著者は、技術支援のためにソフィアフライドに感謝します。助成no.1659/08、971/08、1503年から1508年と10分の491、無助成金健康科学の各省庁のためにイスラエル科学財団：MBSは、研究支援のために、次の機関に感謝します。 3から4114まで及び3から6540まで、後期アレクサンダーSmidodaの不動産を通じてイスラエル癌学会、およびバイオ医学の優秀付与Taubenblattファミリー財団。

1。 T細胞トランスフェクション<ol><li>クレオソリューションにキットの &quot;サプリメント&quot;溶液を混合することによって活性化Amaxaヌクレオソリューションを準備します。活性化する溶液を4℃で3ヶ月までの℃で保存することができる。 </li><li> [10％ウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、及びRPMI中の2mMのL-グルタミン]培地でジャーカットT細胞を成長させる。最適には、細胞を1〜2週間解凍後に使用されるべきである。対数増殖中の細胞培養物を使用すると、高いトランスフェクション効率および細胞の生存に重要である。あるいは、わずかな修正で、このプロトコルは、前述し8のように、一次T細胞を使用することができる。これは、全体の一次T細胞の活性化プロセスの持続時間が長くジャーカットT細胞（〜30分）に比べて、顕微鏡ステージは、培養システムが搭載されていることを強調すべきであるCO 2を維持するために使用しなければならない、湿度および温度アクティベーションプロセス。 </li><li> 5を収集15 mlチューブへのトランスフェクション当たり×10 6対数期T細胞。 </li><li> 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。 </li><li>遠心分離の間に、6ウェルプレートを準備します。 5ミリリットルの培地でそれぞれのトランスフェクションのために1つのウェルを記入し、37℃でプレインキュベート℃に</li><li>遠心機からチューブを収集し、上清を捨てる。 1ミリリットルRPMIで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。 </li><li>遠心分離中、トランスフェクション溶液を準備します。 96ウェルプレートの1つのウェルでは、蛍光標識タンパク質をコードする目的のプラスミド5μgのDNAを、ステップ1で調製した活性化し、100μlのAmaxaヌクレオソリューションを混ぜる。最適には、DNA濃度は、トランスフェクション溶液を希釈することを避けるために、1μgの/ mlのより大きくなければならない。 </li><li>穏やかにピペッティングでよく混ぜる。 </li><li>細胞を遠心分離した後、慎重にすべての上清を除去し、Dではないながら、ペレットをisturbing。 </li><li>二回DNA /トランスフェクションソリューションをピペット。 </li><li>ペレットへのDNA /トランスフェクション溶液を加える。 </li><li> Amaxaキュベットに細胞を移します。 </li><li> Amaxaヌクレオデバイスにキュベットを挿入します。 </li><li> H-10 Amaxaトランスフェクション、エレクトロポレーションの設定（ジャー）またはT-23（一次T細胞）を使用します。 </li><li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り外します。 </li><li>エレクトロポレーションに続いて、慎重にパスツールピペットを用いて6ウェルプレートに細胞懸濁液を上清を移す。細胞破片からなるペレットを形成してもよい。ペレットを転送することは避けてください。 </li><li> 37℃で24時間、細胞をインキュベート℃に</li><li>新しいウェルに各ウェルから細胞懸濁液2.5mlのを転送します。各ウェルに2.5ミリリットル暖かい培養培地（ステップ2で説明）を追加する。 </li><li> 72時間後、400で7分×gで室温で用滅菌チューブと遠心分離機に細胞を移す。上清を捨て、それのWi置き換える使用したプラスミドに適した哺乳類細胞の選択抗生物質（、我々はそれぞれ、1.3 mg / mlのおよび/または0.2 mg / mlの濃度でG418および/またはハイグロマイシンを用い使用される抗生物質に適した濃度の適用）を補充番目の培地。新鮮なだけでなく中の培養細胞懸濁液。あるいは、細胞を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクション後48時間で撮像することができる。一過性にトランスフェクトした細胞を準備するには、ステップ20に正常に継続ステップ8、同時に2つのプラスミドを細胞にコトランスフェクションした後、ステップ23に直接進んでください。このシナリオの下で、細胞を直ちに使用する必要があることに注意し、一般的に蛍光強度が不均質と必ずしも高くない。 </li><li>適切な選択抗生物質を補充した培地で細胞を成長させる。セルを分割し、必要に応じて抗生物質を補充培地でそれらを補う。 </li><li> 2週間後、FACS（インフルエンザの使用に成功したトランスフェクションを確認orescence活性化細胞選別）としては、次のとおりです。 </li><li> 10 6個のトランスフェクトされた細胞、10 6モックトランスフェクト細胞（ネガティブコントロール）、かつ安定して蛍光標識タンパク質を発現することが知られている10 6個の細胞を収集する。セルが複数の蛍光タンパク質（ステップ27を参照）でトランスフェクトされた場合、陽性対照として多数、単独でタグ付けされた細胞株を使用する。 </li><li> 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 500μlのFACS緩衝液（PBSワット/ OのCa 2 +及びMg 2 +、5％FCS、0.05％アジ化ナトリウム）中で細胞を再懸濁し。 </li><li>細胞の蛍光性を確認するための分析FACSを使用します。陰性と陽性対照のそれにトランスフェクションされた細胞の蛍光を比較してください。 </li><li>トランスフェクションされた細胞を使用して、追加、蛍光標識タンパク質は、手順3-26で細胞をトランスフェクトする。 </li><li>蛍光の高いレベルを提示する細胞を使用すべきである。最適には少なくとも50％培養中の細胞は、高い蛍光でなければなりません。細胞蛍光を、FACSを介して細胞選別によって増加させることができる。 </li></ol>任意の追加タグタンパク質は、異なる蛍光体に融合しなければならず、異なる選択抗生物質をコードするプラスミドでエンコードさ。複数のプラスミドでトランスフェクトされた細胞の選択的な媒体は、全ての適切な抗生物質を添加する必要がある。 2。 T細胞拡散アッセイ準備<ol><li>ラボ·テックIIドイツのカバーガラスシステム4チャンバースライドを使用してください。準備または使用中に、ピペットチップで例えば 、誤ってチャンバーの内面に傷を付けないようにしてください。 </li><li> 50mlのスライド調製液を準備し、12 M（37％）のHCl 4.6ミリリットルを取る38.5ミリリットル100％エタノールを追加し、6.9ミリリットル二重蒸留水。 </li><li> 500μlのスライド調製液とスライドの各チャンバーを埋める。 </li><li> 10分間室温でインキュベートする。 </li><li>室を吸引の、それらを完全に乾燥させる。 </li><li> °Cまで完全に乾燥した45℃で1時間のために覆われていないスライドをインキュベートする。 </li><li>二重蒸留水に0.1％のポリ-L-リジン（Sigma-Aldrich社）を希釈することにより0.01％ポリ-L-リジン溶液を調製する。 </li><li>各チャンバーに500μlのを適用します。 </li><li>室温で15分間スライドをインキュベートする。 </li><li>それらを完全に乾燥させ、チャンバーを吸引。 </li><li> °Cまで完全に乾燥した45℃で3時間インキュベートする。 </li><li>コー​​ティングされたスライドを室温で数ヶ月間、乾燥格納することができる。 </li><li>活性化抗体溶液を準備します。室あたりHIT3a（BD Pharmingen社、＃555337）またはUCHT1（BD Pharmingen社、＃555330）、400μlのPBS中10μgの/ mlのいずれか：抗CD3抗体を使用してください。このソリューションは、まもなく、スライドの準備の前に準備する必要があります。 </li><li>活性化抗体溶液400μlの、各チャンバーを埋める。 </li><li> 4℃で一晩、好ましくは37℃以上、で2時間のためにスライドをインキュベート℃に</li><li>活性化抗体ゾルを削除ution、直ちに300μlのPBSで2回チャンバーを洗う。この時点から、チャンバーは、バッファでいっぱい残っていることを確認します。 </li><li> 4℃でPBS-満ちスライドを保存する私たちは、1週間以内にプレパラート室を使用することをお勧め。 </li></ol> 3。 T細胞活性化とイメージング<ol><li> [フェノールレッドなしで1.25ミリリットルのHEPES（1 M）、10ミリリットルFCS、38.75ミリリットルRPMI]イメージングバッファを準備します。撮像バッファは4℃で保存した後に濾過することができる。 </li><li>ツァイスLSM 510メタ顕微鏡をアクティブにします。 37顕微鏡加熱可能な取付フレームを温める℃に&quot;エキスパートモード&quot;を選択します。 </li><li> &quot;取り込み&quot;タブをクリックし、次のタブが開きますレーザーを、顕微鏡、コンフィギュレーション、スキャン、タイムシリーズ。 </li><li>必要に応じてレーザーをアクティブにします。 mCFPとmYFPの励起のために、5分間の &quot;スタンバイ&quot;にし、 &quot;on&quot;にアルゴン/ 2レーザーを設定します。 </li><li>同じ蛍光団を使って、前にこのライブセルイメージングアッセイを実行した場合、結果のLSMファイルを開いて、私は &quot;再利用&quot;をクリック詐欺、ステップ9から継続。そうでない場合は、手順6から継続。 </li><li>使用される蛍光タンパク質の励起および発光のための適切なフィルタを使用してチャネルを定義します。 </li><li> &quot;スキャンコントロール&quot;ウィンドウで、Zスタックオプションを選択します。 </li><li> 0.5ミクロン;現在のスライス：3;：スライス数：インターバル5次のスキャンパラメータを入力します。 </li><li>顕微鏡の近くで37 Accublock デジタルドライバース （Labnet）°Cを準備します。 </li><li> 37℃にイメージングバッファーを温める</li><li>暖かいイメージングバッファー600μlのに置き換える、PBSを吸引することで保存されてスライドを準備します。 </li><li> 37℃でスライドをインキュベート℃にステップ13まで、少なくとも15分間インキュベーターでスライドを保つ。 </li><li> 5×10 5トランスフェT細胞を収集します。 </li><li> 400×gで2分間、細胞を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> 1ミリリットル暖かいイメージングバッファーで細胞を再懸濁し、そして1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li> Tを置きAccublockデジタルドライバースのESTチューブ。 </li><li>インキュベーターから温めスライドを取り、温め顕微鏡取付フレームにマウントします。 </li><li> &quot;VIS&quot;アイコンをクリックします。 </li><li>細胞懸濁液を混合し、1〜2μLを削除します。 </li><li>スライドの下部上記イメージングバッファにピペットの先端を挿入します。スライドを傷つけない。 </li><li>目的の絞りオーバーシードのセルを。 </li><li>彼らが降りるようにすぐに視覚的に蛍光細胞の追跡を開始。両方のチャネルで高い蛍光を表示するセルを選択します。 </li><li>細胞がスライドの表面に到達する前に、LSMモードを有効にします。 </li><li>つだけの励起レーザーを切り替えます。あなたはDICのチャンネルを持っているレーザーを選択します。 </li><li> 1にズームを設定します。 &quot;高速XY&quot;アイコンをクリックします。 &quot;停止&quot;アイコンをクリックします。切り抜きツールを使用して、細胞を中心としたROIを選択します。 </li><li> 3にズームを設定します。 &quot;高速XY&quot;のアイコンをクリックして、手動で最適なセルを表示するには、フォーカスを設定。 &quot;停止&quot; ICOをクリックN。 </li><li>必要なすべての励起レーザーを切り替えます。 </li><li> &quot;STARTT&quot;アイコンをクリックして録音を開始します。