AOHとMASは、サポートのための科学技術のロチェスター研究所の生命科学のトーマスH. Gosnell学校の大学を認めています。この作品は、AOH MCB-1120541に米国国立科学財団（NSF）賞によって部分的にサポートされていました。

注：著者は興味を持っている個人のための教育目的のための機能的相補性分析の組み込みを容易にするために、細菌株および組換えプラスミドを提供するために喜んでいます。機能的相補性実験を容易にするために使用したプラスミドは、表1に記載されています。 1.機能補完のためのプラスミドの構築を<ol><li>機能的相補性のためのジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）のクローニング。 <ol><li> V.からDAPLオープンリーディングフレーム（ORF）を増幅A.から有棘とのcDNA シロイヌナズナとC. PCRによるラインハーディ 。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4デオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれと、鋳型DNAの0.5 ngのとのPfxの1単位を含めますDNAポリメラーゼ。 注：工場Aから3 DAPLオルソログの組換えクローニングに関連する完全な説明シロイヌナズナ （-dapL 時 ）、細菌Verrucomicrobium有棘 （Vsを -dapL）および藻類クラミドモナス（Crを -dapL）は、以前に公開されました。2,18-20 注：次のようにDAPLオルソログのクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。 DAPL F- 対 5&#39;-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 &#39; DAPL R 対 5&#39;CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 &#39; DAPL F- での 5&#39;-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 &#39; DAPL R-5&#39;- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 &#39; で Crの DAPL F-5&#39;- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 &#39; Crの DAPL R -5&#39;- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 &#39; </li><li>トンにPCR断片のクローンを作成彼たpET30a組換えプラスミドを産生するためにプラスミドのpET30a :: 対 DAPL、たpET30a :: DAPLプライマー、制限酵素およびT4 DNAリガーゼを用いたpET30a :: クロム DAPL ました 。 <ol><li>簡単に言うと、17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることによりを50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。18-20 </li></ol></li><li>制限のpET30a :: Crの DAPLのためのXbaIおよびSalIおよびXbaIおよびHindIII酵素で機能的相補用プラスミドを作成するには、DAPLプラスミドでのpET30a :: Vsの DAPLとのpET30aを::ダイジェスト。プラスミドpBAD33 :: 対 DAPLを生成するためにT4 DNAリガーゼを用いてプラスミドpBAD33にインサートを連結。 pBAD33 :: DAPLとpBAD33 :: Crの DAPL で 。 <ol><li>インサート50ngのおよび20 ngをインキュベート1×リガーゼ緩衝液中でベクター、一晩17℃でT4 DNAリガーゼ1単位。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることにより34μgの/ mlの-1カナマイシンを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。20 </li></ol></li></ol></li><li> A.からのチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）のクローニング機能的相補性のためのシロイヌナズナ 。 注：A.からのcDNAのクローニングに関する完全な詳細At5g36160は、以前に記載されている遺伝子座タグによって注釈さシロイヌナズナ 4 <ol><li> PCRによりcDNAを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、および鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。 注：CLのために使用されるプライマー次のようにAt5g36160のoningは、次のとおりです。 なtyrB F- での 5&#39;-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 &#39; AttyrB R- 5&#39;- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 &#39; </li><li> EcoR1とのSal1でPCR断片を消化することによって、組換えプラスミドのpET30a :: At5g36160を生成するために、プラスミドのpET30aへの断片のクローンを作成。後述のようにT4 DNAリガーゼを用いたpET30a中にフラグメントにライゲーション4 </li><li> 、機能的相補性プラスミドの作成制限をXbaIおよびHindIII酵素でたpET30a :: At5g36160を消化し、T4 DNAリガーゼを用いて組換えプラスミドpBAD33 :: At5g3160を生成するために同じ制限酵素部位を用いてpBAD33にインサートを連結します。 <ol><li> 17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換LBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面が34 / mlの-1 chloを補っ24時間37℃でインキュベートすることによってラムフェニコール4 </li></ol></li></ol></li><li> V.からUDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）のクローニング機能的相補性のための有棘 。 注：V.から牟礼ORFのクローニング有棘は、以前に記載されている。18 <ol><li> PCRによるオープンリーディングフレームを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後、プラスミドpET100D :: Vsのむれを生成するために、プラスミドpET100Dにクローニングします。 注：以下のように対牟礼のクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。 MurE F-5&#39;- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT 対 -3 &#39; 対MurE R- 5&#39;- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 &#39; </li><li>機能的相補性のためのプラスミドを作製するために、pET100D :: 対牟礼ダイジェスト 制限XbaIとのSal1酵素およびT4 DNAリガーゼを用いて組換えプラスミドpBAD33 :: Vsのむれを生成するためにpBAD33への挿入を連結。 <ol><li>一晩17℃で、T4 DNAリガーゼの1単位と一緒に、1×リガーゼ緩衝液中で、インサートの50 ngのベクターの20 ngのをインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることにより34 / mlの-1のクロラムフェニコールを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。8 </li></ol></li></ol></li><li>機能的相補性のためのNovosphingobium属からRELA / sのポット（RSH）のクローニング。 注：Novosphingobium属からのrshのクローニングは、以前に記載されている17。 <ol><li> 599ヌクレオチドupstに加えてのrsh ORFを増幅PCRによる終結部位で下流の開始部位と46ヌクレオチドの連。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとTaq DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後のpCR2.1 :: のNSPにrshを生成するために、プラスミドpCR2.1にクローニングします。 <ol><li>増幅されたPCR断片の1μlを、pCR2.1ベクターの1μlを、塩溶液1μlおよび水の1μLをインキュベートします。 5分間25℃でインキュベートし、ライゲーションの2μlのE.へ大腸菌細胞、および37をインキュベートすることによりを50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLBプレート上のコロニーのための画面が 24時間Cを°。 注：以下のようにrshのクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。 rshのF-5&#39;- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 &#39; rshのR- 5&#39;- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 &#39; </li><li>機能的相補のために、プラスミドpCR2.1を消化:: NSPは EcoR1でrshと組換えプラスミドpRK290を生産するために広い宿主範囲pRK290への挿入を連結:: NSPは 、T4 DNAリガーゼを用いてrshを実行。 <ol><li> 17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換37をインキュベートすることにより、10μg/ mlの-1テトラサイクリンを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面 24時間°C。17 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>形質転換を容易にするためのエレクトロコンピテント細菌細胞の調製注：エレクトロコンピテント細胞の調製は、少量（ すなわち、250ml）中に縮小することができる培養物の1.0 Lのプロトコル26に基づいています。このプロトコルをbすることができますのでご注意くださいeはFCAを容易にするために、本 ​​稿に記載されている有能なすべての株を作製するために使用される。22 <ol><li>フラスコ内に単一コロニーを液体培地50mlに接種し、一晩成長し、この工程（ 表2）を開始する前に、変異体の遺伝子型を確認してくださいとなっています。 </li><li> 2日目に、一晩培養物50mlで適切な培地（ 大腸菌変異株とNovosphingobium属のためのPDのためのLB）の1.0 Lに接種し、30℃で（対数期）0.4から0.6へのOD 600に成長C. </li><li> 4℃で15分間5000×gで遠心分離することによって収穫の細胞は、上清をデカントし、滅菌氷冷純粋なH 2 O 500ml中にペレットを再懸濁します</li><li>遠心分離し、細胞を4℃で20分間、5000×gで、上清を除去し、無菌の氷冷10％グリセロールの250ミリリットル中にペレットを再懸濁します。 </li><li> 4で20分間5,000×gで細胞を遠心 °C、スーパーをデカント浮遊性の、および10％グリセロールの2.0ミリリットルでペレットを再懸濁。 </li><li>ドライアイス - エタノール浴中に管を配置することによって、凍結直ちにマイクロ遠心チューブに50μlのを転送することにより、細胞をアリコートし、。エレクトロポレーションのために-80℃でコンピテント細胞を保管してください。 </li></ol>相補プラスミドを持つ細菌細胞の3エレクトロポレーション<ol><li>エレクトロポレーションのために、コンピテント細胞のアリコート（50μl）をへの組換えプラスミドの1.0μlの（10-50 ngの）を追加し、5分間氷上に置きます。 </li><li>エレクトロポレーションキュベットにピペッティングを介して混合物を移し、以下の設定にエレクトロポレーション装置を設定：25μFの容量、2.5 kVで、200オームの抵抗とパルスを提供します。