液。 </li><li>番目の新しい、きれいなカバースリップオン（製造者の指示に従ってなど）表面にステップ2.1.1で使用されているもの、ピペット5μlの蛍光マイクロスフェア原液として電子と同じタイプ。 </li><li>ピペットチップでカバーガラスの上にマイクロスフェア液を広げます。 </li><li> PBSのようなメディアをマウントする200μLを適用した後、乾燥することができます。 注：封入剤は、イメージング、細胞サンプルに使用することを一致している必要があります。 </li></ol></li><li> HBSSを平衡化、37℃+ 5％CO 2でするように事前に暖かいO / N培養器に配置することにより、遠心分離管中（以下、「HBSSサプリメント」と呼ば+ 20mMのHEPES、）。 注：HEPESを添加すると、CO 2の入力とのインキュベーションチャンバーを使用して、この補充をスキップする場合、CO 2をバッファリングすることです。 </li></ol> 3.顕微鏡セットアップ<ol><li> TIRF-SIMの顕微鏡のステージトップインキュベーターをオンにして、完全に発熱体のベースをカバーするために顕微鏡のリザーバ内に十分な蒸留水を配置します。水が電子を許可します37℃にquilibrate。また、37℃に設定した対物レンズに加熱カラーを追加します。 注：セットアップの感度に、これらの手順は非常に前の晩に行われている原因の光学部品は、安定した温度での撮像の前にあります。 </li><li>顕微鏡の光路にTIRF 488互換性のある格子ブロックを配置し、所定の位置に固定します。 <ol><li> TIRF-SIMモードの正しい光路に係合するように、それぞれのレーザベッド、顕微鏡ステージ上で「シングル」の位置にチャネルモードとファイバケーブルを切り替えます。注：このステップをスキップするソフトウェアのウィンドウ内のエラー（ 図1A）につながります。 </li></ol></li><li>すべての顕微鏡とコンピュータのコンポーネントの電源をオンにし、取得制御ソフトウェアを開きます。 <ol><li> OCパネルを開き、チタンパッド、N-SIMパッドとND取得窓（ 図1B）。 「OCパネル」でオプションを選択して「TIRF 488 &#39;（ 図2B、黄色の矢印）。 </li&gt; <li> N-SIMパッド]ウィンドウで、「TIRF-SIM」と「移動」の設定（ 図2C、黄色の矢印）を選択します。ドロップダウンメニューから[設定]ボタン（ 図1C、黄色のボックス）を選択して、「（100X TIRFの488nmのための）TIRF 488」を選択し、「適用」と「OK」を押します。 </li><li>フレームレート50ミリ秒、読み出しモード、EMゲイン14ビットで3 MHzであり、1の変換ゲインとEMゲイン乗算器300（ 図1C、緑色のボックス）： &#39;にDU897設定」内のカメラの設定を設定します。 注意：フレームレートの配慮のための代表的な結果を参照してください。 </li><li> 「N-SIMパッド」で、100×1.49 NA CFIアポクロマートTIRF目的を選択することにより、TIRF-SIM用顕微鏡の照明を校正10％に488nmのレーザパワーをオンにします。 注：原画像の画素サイズは、ビューの512×512ピクセルのフィールドで、60 nmです。 </li><li>ほこりや油を除去するためにレンズティッシュを使用して、対物レンズを清掃してください。 </li></ol></li&gt; <li> TIRF-SIM焦点面を検索します。 <ol><li>可能な限り低いz面での目的で開始します。目的にレンズ油の滴を配置し、顕微鏡ステージにステップ2.2からの蛍光マイクロスフェアのサンプルを追加します。 </li><li>顕微鏡のボディに位置パーフェクトフォーカスシステム（PFS）機能を選択します。 </li><li> PFSボタンが焦点面に到達したことを確認するために点滅しなくなるまでゆっくりz平面を通じて目的を上に移動。 </li><li>制御ソフトウェア、画像PFSマイクロマニピュレーターホイールを使用して作られた最終調整のためのマイクロスフェアの「ライブ」ビューに切り替えます。 </li></ol></li><li> 75 nmのエバネッセント波以上の無焦点外の蛍光発光との均一な照明を観察します。 注：確認構造化照明は、蛍光ミクロスフェアのサンプルから変動する照明パターンを観察することによって満たされます。 </li><li>蛍光ミクロスフェアのサンプルを測定し、改善されたイメージングRESOLUTを定量化強度プロファイルの半値全幅（FWHM）を観察することによってイオン。 <ol><li> NIS-N-SIM分析モジュールがインストールされて、分析ソフトウェア（v4.20.01）を開き、「アプリケーション」を選択します - &gt; &#39;表示N-SIMウィンドウ」。 </li><li> TIRF-SIMデータセット（ 図2）が1に設定された照明モジュレーションコントラスト（IMC）と高解像度の雑音抑圧（HRNS）と、30のピクセルサイズで1,024×1024画素の再構成画像を生成するために、微小球サンプル画像を再構成しますNM。 </li><li> 1ピクセル（ 図3A、黄色のボックス）の幅のラインプロファイルツールを使用して、単一の微小球の中心を通る線を引きます。 </li><li> FWHMボタン（ 図3B、黄色のボックス）を選択し、その強度の最小値が続くガウス分布の最大強度、でクリックします。 </li><li>ミクロスフェアのFWHMを確認100nmで（ 図3C）の範囲です。注：解像度ACHをievedイメージング生物学的サンプルは、標識効率およびバックグラウンド蛍光からの信号対雑音比に応じて変化します。 </li></ol></li></ol>イメージング4.サンプル調製<ol><li>カバースリップの準備。 <ol><li>冷蔵庫やインキュベーターからステップ2.1からαCDコーティングしたカバースリップを取得し、各ウェルからαCD3およびαCD28を含有するPBSを除去します。 </li><li>ステップ2.3からカバースリップの各ウェルに予め温めておいたHBSSサプリメントの200μLを加えます。最小限のαCD3およびαCD28を溶液中に放置されていることを確認するために洗浄し、削除します。 HBSSサプリメントの別の200μlをカバーガラスのウェルに追加します。 </li><li>石油や微粒子を除去するためにレンズティッシュでカバースリップの下側を清掃してください。 </li></ol></li><li>ステップ3.4に見られるような顕微鏡ステージ上の位置カバーガラスとは、PFSのz平面を使用してカバースリップのTIRF焦点面を見つけます。 </li><li>細胞調製物。 <ol><li>メディアコンの200μLをピペットマイクロ遠心チューブにステップ1.1.8からトランスフェクトされた細胞をtaining。 </li><li> 20秒間268×gでマイクロ遠心機で細胞をペレット化し、細胞培地を除去します。 </li><li>ステップ2.3から200μlの予め温めたHBSSサプリメントで細胞を再懸濁し。 </li></ol></li></ol> 5.イメージング細胞<ol><li>顕微鏡に細胞含有HBSSサプリメントを取り、優しく井戸の一つに200μLをピペット。 </li><li> （PFSモードで）カバーガラスでTIRF焦点面に残っている間、カバーガラスに近づい蛍光細胞を追跡するために、顕微鏡の接眼レンズと落射蛍光照明を使用しています。 </li><li>細胞がカバーガラスに着陸すると、モニタに画像を持参し、細胞を確認するために、N-SIMパッドで「ライブ」モードに切り替えて、コンピュータ画面上の焦点です。 </li><li>クリックして、ND取得ウィンドウを開き、「時間」タブを選択し、時間のコースを記録するには遅延なし、「所要時間」に「追加」と「間隔」設定10分に、1に設定される「ループ」。 注：時間は、対象のプロセスに応じて変更することができます。 「遅延なし」で撮影したときSTICSソフトウェアは≈10フレームの画像スタックとの定量的な結果を抽出することができます。 </li><li>ビーズサンプルと同一の取得設定では、ND取得窓に「今すぐ実行」を選択することにより、データの記録を開始します。 </li></ol> 6. SIM画像を再構成します<ol><li>イメージングの完了後、インストールされたNIS-N-SIM分析モジュールと、解析ソフトウェア（v4.20.01）を開き、「アプリケーション」を選択します - &gt; &#39;表示N-SIMウィンドウを」。 </li><li> TIRF-SIMデータセットのために1に設定照明モジュレーションコントラスト（IMC）と高解像度の雑音抑圧（HRNS）（ 図2）と、1つ（またはバッチツール使用して複数の）再構成されたSIMの画像を生成するために生のSIMファイルを再構築します。 </li><li>再構成されたファイルを確認することで示さ30nmのピクセルサイズを有しています画像のステータスバー。 