この研究は、NSFキャリアグラント（MCB0954016）とDOEバイオエネルギー研究助成（DEFG0208ER64694）によってサポートされていました。

1。細胞培養（図1） <ol><li>微量元素、塩、ビタミン、および経路の調査に最適な特に標識された炭素基質と最少培地で細胞を成長させる。細胞培養用振盪フラスコまたはバイオリアクターのどちらかを使用してください。このような酵母エキスなどの有機栄養素は、アミノ酸の標識の測定に干渉する場合がありますので、培養液中に存在することはできません。 </li><li> UV /可視分光光度計で最適な波長（例えば、Cyanothece 51142のためのOD 730）での培養の光学密度によって細胞増殖を監視します。 </li><li>細胞は、最初の非標識培地で成長させることができる。中間対数増殖期の細胞が標識された培地の接種（ボリュームの接種率3％（v / v）の）のために使用することが好ましい。ラベルの付いた文化は、初期の接種から非標識炭素の導入を避けるために、同じラベル付けされた培地で（3％（v / v）の接種率）継代培養してください。 </li></ol><pクラス=&quot;jove_title&quot;&gt; 2。アミノ酸の抽出<ol><li>遠心分離（10分、8000 × g）で中間対数増殖期に収穫継代培養細胞（10ml）を。 </li><li> 6MのHCl 1.5mlのでペレットを再懸濁し、透明なガラス、スクリュートップGCバイアルに移します。バイアルにフタをし、アミノ酸にバイオマスのタンパク質を加水分解するために24時間100℃のオーブン中に置いてください。バイオマスのペレットの加水分解は、20共通のアミノ酸（図2）5の16を得ることができる。システインおよびトリプトファンが分解され、そしてグルタミンとアスパラギンは、それぞれ、グルタミン酸とアスパラギン酸に変換されます。 </li><li> 2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブを用いて5分間、20,000 × gでアミノ酸溶液を遠心し、その新しいGCバイアルに上清を移す。このステップでは、加水分解溶液に固体粒子を除去。 </li><li> GCバイアルの蓋を外し、サーモフィッシャーサイエンティアクティ-バップエバポレーター（注記を使用して空気の流れの下で完全に試料を乾燥：凍結乾燥機をもtを使用することができます。O乾燥試料）。この手順は一晩行うことができます。 </li></ol> 3。アミノ酸の誘導体化とGC - MSの条件アミノ酸やGCを経由して充電/高極性代謝物の分析は、これらの代謝物はアミノ酸は揮発性であり、ガスクロマトグラフィー2で分離できるように、誘導体化する必要があります。 <ol><li>テトラヒドロフランの150μL（THF）およびN -（tert -ブチルジメチルシリル）- N - methyltrifluoroacetamide誘導体化試薬を150μLと乾燥試料を溶解する。 </li><li> ℃で1時間は65と80の間にオーブンまたは水浴ですべてのサンプルをインキュベートする。バイアル内の代謝物が溶解されていることを確認するために時々ボルテックス。 </li><li> 10分間20,000 × gでサンプルを遠心し、新しいGCバイアルに上清を移す。上清は透明で黄色がかったソリューションでなければなりません。検出器の飽和のために、GC - MSの測定精度は高いconceによって影響を受ける可能性が注入TBDMS誘導体化アミノ酸（これらのサンプルはしばしば暗褐色の色を示す）のntrationは、したがって、我々は、GC - MS測定6日までにTHFを使用してこれらのサンプルを希釈してください。 </li><li> GC - MS（、注入量を1：05または1:10スプリット比を使用する= 1μL、キャリアガスヘリウム= 1.2 mL /分）でサンプルを分析する。以下のGCの温度プログラムを使用して150で保持し20℃で2分間、3の増加° C〜280分あたり° C、増° C〜300分ごとに° C、およびその後5分間保持する。溶剤遅延は〜5分（30メートルGCカラム用）として設定することができます。 MSの比（m / z）を充電するために質量の範囲は60から500の間で設定できます。 </li></ol> 4。 GC - MSデータの解析<ol><li> TBDMS誘導体化アミノ酸の測定は、GCの分離における同位体分別の影響を受ける可能性があります。光同位体は、GCカラムの同位体をつくよりも速く少し移動。