著者は、技術支援のためにソフィアフライドに感謝します。助成no.1659/08、971/08、1503年から1508年と10分の491、無助成金健康科学の各省庁のためにイスラエル科学財団：MBSは、研究支援のために、次の機関に感謝します。 3から4114まで及び3から6540まで、後期アレクサンダーSmidodaの不動産を通じてイスラエル癌学会、およびバイオ医学の優秀付与Taubenblattファミリー財団。

1。 T細胞トランスフェクション<ol><li>クレオソリューションにキットの &quot;サプリメント&quot;溶液を混合することによって活性化Amaxaヌクレオソリューションを準備します。活性化する溶液を4℃で3ヶ月までの℃で保存することができる。 </li><li> [10％ウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、及びRPMI中の2mMのL-グルタミン]培地でジャーカットT細胞を成長させる。最適には、細胞を1〜2週間解凍後に使用されるべきである。対数増殖中の細胞培養物を使用すると、高いトランスフェクション効率および細胞の生存に重要である。あるいは、わずかな修正で、このプロトコルは、前述し8のように、一次T細胞を使用することができる。これは、全体の一次T細胞の活性化プロセスの持続時間が長くジャーカットT細胞（〜30分）に比べて、顕微鏡ステージは、培養システムが搭載されていることを強調すべきであるCO 2を維持するために使用しなければならない、湿度および温度アクティベーションプロセス。 </li><li> 5を収集15 mlチューブへのトランスフェクション当たり×10 6対数期T細胞。 </li><li> 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。 </li><li>遠心分離の間に、6ウェルプレートを準備します。 5ミリリットルの培地でそれぞれのトランスフェクションのために1つのウェルを記入し、37℃でプレインキュベート℃に</li><li>遠心機からチューブを収集し、上清を捨てる。 1ミリリットルRPMIで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。 </li><li>遠心分離中、トランスフェクション溶液を準備します。 96ウェルプレートの1つのウェルでは、蛍光標識タンパク質をコードする目的のプラスミド5μgのDNAを、ステップ1で調製した活性化し、100μlのAmaxaヌクレオソリューションを混ぜる。最適には、DNA濃度は、トランスフェクション溶液を希釈することを避けるために、1μgの/ mlのより大きくなければならない。 </li><li>穏やかにピペッティングでよく混ぜる。 </li><li>細胞を遠心分離した後、慎重にすべての上清を除去し、Dではないながら、ペレットをisturbing。 </li><li>二回DNA /トランスフェクションソリューションをピペット。 </li><li>ペレットへのDNA /トランスフェクション溶液を加える。 </li><li> Amaxaキュベットに細胞を移します。 </li><li> Amaxaヌクレオデバイスにキュベットを挿入します。 </li><li> H-10 Amaxaトランスフェクション、エレクトロポレーションの設定（ジャー）またはT-23（一次T細胞）を使用します。 </li><li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り外します。 </li><li>エレクトロポレーションに続いて、慎重にパスツールピペットを用いて6ウェルプレートに細胞懸濁液を上清を移す。細胞破片からなるペレットを形成してもよい。ペレットを転送することは避けてください。 </li><li> 37℃で24時間、細胞をインキュベート℃に</li><li>新しいウェルに各ウェルから細胞懸濁液2.5mlのを転送します。各ウェルに2.5ミリリットル暖かい培養培地（ステップ2で説明）を追加する。 </li><li> 72時間後、400で7分×gで室温で用滅菌チューブと遠心分離機に細胞を移す。