注意：ピクセルサイズがSTICS分析に影響を与えませんが、ピクセル間の空間的相関を確保するためにPSFの空間分解能よりも寸法が少なくとも2倍小さくする必要があります。 </li><li> STICS分析のための準備ができて、.TIFFファイルとしてデータをエクスポートします。 </li></ol> 7. STICS分析<ol><li> （;補足情報として利用できるワ​​イズマンラボ）STIC（C）S Matlabのソフトウェアパッケージをダウンロードし、解凍します。スクリプトstics_vectormapping.mは、単一チャネルSTICS分析の中核であり、コードの最初の30行は、マニュアルのセクション2.1で定義された入力パラメータを定義するために使用されています。このスクリプトを開き、TIRF-SIMデータ分析のための入力パラメータを定義します。これは、マニュアルの付録で説明するように、また、ローカルマシンMatlabのパスにサブフォルダとSTIC（C）Sフォルダを追加することが提案されています。 <ol><li>コー​​ドの対応する行を編集して、データ分析のための入力パラメータを定義します</li><li> ANAを実行するにはTIRF-SIMデータの溶解は、1ベクトルマップを生成ベクトルマップの時系列を得るためにフレームの最大数と1のライン32の時間的シフトをライン31に一時的なサブ領域に一時的なパラメータを設定するためにこれらのパラメータを変化させます。 </li><li>不動除去フィルタについては、「移動平均」にパラメータ「フィルタリング」（23行目）を設定し、21に「MoveAverage &#39;パラメータ（ライン24）を設定します。 注：それは分析されているフレームから直列フレームを減算に基づいているこの設定は、より遅く移動すると大きな蛍光信号のために働くことが示されています。 </li><li>変更する行は33〜38は、出力ファイルと出力ベクトルマップのタイトルの名前と同様に、出力ディレクトリのパスを設定し、ベクトル地図画像を保存する必要がどのような形式で定義します。 </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td>ピクセルサイズ（ミクロン） </td><td> 0.03ミクロン</td><td> 19行目</td></tr><tr><td>フレームレート（秒） </td><td> 1秒</td><td>ライン20 </td></tr><tr><td>最大遅延時間（フレーム） </td><td> 20フレーム</td><td> 21行目</td></tr><tr><td>小区域のサイズ（ピクセル） </td><td> 8ピクセル</td><td> 29行目</td></tr><tr><td>圏の間隔（ピクセル） </td><td> 1ピクセル</td><td> 30行目</td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Matlabのエディタウィンドウにスクリプトrun1ChannelSTICSを開きます。ラインこのスクリプトの1-23を実行して、画像シリーズをロードします。 注：このスクリプトは、ロードし、前処理画像シリーズ、ベクトルマップと速度のヒストグラムをプロットし、多くのファイルのバッチ処理を実行するために使用することができます。必要な場合は、このスクリプトの行24〜26を用いて、関心領域の画像をトリミングしてください。 <ol><li> STICS分析を開始するrun1ChannelSTICSのライン29-35を実行します。プロンプトが表示されたら、必要に応じて、関心領域（ROI）の特定の領域を示すためにポリゴンを選択します。 STICSは、これらの再解析したときに、境界アーティファクトが発生すると、ROIは、セル端と重なっていないことを確認してくださいgions。 </li><li>ベクトルマップを表示する行38-52を実行します。速度の大きさのヒストグラムをプロットするには、ライン53から72を実行します。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

この技術は、画像の研究を可能にし、蛍光を発現する細胞において、以前に解決できない詳細を定量化します。我々の結果では、F-アクチンは、T細胞である、細胞内の中心に向かって細胞周囲から対称的に流れることを示しています。これらの知見は、1次元ラインプロファイルカイモグラフデータ 13からの以前の結果と一致しており、2D超解像データ解析の能力を拡張します。 <p ...