画像拡散処理（一般5分）の全体のためのセルを。終了したら、 &quot;停止&quot;アイコンをクリックしてください。 </li><li>ファイルを保存します。 </li><li>追加のセルを取得するために、 &quot;VIS&quot;のアイコンをクリックしてください。まだスライドの下部に接触していなかった細胞が存在する場合は、ステップ23から続けます。すでに拡散プロセスを始めているイメージング細胞を避ける。そうでない場合は32に進みます。 </li><li>観測されたスライド領域が、細胞の大部分を欠いている場合は、細胞（ステップ20から継続）の別のアリコートを追加します。そうでない場合は33に進みます。 </li><li>追加のセルを取得するために、客観的なの開口上の領域は、細胞を欠いているように、スライドを移動します。 </li><li>細胞の別のアリコート（およびステップ20から継続）を追加します。 </li><li>すべての所望の撮影を行った後、保存されたLSMファイルを開きます。 </li><li> &quot;ギャラリー&quot;、 &quot;時間+ Z&quot;と &quot;サブセット&quot;をクリックします。 </li><li> relevanを選択してください時刻t範囲とZスタック。 </li><li>新しいファイルを保存します。 </li><li>すべての画像ファイルのためのステップ35-38を実行します。 </li></ol> 4。イメージングデータ解析<ol><li> Imarisソフトウェア（ビットプレンAG、チューリッヒスイス）を使用して、LSMのファイルを開きます。 </li><li> &quot;サーパス&quot;をクリックします。 &quot;画像処理&quot;メニューをクリックして、 &quot;時間とZを入れ替え&quot;を選択します。これは、画像の正しいトリミングに役立ちます。 </li><li> &quot;編集​​&quot;ツールバーをクリックし、ドロップメニューの &quot;クロップ3D&quot;オプションを選択します。細胞を取り巻く領域のみを含むように画像をトリミング。我々は、細胞を中心とした300×300ピクセルの正方形にトリミングを示唆している。セルの形状と位置が時間の経過とともに変化することに注意してください。 T軸を観察すると、細胞はすべての時点でトリミング領域内にあることを確認してください。 </li><li> &quot;画像処理&quot;メニューをクリックして、画像の元の時間的分離を復元するために、 &quot;時間とZを入れ替え&quot;を選択します。 </li><li>メインツールバーの &quot;Coloc&quot;ボタンを押してください。 &quot;デタイムのビルド]をクリックしますP。 Coloc &quot;。Imarisは自動的に各時点で各チャネルの強度のしきい値を計算します。 </li><li> &quot;チャネル統計&quot;を選択することにより、共局在解析の結果を表示します。 &quot;エクスポート&quot;をクリックしてデータをエクスポートします。 </li><li>それぞれの画像化されたセルに、手順1〜6を繰り返します。私たちは、少なくとも50細胞は、このように分析することをお勧めします。 </li><li>平均ピアソンの局在係数とその標準誤差または偏差を計算します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+and+T+cell+development.">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li><li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity.">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li><li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+tumour+antigens:+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer.">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li><li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition.">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li><li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation.">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li><li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network.">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton.">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li><li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosines+113,+128,+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity.">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li><li>Wunderlich, L., Farag&#243;, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes.">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li><li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization.">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization.">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li><li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).</li></ol>