電位測定の偏りを減らすために、我々は全体の質量スペクトルを平均化ができるアミノ酸のピーク範囲6 </li><li> TBDMS誘導体化代謝物のGCおよびMSスペクトルは、7の前に報告されている。各アミノ酸のためのGCの保持時間とユニークなm / zのピークが図3に示されています。 </li><li>アミノ酸または中央の代謝物の誘導体化は、13 C（1.13％）を含めて自然に標識された同位体のかなりの量、、18 O（0.20％）、29 Siの（4.70％）、および30のSi（3.09％）を紹介します。生の大量のアイソトポマーのスペクトルの自然同位体から測定ノイズが公開されたソフトウェア5、8を使用することで解決できます。最終的な同位体標識のデータは、質量分率、例えば、M 0、M 1、M 2、M 3およびM 4として報告されている（0から4個の13 C標識された炭素を含むフラグメントを表す）。 </li><li> 2 - オキソ - グルタル：アミノ酸の測定は、8つの重要な前駆体の代謝物に関する同位体標識の情報を提供することができます3 - P -グリセリン、アセチル- CoA、エリスロース- 4 - P、オキサロ酢酸、ホスホエノール、ピルビン酸、およびリボース-5 - P、食べた。これらの代謝物の標識パターンはいくつかの中心的な代謝経路（図2）9を識別するために使用することができます。標識実験の結果は、さらに他の生化学の方法（例えば、RT - PCR）を用いて確認することができます。 </li></ol> 5。標識したアミノ酸のデータを用いて経路解析うまく設計された13 Cトレーサー実験から生産のみ、いくつかの重要なアミノ酸を調べることにより、我々は全体の中央代謝の洗練された13 C -代謝フラックスの分析を行うことなく、いくつかのユニークな経路や酵素活性が明らかになることがある。 <ol><li> Entner - Doudoroff経路：[1 - 13 C]グルコースを炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、セリンのラベリングは、アラニン10でラベリングよりもかなり低くなります。 </li><li>分岐したTCAサイクル：[1 - 13 C]ピルビン酸は、炭素源として使用することができます。 TCAサイクルが壊れている場合は、グルタミン酸が1つの炭素11、12で標識されている間、アスパラギン酸は、二つの炭素で標識することができる。 </li><li>炭素基板を両方の炭素源として使用されるCO 2以外の標識と標識：混合栄養代謝のカルビン-ベンソン- BasshamサイクルによるCO 2固定。カルビンサイクルが機能している場合、セリンとヒスチジン標識は、大幅に他のアミノ酸に比較し、希釈される。有機炭素源は、媒体13に存在するときにこのような方法は、相対的CO 2固定を決定することができます。 </li><li>酸化的ペントースリン酸経路：[1 - 13 C]グルコースを炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、非標識アラニンは、&gt; 50％12になります。 </li><li>アナプレロティック経路（例えば、PEP + CO 2 àのオキサロ酢酸）：13 CO 2および非標識炭素基質（例えば、グリセロールまたはピリジンuvate）を炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、アスパラギン酸の標識は大幅にアラニンに比較し、13セリン、濃縮されます。 </li><li> 再クエン酸シンターゼ：[1 - 13 C]ピルビン酸を炭素源として使用することができます。酵素がアクティブな場合、グルタミン酸は、β-カルボキシル基3、4にラベルが付いています。 </li><li> Citramalate経路：[1 - 13 C]ピルビン酸、[2 - 13 C]グリセロール、または[1 - 13 C]酢酸を炭素源として使用することができます。経路がアクティブになっている場合は、ロイシン、イソロイシンの標識量は14と同じです。 </li><li>セリン-イソクエン酸リアーゼサイクル：[1 - 13 C]ピルビン酸または[1 - 13 C]乳酸は、炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、セリンの3位の炭素は15というラベルが付けられます。 </li><li>栄養素の利用率（すなわち、外因性アミノ酸）：完全にラベルの付いた炭素基質および非標識アミノ酸を含む培地使用することができます。