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブにピペットを用いてエレクトロポレーションキュベットと転送にリカバリメディア（LB）の1.0ミリリットルを追加します。振とう培養器で60分間穏やかに回転して回復します。 </li><li> RECOから培養物100μlをプレート非常にピペッティングすることにより形質転換体を選択するために、寒天プレート上にステップし、滅菌スプレッダーを使用して拡散します。 注記：適切な寒天プレートを作るために抗生物質や遺伝子型を確認するには、この手順を開始する前に、表1と表2を確認してください。 </li></ol> Lを使用した機能的相補性を容易にするために、AOH1の4形質転換、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL） <ol><li>相補性解析のために、空のベクター（pBAD33）とし、セクション3.0で概説したエレクトロポレーションプロトコルを使用して、別々の形質転換事象でDAPL発現ベクターでAOH1を変換します。 </li><li> 50μg/ mlの-1 DAPおよび34 / mlの-1のクロラムフェニコールおよび50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLB寒天培地上にプレーティングすることによって、形質転換体を選択します。 </li><li> LB私にストリーキングによってレプリカメッキコロニーによる機能補完のためのテスト0.2％及び50μg/ mlの-1 DAPおよび34 / mlの-1カナマイシンなし（w / v）のアラビノースとdium。 </li><li> 24時間、30℃でプレートをインキュベートし、その結果を観察します。 注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合、変異体は、唯一のDAPL遺伝子が変異体バックグラウンドで表現されている唯一のDAPを含まない培地上で生育することが可能であることを示す必要があります。 </li></ol> UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-グルタミル-2,6- メソ -diaminopimelateリガーゼ（むれ）を使用して機能的相補性を容易にするために、TKL-11の5変容<ol><li>空のベクター（pBAD33）とし、セクション3.0で概説したプロトコルを使用してのMurE発現するベクター（pBAD33 :: VsmurE）と変異型を変換します。 </li><li> LB寒天培地上でプレートを選択した形質転換体は、/ ml -1のクロラムフェニコール50μg/ mlの-1チミンおよび34μgのを補充し、24時間、30℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>コントロールと2 LB培地+ 0.2％（w / v）でアラビノースおよび50μg/ ml -1のチミンへの実験的な変換の両方からコロニーをストリーキングやメッキによって補完のためのテスト。 </li><li>視覚的に増殖表現型を評価するために24時間、42℃で30℃、他に一つのプレートをインキュベートします。 注：結果は、変異体はむれ遺伝子がベクターのみの対照と比較して、変異体バックグラウンドで表現されている場合にのみ、42℃で増殖することが可能であることを示す必要があります。 </li></ol>チロシンアミノトランスフェラーゼを使用した機能的相補性を容易にするために、DL39の6.変換（なtyrB） <ol><li> LB寒天プレート上pBAD33もしくはpBAD33 :: At5g36160のいずれかとDL39を変換して、選択した形質転換体は、セクションで概説した50μg/ mlの-1チロシン、50μg/ mlの-1フェニルアラニン、およびプロトコルを使用して、34 / mlの-1クロラムフェニコールを補っ3.0。 </li><li>レプリカ50μg/ mlの-1フェニルアラニンおよび50μg/ ml -1のチロシン、50μg/ mlの-1アスパラギン酸、50μg/ mlの-1ロイシン、を50μg/ ml -1のバリンと最小限（M9）メディア上の-plateコロニー、 50μg/ mlの-1イソロイシン、を10μg/ ml -1のウラシル0.5％（w / v）のグリセロール、0.2％（w / v）でアラビノース。両方のプレートの同じコロニーを画線することによってフェニルアラニンおよびチロシンを欠くプレート上でもレプリカプレートコロニー。 </li><li>増殖表現型を観察するために48時間、30℃でプレートをインキュベートします。 注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合、変異体は、唯一の変異体バックグラウンドでなtyrB遺伝子が発現されている場合にのみ、フェニルアラニンおよびチロシンを含まない培地上で生育することが可能であることを示す必要があります。 </li></ol> Novosphingobium属のHypomucoid表現型の機能的相補を容易にするために、Hx699の7変容。ひずみHx699 </P&gt; <ol><li>野生型株Novosphingobium 属 。（Rr2-17）とpRK290とpRK290した変異Hx699 :: rshの NSPはセクション3.0で概説した形質転換プロトコルを使用して、2つの独立した形質転換イベントに変換します。 </li><li>ポテトデキストロースに変換をプレート（PD）寒天を10μg/ ml -1のテトラサイクリンを補足し、少なくとも24時間、または形質転換体が現れるまでインキュベートします。 </li><li>ストリーク両方の変換新鮮PD寒天プレート上の「X」のパターンで、30でインキュベート 少なくとも4日間、Cを°。視覚的に両プレートの増殖表現型を調べることによってのみ、ベクター、および実験の表現型を観察します。 注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合にrshが変異体バックグラウンドで発現される場合ハイポムコイド表現型が補完されていることを示すべきです。 </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ロチェスター工科大学でバイオテクノロジーおよび分子バイオサイエンスのカリキュラムに不可欠なコースの多くは、当然の講義部分に加えて、研究室のコンポーネントを持っています。学年2014-2015ためのカリキュラムは、約60％を占める研究室のコンポーネントが含まれている29そのうち48コースの合計が含まれています。そのようなコースは、植物生化学・病理学（FPBP）、ブレンド講義/?...

