この方法は、白血球間の通信が分子レベルと細胞レベルでどのように起こっているかなど、ヒト免疫学的分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、未精製ヒトT細胞が比較的短期間でex vivoを解析できることである。この手順を実証することは、私たちの研究室の技術者であるヘニング・キルヒゲスナーです。
50ミリリットルの円錐チューブに30ミリリットルのACKライシスバッファーと描きたてのヒト末梢血の1ミリリットルを混合することから始めます.室温で8分後、PBSでチューブを充填して遠心洗浄し、2ミリリットルの培養培地でペレットを摂氏37度で60分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、500マイクロリットルの培養培地中の500マイクロリットルの培養培地中の5番目の黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBまたはSEBに10回10回加え、続いて650マイクロリットルの汎白血球を加える。
共培養物をスピンダウンし、150マイクロリットルの新鮮な培養培地でペレットを摂氏37度で45分間培養します。その後、1.5%パラホルムアルデヒドの1.5ミリリットルを加えながら、100rpmで10秒間細胞を穏やかに渦を出します。室温で10分後、1%BSAを補充したPBSの1ミリリットルで固定を停止し、遠心分離によって細胞を収集する。
ペレットをPBSプラスBSAと0.1%サポニンの100マイクロリットルに再懸濁し、96ウェルのUボトムプレートの2つの個々のウェルに細胞サンプルを追加します。室温で15分後、プレートを遠心分離し、フルオロフォア共役抗体または目的化合物を含むPBSプラスBSAおよびサポニンの50マイクロリットルのペレットを室温で暗闇の中で30分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、PBSプラスBSAとサポニンの150マイクロリットルで細胞を3回洗浄し、60マイクロリットルのPBSでペレットを再懸濁します。
フローサイトメトリーでセルを画像化するには、解析ソフトウェアを開き、液体レベルを確認し、計器メニューの「起動」をクリックします。次に、[読み込み] をクリックし、プロンプトが表示されたら、サンプルをポートに読み込みます。[イルミネーション]タブで、励起レーザーの電力を適切なナノメートルの長さに変更します。
次に、チャンネル 4 と 11 のゲートを調整し、チャンネル 1 の領域を調整します。ゲーティングとレーザーの電力調整を評価するには、ビューメニューをそれぞれのゲートに切り替え、セルとセルのカップルが見えるまでゲートとレーザーパワーを調整します。次に、[ファイル取得]タブで、取得するサンプル名と画像数、およびCD3染色の適切なゲートを定義し、[取得]をクリックして取得を開始します。
取得したセルイメージを解析するには、適切な解析ソフトウェアを開きます。[補正] ドロップダウンの指示に従って、補正マトリックスを作成し、そのマトリックスを comp date ctm として保存します。次に、サンプルの生画像ファイルを開き、ウィンドウに comp date ctm を適用して、補正された画像とデフォルトのデータ分析ファイルを生成します。
補正した画像ファイルを開いた後、画像をカラーモードに変換します。参照テーブルを調整して、[イメージ ギャラリーのプロパティ] ツールバーで最適な表示色を取得します。[解析] メニューの [マスク マネージャ] を開き、チャネル 5 の 60%しきい値マスクを選択し、マスクを埋めて T セル マスクを作成して、T セルを定義します。
次に、3 ピクセルの幅を持つチャンネル 2 の[バレー マスク]を選択して、バレー マスクを作成し、T セルとバレー マスクを組み合わせて T セル シナプス マスクを作成します。T セルの合計 CD3 式を計算するには、フィーチャ マネージャを開き、フィーチャの強度、T セル、チャネル 5 を作成します。T細胞中のF-アクチンの総量を計算するには、特徴の強度、T細胞、チャネル6を作成します。
免疫シナプス中のCD3量を評価するために、特徴の強度、T細胞シナプス、チャネル5を作成します。免疫シナプス中のF-アクチンの量を決定するには、特徴強度、T細胞シナプス、チャネル6を作成します。最後に、F-アクチンおよびCD3濃縮を定義し、免疫シナプス中のF-アクチンまたはCD3の比率と、選択したタンパク質の総発現量をそれぞれ計算する。
これらのグラフでは、サロゲート抗原提示細胞(APC)と、少量のヒト血液サンプルから採取した未精製の汎白血球中のT細胞との間の免疫シナプス中のタンパク質濃縮を定量化するための重要な格子化戦略の概要を示す。ここでは、SEBがない場合の免疫シナプス内に低レベルのCD3およびF-アクチンを有するT細胞-APCコンジュゲートの代表的な画像が示されているのに対し、これらのT細胞APCコンジュゲートはSEBの存在下で強力なCD3およびF-アクチン濃縮を示す。超抗原がない場合、T細胞の15%は免疫シナプスでCD3およびF-アクチンの両方の濃縮を示し、一方、29%の富化は超抗原の存在下で観察される。
実際、超抗原が存在しない場合、細胞内のF-アクチン全体の20%未満が免疫シナプスに蓄積し、超抗原の存在下でシナプスで30%以上が観察される。特に、CD3は、超抗原の存在下でも免疫シナプスに蓄積し、この蓄積は超抗原の添加によっても有意に増加するが、T細胞APC免疫シナプスにおけるタンパク質蓄積を定量するこの方法の適性を実証する。一度習得すれば、この技術は、正しく実行すれば6〜7時間で完了することができます。
この手順を試みる間、SEBを使用しないAPCを使用する場合にもタンパク質濃縮が発生するので、スーパー抗原のないサンプルを含むすべての関連するコントロールを含める必要があります。この手順に従って、超解像顕微鏡のような他の方法は、免疫シナプスの微細な構造に関する追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、細胞通信の分野の研究者が基礎研究、臨床試験、および翻訳科学のためにヒトの免疫シナプスを探求する道を開いた。
このビデオを見た後, あなたは、ヒトT細胞ex vivoのT細胞-APC結合帯と免疫シナプスを分析する方法をよく理解している必要があります.一次人体の作業は危険であり、手袋の着用やバイオセーフティレベルでの作業などの予防措置は、この手順を実行する間は常に2つの条件を取るべきであることを忘れないでください。