この実験の目的は、画像にあり、免疫学的シナプス（IS）形成中の流れの方向と大きさを確立するために、回折限界を超えて、T細胞を生きにfilamentous-（F-）アクチンの分子流を特徴付けます。この技術は、抗CD3-および抗CD28抗体でコーティングしたカバースリップを活性化する人工シナプスを形成したJurkat T細胞を画像化する、全内部反射蛍光（TIRF）モードでの構造化照明顕微鏡（SIM）を使用して行われます。 T細胞とその標的との間にある形; T細胞受容体（TCR）活性化の際に1,2抗原提示細胞（APC）。これは、適応免疫系は、感染に対する免疫応答を生成するかどうかを決定するための最初のステップであるため、刺激に対する誤った応答の結果は、多くの疾患を引き起こす可能性があります。 T細胞APC相互作用の重要性は十分に立証されているが、成熟の役割（複数可）は、最初のTCR SI後のgnal内在化は、まだ完全には理解されるべきです。 細胞骨格は、TCR活性化（形質膜と細胞骨格アクチン3,4に依存するシグナル伝達分子の制御での分子の動き）に連結された2つのプロセスを支援するために考えられているように、細胞骨格は、空間的及び時間的に再配置する方法を理解する手順を解明しますシナプス形成時の分子の再編成。 F-アクチンの逆流は、この転座は、信号停止やリサイクルのために不可欠であると考えられている、免疫学的シナプスの中心に向かってTCRクラスターを囲いすると考えられています。 T細胞活性化5の微妙なバランスを助けます。 標準的な蛍光顕微鏡法は、細胞 - 細胞相互作用を含む多くの生物学的事象についての洞察を提供し続けて柔軟なツールであるが、それは正確にDIFFRより近くに存在する複数のフルオロフォアを解決するためのシステムの能力によって制限され互いの行動制限（≈200nm）で。細胞内の多くの分子のイベントは、分子の密な集団を伴い、休止中または特定の刺激によりいずれかの動的再配置を示すように、従来の光学顕微鏡は、完全な画像を提供していません。 超解像画像を使用することは、研究者は、様々な技術を用いて、回折限界を回避することができました。 PALM及びSTORM 6,7は約 20ナノメートルの精度で分子の位置を解決する能力を有している単一分子の局在顕微鏡（SMLM）のような、しかし、これらの技術は、多くのフレームの上に画像を構築し、長い取得時間に依存しています。一般に、これは修正されるべきサンプルを必要とするかの構造は、低移動度を示すするため、単一のフルオロフォアは、複数のポイントと誤解されていません。誘導放出の枯渇（STED）イメージングは、非常に選択的共焦点励起8、必要なスキャンにより超解像を可能にするがアプローチは、ビューの全細胞のフィールド全体で遅くなることがあります。 STEDはまた、枯渇ビームのパワーの増加により高い解像度のために重要な光毒性を示します。 構造化照明顕微鏡（SIM 9）は、標準的な蛍光顕微鏡の解像度を倍にすることのできる、これらの方法に代わるものを提供し、現在のSMLM技術よりも生細胞イメージングとの互換性です。これは、ビューの全細胞フィールドの広視野システムの低いレーザパワーを使用しています。取得速度を増加させ、標準的な蛍光団標識と互換性があります提供。 SIMの広視野性質はまた、&lt;100nmの軸方向寸法における侵入深さで、非常に選択的励起のための全反射蛍光（TIRF）の利用が可能になります。 画像相関分光法（ICS）は、蛍光強度の変動を相関させる方法です。 ICSの進化。時空間イ​​ム年齢相関分光法（STICS 10）は、時間と空間における細胞内の蛍光シグナルを相関させます。相関関数を経由して、遅れているフレーム内の周辺画素との画素強度を相関させることにより、情報が流れ速度や方向性について得られます。静的オブジェクトはSTICS分析を妨害しないように、不動のオブジェクトフィルタは、ピクセル強度の移動平均を減算することによって動作しており、実装されています。 ここに提示技術は、生細胞における分子流11を定量するために、超解像顕微鏡データに適用される画像相関分光法の最初の実証であると信じられています。この方法は、STICS分析12を介して Fアクチンフローの回折限界画像化を改善し、光の回折限界を超えた空間分解能で取得されたデータから、生細胞中で二次元の分子流を決定したい研究に適するであろう。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Consumables:</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat E6.1 cells</td>
			<td>APCC</td>
			<td>ATTC TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strepromycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#1.5 8-well Labtek coverslips</td>