遺伝子の機能を解明するの文脈で機能的相補性（S）/役割（複数可）は、相同野生型状態を観察可能な表現型を有する特定の変異体を回復するために特定の相同またはオーソロガス遺伝子の能力として定義されますまたはオルソロガス遺伝子変異バックグラウンドにシスまたはトランスで導入されます。この技術は、広く分離し、機能（複数可）は、多くの遺伝子/役割（複数可）を識別するために使用されてきました。 1つの特定の例は、SのURA3変異体を使用して、 カンジダ・アルビカンスからオロチジン-5-リン酸脱炭酸酵素の単離および同定でありますcerevisiaeおよびE.ののpyrF変異体大腸菌 。1著者は、アミノ酸、ペプチドグリカンとその研究プログラムにおける緊縮応答の代謝に関与し、Bでの教育プログラムにこの技術を組み込んだ遺伝子の機能を解明するために、この技術を使用していますiotechnologyおよび分子バイオサイエンス（BMB）ロチェスター工科大学（RIT）でのプログラム。 原則と慣行（BPP）（ハドソン/ Savka）、RITでBMBのプログラムで2つの上部の分割選択科目の研究室ベースのコース：著者らは、植物生化学/病理学（FPBP）（ハドソン）とバイオセパレーションの基礎を教えます。コー​​スで議論されたトピックのいくつかは、彼らの研​​究分野で提携しているので、著者らは、これらの2実験室ベースのコースに、それぞれの研究プログラムで使用されている技術と実験的なツールの多くが組み込まれています。その一例は、植物、ペプチドグリカンや細菌からの緊縮応答代謝から酸代謝をアミノ酸に関連する講義資料を強化するために、実験室の練習として機能的相補性です。 FPBBコースで議論されている植物由来のアミノ酸経路のうちの3つがあることリシン（リジン）の、チロシン（tyrで）とフェニルアラニン（Pheで）。動物がLys デノボを合成する遺伝子機構を欠いているため、Lysの経路があるため、すべての動物、特にヒトのための必須アミノ酸などのアミノ酸の重要性のコースで強調表示されます。また、最近、植物は細菌のものとは大きく異なるリジンの合成経路を用いることが発見されました。この発見は、部分的にEの機能的相補性によって促進されましたコリジアミノピメリン酸（DAP）のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの酵素L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）をコードする遺伝子を用いて、変異体2、中間ジアミノピメリン介してリジンの合成のための変形経路は、 図1に示されている。また、リジンの合成は、高度に調節されているアミノ酸のアスパラギン酸由来のファミリーを介して容易にする。3タンパク質SYNTにおけるそれらの重要性に加えてhesisは、TyrおよびPheのための経路はフェニル化合物の同化作用のための前駆体化合物のような植物の防御化合物の合成関与となる中で、その重要性を考慮強調表示されています：アルカロイド、リグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、とりわけヒドロキシ酸を4 TyrでおよびPhe経路は、植物や細菌の同化経路の違いを示すために強調されています。植物において、酵素は、TyrおよびPheへの異化作用における主に関与し、これらのアミノ酸の同化に関与していないのに対し、細菌は、酵素チロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）は、両方のアミノ酸の同化作用に関与しています。 （ 図2）。4 ペプチドグリカンの構造に関するグラム陽性およびグラム陰性菌（PG）との相違点は、FPBPコースで強調表示されます。グラム陰性菌のPGは、そのほとんど事実にに基づいて、植物病理学に関する関心があります植物病原体は、グラム陰性です。トップ10の細菌フィト病原体に関する最近のレビューは、すべてのグラム陰性であることを明らかにしました。細菌は属からのものであった： シュードモナス 、 ラルストニア 、 アグロバクテリウム 、 キサントモナス 、 エルウィニア 、Xylella、DickeyaとPectobacterium化学違いの5つのグラム陰性およびグラム陽性菌のPGステムを比較する架橋アミノ酸の差があります両方のタイプの酸です。 