細胞が選択的にこれらの補足の非標識の栄養素を利用するのなら、我々は、バイオマス中のこれらのアミノ酸の重要なラベリングの希釈が表示されます。このメソッドは、栄養補助食品は、セル16に好まれている調査するために使用することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果最近のバイオエネルギーの研究は、バイオエネルギーの生産とCO 2のキャプチャのための新規光合成微生物を使用して利益を復活している。中央代謝経路の生化学的な知識が十分な根拠がないので、過去数年間で、先進的な13C -代謝フラックス解析（13C - MFA）を含むかなりの数の13C -代謝分析は、、、光合成細菌において中心的な代謝を調査するために適用されているこれら以外のモデル生物10、11、17〜20インチここで、我々はCyanothece 51142 21の代替イソロイシン経路の発見の例を示す。 シアンothece 51142は、典型的なイソロイシン合成経路において、2 - ketobutyrateにスレオニンの変換を触媒する酵素（EC 4.3.1.19、スレオニンアンモニア-リアーゼが）、含まれていません。イソロイシン経路を解決するために、我々は54 mMのグリセロール（2 - 13C、&gt; 98％）とASP2媒体22にCyanothece 51142（20 mL）を成長する。Cyanothece 51142は、主な炭素源としてグリセロール標識した第2の位置を利用しています。イソロイシンの3つの炭素で標識されている間私達は、スレオニンとアラニンが一炭素のラベルがついたことを確認します。したがって、Cyanothece 51142の合成は、ほとんどの生物（図4）で採用されているスレオニン経路から派生させることはできません。一方、ロイシン、イソロイシンは、フラグメントに基づいて、同一の標識パターンを持つ（M - 15）+とフラグメント（M - 159）+。例えば、[M - 15] +（フラグメント化されていないアミノ酸を含む）からのアイソトポマーのデータは、ロイシンに対して同一のラベル（M0 = 0.01、M1 = 0.03、M2 = 0.21、M3 = 0を示す0.69）とイソロイシン（M0 = 0.01、M1 = 0.03、M2 = 0.24、M3 = 0.67）。したがって、ロイシン、イソロイシンは、同じ前駆体（すなわち、ピルビン酸、アセチルCoA）から合成されている必要があります。この観察は、イソロイシン合成のためのcitramalate経路中の標識炭素の移行と一貫性です。この経路を確認するために、我々は共同ゲノム研究所のデータベースを検索しCyanotheceでcitramalateシンターゼシーマ （cce_0248）の存在を見つける。 <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="図1"/> 図1 13 C -アシストパスウェイ解析の手順。 <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。その代謝前駆体の標識パターンを取得するために使用されるアミノ酸。 ACoA、アセチルCoA、AKG、α-ケトグルタル酸、C5P、リボース5 - リン酸、CIT、クエン酸、E4P、エリスロース4 - リン酸、G6P、グルコース-6 - リン酸、OAA、<html>オキサロ酢酸、PEP、ホスホエノールピルビン酸、PGA、3 - ホス、PYR、ピルビン酸。 <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。16個のアミノ酸のためのGCピーク。アミノ酸のαカルボキシル基を欠いている全アミノ酸、及び（M - 159）+を含む、（M - 57）+：TBDMS誘導体化アミノ酸は、二つのフラグメントにMSによってクラックされています。ロイシンとイソロイシンの場合は、（M - 57）+は、他の質量ピークが重なっていた。我々は、全アミノ酸の標識を分析するフラグメントを（M - 15）+使用することをお勧めします。 （F302）+グループは、アミノ酸のバックボーン内の最初の（α-カルボキシル基）と第二の炭素を含む、ほとんどのアミノ酸で検出される。このMSピークはしばしば高いノイズ対信号比を持っているので、（F302）+することは定量的な代謝フラックス7を分析するために推奨されていません。 igure 4&quot;/&gt; 図4。Cyanothece 51142（前報から変更）21イソロイシン経路の遷移のラベル付け。