上清を捨て、それのWi置き換える使用したプラスミドに適した哺乳類細胞の選択抗生物質（、我々はそれぞれ、1.3 mg / mlのおよび/または0.2 mg / mlの濃度でG418および/またはハイグロマイシンを用い使用される抗生物質に適した濃度の適用）を補充番目の培地。新鮮なだけでなく中の培養細胞懸濁液。あるいは、細胞を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクション後48時間で撮像することができる。一過性にトランスフェクトした細胞を準備するには、ステップ20に正常に継続ステップ8、同時に2つのプラスミドを細胞にコトランスフェクションした後、ステップ23に直接進んでください。このシナリオの下で、細胞を直ちに使用する必要があることに注意し、一般的に蛍光強度が不均質と必ずしも高くない。 </li><li>適切な選択抗生物質を補充した培地で細胞を成長させる。セルを分割し、必要に応じて抗生物質を補充培地でそれらを補う。 </li><li> 2週間後、FACS（インフルエンザの使用に成功したトランスフェクションを確認orescence活性化細胞選別）としては、次のとおりです。 </li><li> 10 6個のトランスフェクトされた細胞、10 6モックトランスフェクト細胞（ネガティブコントロール）、かつ安定して蛍光標識タンパク質を発現することが知られている10 6個の細胞を収集する。セルが複数の蛍光タンパク質（ステップ27を参照）でトランスフェクトされた場合、陽性対照として多数、単独でタグ付けされた細胞株を使用する。 </li><li> 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 500μlのFACS緩衝液（PBSワット/ OのCa 2 +及びMg 2 +、5％FCS、0.05％アジ化ナトリウム）中で細胞を再懸濁し。 </li><li>細胞の蛍光性を確認するための分析FACSを使用します。陰性と陽性対照のそれにトランスフェクションされた細胞の蛍光を比較してください。 </li><li>トランスフェクションされた細胞を使用して、追加、蛍光標識タンパク質は、手順3-26で細胞をトランスフェクトする。 </li><li>蛍光の高いレベルを提示する細胞を使用すべきである。最適には少なくとも50％培養中の細胞は、高い蛍光でなければなりません。細胞蛍光を、FACSを介して細胞選別によって増加させることができる。 </li></ol>任意の追加タグタンパク質は、異なる蛍光体に融合しなければならず、異なる選択抗生物質をコードするプラスミドでエンコードさ。複数のプラスミドでトランスフェクトされた細胞の選択的な媒体は、全ての適切な抗生物質を添加する必要がある。 2。 T細胞拡散アッセイ準備<ol><li>ラボ·テックIIドイツのカバーガラスシステム4チャンバースライドを使用してください。準備または使用中に、ピペットチップで例えば 、誤ってチャンバーの内面に傷を付けないようにしてください。 </li><li> 50mlのスライド調製液を準備し、12 M（37％）のHCl 4.6ミリリットルを取る38.5ミリリットル100％エタノールを追加し、6.9ミリリットル二重蒸留水。 </li><li> 500μlのスライド調製液とスライドの各チャンバーを埋める。 </li><li> 10分間室温でインキュベートする。 </li><li>室を吸引の、それらを完全に乾燥させる。 </li><li> °Cまで完全に乾燥した45℃で1時間のために覆われていないスライドをインキュベートする。 </li><li>二重蒸留水に0.1％のポリ-L-リジン（Sigma-Aldrich社）を希釈することにより0.01％ポリ-L-リジン溶液を調製する。 </li><li>各チャンバーに500μlのを適用します。 </li><li>室温で15分間スライドをインキュベートする。 </li><li>それらを完全に乾燥させ、チャンバーを吸引。 </li><li> °Cまで完全に乾燥した45℃で3時間インキュベートする。 </li><li>コー​​ティングされたスライドを室温で数ヶ月間、乾燥格納することができる。 </li><li>活性化抗体溶液を準備します。