私たちは、開示する利害の衝突を持っていません。

複数の細胞プロセスの制御と機能は、タンパク質 - タンパク質相互作用の形成および終了に依存する。顕微鏡イメージングは​​、生きている細胞内の蛍光標識タンパク質のリアルタイム追跡を可能にします。タグ融合タンパク質の共局在は、タンパク質間の直接的または間接的な相互作用を示唆することができ、例えば、免疫沈降などの生化学的方法によって得られた知見を補強するため?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD3 (UCHT1 clone)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300432</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon FACS Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>345810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German coverglass system 4 chamber slides</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Bio Lab</td>
			<td>8410501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-306</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accublock digital dry bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>D1105A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S</td>
			<td>PeCon</td>
			<td>130-800-031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411860-9010-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence activated cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>FACSVantage SE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>7.0.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

感染症に対する防御を、免疫系1,2によって媒介される。 Tリンパ球は、3,4、複数の免疫細胞の活性化および応答を調節、免疫系のマスターコーディネーターである。 T細胞活性化は、抗原提示細胞（APC）によって表示される特定の抗原の認識に依存する。 T細胞抗原受容体（TCR）は、各T細胞クローンに固有のもので、抗原特異性5を決定します。抗原への結合は、TCR TCR複合体の成分のリン酸化を誘導する。 T細胞の活性化を促進するために、この信号は、TCRにシグナル伝達タンパク質の補充などの様々な重大な反応を開始する、膜から細胞質及び核に導入されなければならない。APCサイト（免疫シナプス）、それらの分子の活性化は、細胞骨格の再配列、細胞内カルシウム濃度の上昇、および遺伝子発現の変化6,7。で正しい活性化シグナルのitiationと終了は、適切なT細胞応答のために重要です。シグナル伝達タンパク質の活性は、タンパク質-タンパク質相互作用の形成および終端に依存する、例えば、タンパク質リン酸化、タンパク質複合体、タンパク質のユビキチン化および種々の細胞のサイト8へのタンパク質の動員の形成などの翻訳後修飾を書き込む。 T細胞活性化プロセスの内部の仕組みを理解することは免疫学研究と臨床応用の両方に重要です。 種々のアッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用を調査するために開発されてきたが、そのような広く使用されている免疫共沈降法などの生化学的アッセイは、タンパク質の位置を識別することができないように、従って、細胞の動態に貴重な洞察の観察を排除メカニズム。さらに、これらのアッセイは、通常、バルク、tのさまざまな段階であるかもしれない多くの異なる細胞からのタンパク質を結合する彼は、細胞のプロセスを検討した。これは、時間分解能に悪影響を及ぼすことができます。生細胞のリアルタイムイメージングの使用は、従って、プロセス9,10のダイナミクスに光を当て、タンパク質の空間時間的に追跡およびシグナル伝達事象を区別する能力の両方を可能にする。我々は、T細胞活性化の間のシグナル伝達複合体形成のリアルタイムイメージングの方法を提案する。一次T細胞又は例えばJurkat細胞などのT細胞ラインは、非生理的なオリゴマー11を予防、単量体蛍光タンパク質に融合された関心のあるタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされる。フォトT細胞は、抗原特異的活性化の必要性を克服しながら、T細胞活性化を誘導し、CD3/TCR複合体に結合し、T細胞活性化抗体8,9、カバースリップでプレコートされた上でドロップされる。活性化細胞は常に共焦点顕微鏡を用いて結像​​される。撮像データは、コルなどの定量結果を得るために分析されるシグナル伝達タンパク質のocalization係数。

我々は、ライブT細胞イメージングと解析例を提示する。撮像実験に先立ち、SLP76欠損T細胞（J14）は、蛍光タンパク質（ 図1）の発現を決定するために、FACSを用いて分析した。タグ付けされたシグナル伝達タンパク質mCFP-NckのSLP76と、mYFPでトランスフェクトしたT細胞を活性化するスライド上に堆積され、T細胞拡散（ 図2）の間に画像化した。収集された画像は、活性?...

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T細胞シグナル伝達複合体形成のリアルタイムライブイメージング |免疫学と感染症 |ビデオ

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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13.6K ビュー.  Bar-Ilan University. 我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング 4介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

免疫・感染学

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...