			<td>NUNC, Labtek</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LifeAct GFP construct</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>60101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiMem</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD3</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>317315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD28</td>
			<td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td>
			<td>555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulsar Xcell System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cuvette (0.4cm)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (Heraeus)</td>
			<td>Biofuge pico</td>
			<td>75003235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage-top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INUH-TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon N-SIM microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Analyse software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator (190D)</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortical actin flow in t cells quantified by spatio-temporal image correlation spectroscopy of structured illumination microscopy data

繊維状アクチンは運動性と、免疫細胞において、免疫学的シナプスとして知られている重要な細胞 - 細胞相互作用の形成を含む細胞プロセスの大部分において重要な役割を果たしています。 F-アクチンは、サブ膜性小胞のダイナミクスとタンパク質のクラスタリングを含む、細胞の膜に分子の分布を調節する役割を果たしていると推測されます。標準の光学顕微鏡技術が一般化し、回折限界の観測を行うことを可能にする一方で、クラスタリングと分子流を含む多くの細胞および分子事象は、これまでの標準的な光学顕微鏡の分解能以下の長さスケールでの集団で発生します。超解像の撮像方法構造化照明顕微鏡で全内部反射蛍光を組み合わせることによって、T細胞の免疫シナプスにおけるF-アクチンの二次元の分子流を記録しました。定量化resulを生成時空間画像相関分光法（STICS）を塗布し、速度ヒストグラムと流れ方向と大きさを表すベクトル・マップの形でTS。このプロトコルは、詳細のサブ回折レベルのフローベクトルを生成する超解像画像とSTICS技術の組み合わせを記載しています。この技術は、シナプス形成の際にT細胞の周囲全体に対称的に逆行し、求心あるアクチンの流れを確認しました。

顕微鏡の設定成功したすべてを達成した後、研究者は、T細胞のシナプス（動画1）におけるF-アクチンの流れの構造化照明（SIM）イメージングを達成し、時空間画像相関分光法（ 図4〜11）で、この分子流を定量化しています繰り返します。画像を記録する前に、サンプルの照明を確保する9原画像全体?...

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Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K ビュー.  King's College London. To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy. 

ビデオ: Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

CD4の調製<sup&gt; +</sup&gt;顕微鏡によるGD3およびGD2ガングリオシドの膜発現の分析のためのT細胞

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...