室あたりHIT3a（BD Pharmingen社、＃555337）またはUCHT1（BD Pharmingen社、＃555330）、400μlのPBS中10μgの/ mlのいずれか：抗CD3抗体を使用してください。このソリューションは、まもなく、スライドの準備の前に準備する必要があります。 </li><li>活性化抗体溶液400μlの、各チャンバーを埋める。 </li><li> 4℃で一晩、好ましくは37℃以上、で2時間のためにスライドをインキュベート℃に</li><li>活性化抗体ゾルを削除ution、直ちに300μlのPBSで2回チャンバーを洗う。この時点から、チャンバーは、バッファでいっぱい残っていることを確認します。 </li><li> 4℃でPBS-満ちスライドを保存する私たちは、1週間以内にプレパラート室を使用することをお勧め。 </li></ol> 3。 T細胞活性化とイメージング<ol><li> [フェノールレッドなしで1.25ミリリットルのHEPES（1 M）、10ミリリットルFCS、38.75ミリリットルRPMI]イメージングバッファを準備します。撮像バッファは4℃で保存した後に濾過することができる。 </li><li>ツァイスLSM 510メタ顕微鏡をアクティブにします。 37顕微鏡加熱可能な取付フレームを温める℃に&quot;エキスパートモード&quot;を選択します。 </li><li> &quot;取り込み&quot;タブをクリックし、次のタブが開きますレーザーを、顕微鏡、コンフィギュレーション、スキャン、タイムシリーズ。 </li><li>必要に応じてレーザーをアクティブにします。 mCFPとmYFPの励起のために、5分間の &quot;スタンバイ&quot;にし、 &quot;on&quot;にアルゴン/ 2レーザーを設定します。 </li><li>同じ蛍光団を使って、前にこのライブセルイメージングアッセイを実行した場合、結果のLSMファイルを開いて、私は &quot;再利用&quot;をクリック詐欺、ステップ9から継続。そうでない場合は、手順6から継続。 </li><li>使用される蛍光タンパク質の励起および発光のための適切なフィルタを使用してチャネルを定義します。 </li><li> &quot;スキャンコントロール&quot;ウィンドウで、Zスタックオプションを選択します。 </li><li> 0.5ミクロン;現在のスライス：3;：スライス数：インターバル5次のスキャンパラメータを入力します。 </li><li>顕微鏡の近くで37 Accublock デジタルドライバース （Labnet）°Cを準備します。 </li><li> 37℃にイメージングバッファーを温める</li><li>暖かいイメージングバッファー600μlのに置き換える、PBSを吸引することで保存されてスライドを準備します。 </li><li> 37℃でスライドをインキュベート℃にステップ13まで、少なくとも15分間インキュベーターでスライドを保つ。 </li><li> 5×10 5トランスフェT細胞を収集します。 </li><li> 400×gで2分間、細胞を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> 1ミリリットル暖かいイメージングバッファーで細胞を再懸濁し、そして1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li> Tを置きAccublockデジタルドライバースのESTチューブ。 </li><li>インキュベーターから温めスライドを取り、温め顕微鏡取付フレームにマウントします。 </li><li> &quot;VIS&quot;アイコンをクリックします。 </li><li>細胞懸濁液を混合し、1〜2μLを削除します。 </li><li>スライドの下部上記イメージングバッファにピペットの先端を挿入します。スライドを傷つけない。 </li><li>目的の絞りオーバーシードのセルを。 </li><li>彼らが降りるようにすぐに視覚的に蛍光細胞の追跡を開始。両方のチャネルで高い蛍光を表示するセルを選択します。 </li><li>細胞がスライドの表面に到達する前に、LSMモードを有効にします。 </li><li>つだけの励起レーザーを切り替えます。あなたはDICのチャンネルを持っているレーザーを選択します。 </li><li> 1にズームを設定します。 &quot;高速XY&quot;アイコンをクリックします。 &quot;停止&quot;アイコンをクリックします。切り抜きツールを使用して、細胞を中心としたROIを選択します。 </li><li> 3にズームを設定します。 &quot;高速XY&quot;のアイコンをクリックして、手動で最適なセルを表示するには、フォーカスを設定。 &quot;停止&quot; ICOをクリックN。 </li><li>必要なすべての励起レーザーを切り替えます。 </li><li> &quot;STARTT&quot;アイコンをクリックして録音を開始します。画像拡散処理（一般5分）の全体のためのセルを。終了したら、 &quot;停止&quot;アイコンをクリックしてください。 </li><li>ファイルを保存します。 </li><li>追加のセルを取得するために、 &quot;VIS&quot;のアイコンをクリックしてください。まだスライドの下部に接触していなかった細胞が存在する場合は、ステップ23から続けます。すでに拡散プロセスを始めているイメージング細胞を避ける。そうでない場合は32に進みます。 </li><li>観測されたスライド領域が、細胞の大部分を欠いている場合は、細胞（ステップ20から継続）の別のアリコートを追加します。そうでない場合は33に進みます。 </li><li>追加のセルを取得するために、客観的なの開口上の領域は、細胞を欠いているように、スライドを移動します。 </li><li>細胞の別のアリコート（およびステップ20から継続）を追加します。 </li><li>すべての所望の撮影を行った後、保存されたLSMファイルを開きます。 </li><li> &quot;ギャラリー&quot;、 &quot;時間+ Z&quot;と &quot;サブセット&quot;をクリックします。 </li><li> relevanを選択してください時刻t範囲とZスタック。 </li><li>新しいファイルを保存します。 </li><li>すべての画像ファイルのためのステップ35-38を実行します。 </li></ol> 4。イメージングデータ解析<ol><li> Imarisソフトウェア（ビットプレンAG、チューリッヒスイス）を使用して、LSMのファイルを開きます。 </li><li> &quot;サーパス&quot;をクリックします。 &quot;画像処理&quot;メニューをクリックして、 &quot;時間とZを入れ替え&quot;を選択します。これは、画像の正しいトリミングに役立ちます。 </li><li> &quot;編集​​&quot;ツールバーをクリックし、ドロップメニューの &quot;クロップ3D&quot;オプションを選択します。細胞を取り巻く領域のみを含むように画像をトリミング。我々は、細胞を中心とした300×300ピクセルの正方形にトリミングを示唆している。セルの形状と位置が時間の経過とともに変化することに注意してください。 T軸を観察すると、細胞はすべての時点でトリミング領域内にあることを確認してください。 </li><li> &quot;画像処理&quot;メニューをクリックして、画像の元の時間的分離を復元するために、 &quot;時間とZを入れ替え&quot;を選択します。 </li><li>メインツールバーの &quot;Coloc&quot;ボタンを押してください。 &quot;デタイムのビルド]をクリックしますP。 Coloc &quot;。Imarisは自動的に各時点で各チャネルの強度のしきい値を計算します。 </li><li> &quot;チャネル統計&quot;を選択することにより、共局在解析の結果を表示します。 &quot;エクスポート&quot;をクリックしてデータをエクスポートします。 </li><li>それぞれの画像化されたセルに、手順1〜6を繰り返します。私たちは、少なくとも50細胞は、このように分析することをお勧めします。 </li><li>平均ピアソンの局在係数とその標準誤差または偏差を計算します。 </li></ol>