PGの異なる架橋のための最初のステップは、PG同化の細胞質工程で起こり、酵素UDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（のMurE）によって促進されます（ 図3A）。 MurEはペプチドステムの3番目の位置における特定のジアミン化合物の付加を触媒する大部分のグラム陰性細菌で6、最後から二番目のLysの前駆体、 メソ -diaminopimelate（ <e架橋アミノ酸およびLysは、ほとんどのグラム陽性菌のPG（ 図3B）で同じ役割を果たすようメートル&gt;メートルの-dap）が提供しています。7これが原因メートルの -dapおよびLys両方が2つのアミンを保有するという事実によるものであり、グループとは、ペプチド幹架橋のための2つのペプチド結合を形成することができます。 バイオセパレーションの場合：原則と実践（BPP）もちろん、細菌の培養のためのオープンとクローズドシステムの違いとどのように栄養のレベルは、環境の変化が議論されていると、両方のシステムで大幅に変更されます。これらのイベントは、「シフトダウン」や飢餓やアミノ酸やエネルギーの十分な供給を契機「シフトアップ」と呼ばれる規制の変更にリンクされています。細菌培養物を単一炭素源と化学的に定義された培地に豊かで複雑な媒体から転送されたときに、「シフトダウン」応答が発生する可能性があります。環境の変化が急速cessaにつながりますtRNAとrRNAの合成化。アミノ酸の生合成をアップレギュレートされていてもリボソーム、タンパク質およびDNA合成の欠如でこの停止をもたらします。 「ダウンシフト」の応答に続いて、既存のリボソーム培地または環境で利用できなくなったアミノ酸を合成する新しい酵素を生成するために使用されます。一定期間後、rRNAの合成と新しいリボソームが組み立てられ、細菌細胞の集団を減少した速度であるが成長し始めます。イベントのコースは「 緊縮応答」または「 ストコントロール」と呼ばれ 、世界的な細胞制御の一例であり、必要な基質およびエネルギー需要の利用可能性を補償するために、細胞の生合成機構を調整する機構と考えることができますされています8緊縮応答は、このような環境での栄養素のフラックスに迅速に対応するために、細菌を可能にし、貢献し、ENH栄養素およびまたは基板の可用性に関して迅速に変更することができる環境で競争する細菌の能力をances。8-9 緊縮応答は、アミノ酸、炭素、窒素、リン酸、および脂肪酸の利用が制限されている遺伝子発現において重要な役割を持っている。8,10-14この緊縮応答は、2個のヌクレオチド、グアノシン四リン酸（ppGpp）とグアノシンによって調整されています五（pppGpp）は、一般的にalarmone（P）ppGppとして一緒に呼ばれます。例えば、アミノ酸が限ら-れているタンパク質合成-alarmone、グアノシンのボトルネックにつながる可能性が3,5-（ビス）グアノシンの同化由来ピロリン酸（ppGpp）、3-二リン酸5 - 三リン酸（pppGpp）が蓄積セルインチ（p）ppGppレベルの変化は、直接、細胞増殖及びdevelopmenに関与している環境での基質の不足を克服するために応答を調​​節する遺伝子の発現に関与しますトン。このプロセスに関与する遺伝子のうちの2つがRELAとスポットと呼ばれています。 RelAのアミノ酸の制限の結果である非荷電tRNAの蓄積に応答に関与するリボソーム関連（p）ppGpp合成酵素です。二官能性（P）ppGpp合成酵素と加水分解酵素などのスポット機能します。スポットの合成酵素活性は、炭素および脂肪酸飢餓の欠如に応答に関与している。8のRelA /スポットホモログは、植物や細菌に広く分布しており、R ELA / Sポット時間 omologsのためのrshと呼ばれている。8,10 -12,16最近の原稿は、細菌Novosphingobium属 Rrを2月17日からこれらのalarmonesの合成に関与する特定のrshタンパク質が存在することを示した。17 ここでは、機能的相補アッセイにつなが4生化学的経路を提示します。この原稿で概説相補アッセイは正しくありませんするための手段を提供します鉱石は識別し、または生化学的経路の授業を補完するために、未知/推定機能（複数可）または教育ツールとしてを有することが予測される酵素を特徴づけるための手段として、このインビボアッセイを使用します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

機能的相補性アッセイ（FCA）が広く遺伝子/酵素の機能/役割を解明するために使用されるin vivoアッセイです。この技術は、生化学、遺伝学および他の多くの分野で非常に一般的です。酸、ペプチドグリカンや細菌の緊縮応答は、この原稿で報告されたアミノ酸に関連する生化学的経路の教育を補完する技術の包括的な概観。リジン（L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）およびチロシンとフェニルアラニンの代謝に関与するチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）の代謝に関与しているモデル植物生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの2つのcDNAが強調されている。また、細菌のペプチドグリカン同化経路は、クロスに関与する細菌Verrucomicrobium有棘からUDP-N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）遺伝子を解析して強調表示されていますペプチドグリカンの-linking。細菌の緊縮応答はまた、RSH（R ELA / sのポット時間 omolog）細菌Novosphingobium属におけるハイパームコイド表現型の原因二官能性遺伝子の解析を通じて報告される。FCAの4つの例が提示されています。ビデオは、それらの3、すなわちリジン、ペプチドグリカンと緊縮応答に焦点を当てます。

様々な機能相補分析に使用される菌株は、 表2に記載されています。 機能的相補性解析：L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL） E.大腸菌二重変異体AOH1（ΔDAPD :: Kan2、dapE6）は DAPE遺伝子の変異とDAPD遺伝子の完全な欠失（ <str...

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Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

生化学的経路に関与する酵素活性の検証は、機能的相補性分析（FCA）を用いて明らかにすることができます。アミノ酸は、細菌の緊縮応答および細菌ペプチドグリカン生合成の代謝に関与する酵素の酵素活性を示すFCAアッセイは本稿で説明します。

機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

functional-complementation-analysis-fca-laboratory-exercise-designed

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

17.6K ビュー.  Rochester Institute of Technology. 生化学的経路に関与する酵素活性の検証は、機能的相補性分析（FCA）を用いて明らかにすることができます。アミノ酸は、細菌の緊縮応答および細菌ペプチドグリカン生合成の代謝に関与する酵素の酵素活性を示すFCAアッセイは本稿で説明します。 

ビデオ: Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

生物学

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

二分子蛍光相補

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

運動時のエネルギーシステムの貢献を決定する

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...