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calvin+cycle+flux,+pathway+constraints,+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria.">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li><li>Erb, T. 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利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、標識基質を細胞に供給し、GC - MSを経由してアミノ酸に生じる同位体標識パターンを測定することで構成されています。 MSデータ（m / zの比）がちょうどMSイオンのラベリングの全体的な量を与えるので、我々は両方の断片化されていないのm / zの比（M - 57）+を調べて、断片化されたアミノ酸でアミノ酸のアイソトポマーの分布を評価する必要があります（?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td>標識された炭素基板</td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ</td><td>実験的な要件に依存する</td><td>ウェブサイト： <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフ</td><td>アジレントテクノロジー</td><td> Hewlett - Packard社、モデル7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GCカラム </td><td> J＆Wサイエンティフィック、フォルサム、カリフォルニア州</td><td> DB5（30メートル） </td><td> - </td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>アジレントテクノロジー</td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td>アクティ-バップEvaporator </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> TS - 18825 </td><td>アミノ酸試料を乾燥するための</td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

微生物は、生化学と機能ゲノミクス手法を用いて検討することができる複雑な代謝経路を持っている。セル中央の代謝を検討し、新しい酵素を発見する一つの重要な技術は、13 C -アシスト代謝の分析1です。この手法は、微生物が13 C標識基質が供給されるという同位体標識に基づいています。生化学ネットワークにおける代謝物との間の原子の遷移パスをトレースすることで、我々は機能的な経路を決定し、新しい酵素を発見することができます。 トランスクリプトミクスとプロテオミクスを補完する方法としては、代謝経路のアイソトポマー支援分析のためのアプローチは3つの主要手順2を含んでいます。 まず 、我々は13 C標識基質と細胞を成長させる。このステップでは、培地の組成および標識基質の選択は2つの重要な要因です。栄養補助食品の非標識炭素から測定ノイズを避けるために、唯一の炭素源と最少培地が必要です。さらに、標識された基質の選択は、それが分析されている経路を解明する方法を効果的に基づいています。小説の酵素は、しばしば別の反応の立体化学や中間製品を含むので、一般的に、単独で標識された炭素の基質は、新規の経路3,4の検出のための均一標識したものよりも小説の経路を検出するための、より有益である。 第二 ​​に 、我々は、GCを使用して、アミノ酸の標識パターンを分析する- MS。アミノ酸は、タンパク質が豊富ですので、バイオマスの加水分解から得ることができる。アミノ酸は、GCの分離の前にN -（tert -ブチルジメチルシリル）- N - methyltrifluoroacetamide（TBDMS）で誘導体化することができる。 TBDMS誘導体化アミノ酸は、MSとのフラグメントの異なる配列の結果によって分割されることがあります。断片化と断片化されていないアミノ酸の電荷（m / z）比質量に基づいて、我々は、中央代謝の可能性というラベルの付いたパターンを推測することができますアミノ酸の前駆体。 第三に 、我々はこれらの経路が2アクティブであるかどうかを確認、アイソトポマーのデータに基づいて、提案された経路で13C炭素の遷移をトレースします。アミノ酸の測定は、中央代謝八重要な前駆体の代謝物に関する同位体標識の情報を提供します。これらの代謝キーのノードは、関連付けられている中心的な経路の機能を反映することができます。 タンパク質構成アミノ酸を介した13 C -アシスト代謝分析は広く特徴のあまりない微生物代謝1の機能解析に使用することができます。このプロトコルでは、我々は新たな酵素機能を発見するためのラベルの付いた炭素基質の使用方法を示すためのモデル株としてCyanothece 51142を使用します。

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Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C -同位体標識は、微生物の様々なタイプの細胞の中央代謝を決定するための便利なテクニックです。細胞が特異的な標識基質で培養された後、GC - MS測定では、タンパク質構成アミノ酸のユニークな標識パターンに基づいて、機能的な代謝経路を明らかにすることができます。

スルー代謝経路の確認と発見 13</supタンパク質構成アミノ酸の> C標識

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

24.1K ビュー.  Washington University. 13 C -同位体標識は、微生物の様々なタイプの細胞の中央代謝を決定するための便利なテクニックです。細胞が特異的な標識基質で培養された後、GC - MS測定では、タンパク質構成アミノ酸のユニークな標識パターンに基づいて、機能的な代謝経路を明らかにすることができます。

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

生物学

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

ワンステップのメタボロミクス：炭水化物、1つの手続きが定量化された有機とアミノ酸

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

タンパク質 - タンパク質相互作用の阻害剤の開発を通じてREPLACE：アプリケーションの設計と開発非ATP競合CDK阻害剤に

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

使用モデルタンパク質への非標準アミノ酸の残基特異的取り込み<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;無細胞転写翻訳システム

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

スルー代謝経路の確認と発見 13 C標識

スルー代謝経路の確認と発見^{13 C標識}