<ol><li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+and+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li>
<li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li>
<li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+tumour+antigens%3A+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li>
<li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%27s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li>
<li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosines+113%2C+128%2C+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li>
<li>Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li>
<li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li>
<li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).</li>
</ol>

私たちは、開示する利害の衝突を持っていません。

複数の細胞プロセスの制御と機能は、タンパク質 - タンパク質相互作用の形成および終了に依存する。顕微鏡イメージングは​​、生きている細胞内の蛍光標識タンパク質のリアルタイム追跡を可能にします。タグ融合タンパク質の共局在は、タンパク質間の直接的または間接的な相互作用を示唆することができ、例えば、免疫沈降などの生化学的方法によって得られた知見を補強するため?...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 clone) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>German coverglass system 4 chamber slides </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Accublock digital dry bath</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation device</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence activated cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

感染症に対する防御を、免疫系1,2によって媒介される。 Tリンパ球は、3,4、複数の免疫細胞の活性化および応答を調節、免疫系のマスターコーディネーターである。 T細胞活性化は、抗原提示細胞（APC）によって表示される特定の抗原の認識に依存する。 T細胞抗原受容体（TCR）は、各T細胞クローンに固有のもので、抗原特異性5を決定します。抗原への結合は、TCR TCR複合体の成分のリン酸化を誘導する。 T細胞の活性化を促進するために、この信号は、TCRにシグナル伝達タンパク質の補充などの様々な重大な反応を開始する、膜から細胞質及び核に導入されなければならない。APCサイト（免疫シナプス）、それらの分子の活性化は、細胞骨格の再配列、細胞内カルシウム濃度の上昇、および遺伝子発現の変化6,7。で正しい活性化シグナルのitiationと終了は、適切なT細胞応答のために重要です。シグナル伝達タンパク質の活性は、タンパク質-タンパク質相互作用の形成および終端に依存する、例えば、タンパク質リン酸化、タンパク質複合体、タンパク質のユビキチン化および種々の細胞のサイト8へのタンパク質の動員の形成などの翻訳後修飾を書き込む。 T細胞活性化プロセスの内部の仕組みを理解することは免疫学研究と臨床応用の両方に重要です。 種々のアッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用を調査するために開発されてきたが、そのような広く使用されている免疫共沈降法などの生化学的アッセイは、タンパク質の位置を識別することができないように、従って、細胞の動態に貴重な洞察の観察を排除メカニズム。さらに、これらのアッセイは、通常、バルク、tのさまざまな段階であるかもしれない多くの異なる細胞からのタンパク質を結合する彼は、細胞のプロセスを検討した。これは、時間分解能に悪影響を及ぼすことができます。生細胞のリアルタイムイメージングの使用は、従って、プロセス9,10のダイナミクスに光を当て、タンパク質の空間時間的に追跡およびシグナル伝達事象を区別する能力の両方を可能にする。我々は、T細胞活性化の間のシグナル伝達複合体形成のリアルタイムイメージングの方法を提案する。一次T細胞又は例えばJurkat細胞などのT細胞ラインは、非生理的なオリゴマー11を予防、単量体蛍光タンパク質に融合された関心のあるタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされる。フォトT細胞は、抗原特異的活性化の必要性を克服しながら、T細胞活性化を誘導し、CD3/TCR複合体に結合し、T細胞活性化抗体8,9、カバースリップでプレコートされた上でドロップされる。活性化細胞は常に共焦点顕微鏡を用いて結像​​される。撮像データは、コルなどの定量結果を得るために分析されるシグナル伝達タンパク質のocalization係数。

我々は、ライブT細胞イメージングと解析例を提示する。撮像実験に先立ち、SLP76欠損T細胞（J14）は、蛍光タンパク質（ 図1）の発現を決定するために、FACSを用いて分析した。タグ付けされたシグナル伝達タンパク質mCFP-NckのSLP76と、mYFPでトランスフェクトしたT細胞を活性化するスライド上に堆積され、T細胞拡散（ 図2）の間に画像化した。収集された画像は、活性?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation at JoVE.com

T細胞シグナル伝達複合体形成のリアルタイムライブイメージング |免疫学と感染症 |ビデオ

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

13.8K ビュー.  Bar-Ilan University. 我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。

ビデオ: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

免疫・感染学

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

生化学

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological synapse, a stereotyped cell-cell junction that regulates T cell activation and directionally targets effector responses. To study these processes effectively, an imaging approach that is tailored to capturing fast, polarized responses is necessary. This protocol describes such a system, which is based on a photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) that is non-stimulatory until it is exposed to ultraviolet light. Targeted decaging of this reagent during videomicroscopy experiments enables precise spatiotemporal control of TCR activation and high-resolution monitoring of subsequent cellular responses by total internal reflection (TIRF) imaging. This approach is also compatible with genetic and pharmacological perturbation strategies. This allows for the assembly of well-defined molecular pathways that link TCR signaling to the formation of the polarized cytoskeletal structures that underlie the immunological synapse.

This protocol describes an imaging-based method to activate T lymphocytes using photoactivatable peptide-MHC, enabling precise spatiotemporal control of T cell activation.

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

ヒト免疫シナプスのイメージング

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

<meta charset="utf8"></head><body>T細胞中のCa2+ マイクロドメインを検出するための高分解能イメージング技術

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:治療介入のための適応免疫応答の初期活性化の解明

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

要約

さらに動画を探す

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタフェースの評価

ヒト免疫シナプスのイメージング

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

要約

さらに動画を探す

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

ヒト免疫シナプスのイメージング

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタフェースの評価

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング