ITSN、このプロトコルで使用されるPI3K -C2β、およびコントロールベクターは、非商用目的のみのため、ご要望に応じて、著者から入手できます。著者は、親切にアドバイスとオブライアンの実験室でBiFCプロトコルの確立に使用される試薬を提供するために博士はチャントウ胡を認識したい。カーは、財団ジェロームルジューンからの資金によってサポートされていました。オブライアンの実験室での作業は、NIH（HL090651）、DOD（PR080428）、聖剣帯の財団、及び財団ジェロームルジューンからの補助金によってサポートされています。

A. BiFCキャリブレーション<ol><li> 蛍光体を選択してください。BiFC融合パートナー（表1）としてうまく機能などYFPや金星など、複数の蛍光体が、、ある。 YFP BiFCフラグメントは蛍光体の形成2を容易にするために30℃でプレインキュベーションを必要としながら金星のアミノおよびカルボキシ末端の末端は、37℃での複合体を形成することが可能です。低い温度でこのインキュベーションは、いくつかの細胞プロセスを変更することがありますし、フラグメントを選択する際に考慮する必要があります。タンパク質のカルボキシ末端に融合させる金星のためのベクターは、Addgene（から入手できます<a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> 、コントロールとして使用するための構造体が追加、などと一緒に、seepBiFC - VN173とpBiFC - VC155） <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a>とpBiFC - bFosVC155 2。アミノ末端金星のベクトル（pFLAG - VN173およびPHA - VC155）を含む追加のベクトルは、、以下のサイトから入手できます。 <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/〜HU1 /</a> 。 </li><li> 目的のタンパク質にタグを付ける。BiFC断片が候補タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端の末端に融合されています。いくつかのタンパク質は、タンパク質の機能の破壊が原因でどちらかの端にタグ付けを可能にしない場合があります。例えば、GTPアーゼのRasスーパーファミリーの多くのメンバーは、その端にBiFCフラグメントの添付ファイルを排除ので、カルボキシ末端に脂質を変更されます。従って、BiFCフラグメントの添付ファイルは目的のタンパク質の機能に影響を与える可能性のある方法のいくつかのアイデアを持っていることが重要です。それは蛋白質がどう影響するかタギング不明な点などがその機能を複数の組み合わせをテストする必要があります。 BiFC断片に加えて、ペプチドリンカーは、断片化された蛍光団との候補タンパク質の間に柔軟性を高めるために含めることができます。十分な柔軟性を提供することができる短いアミノ酸のストレッチをエンコードBiFCベクトルのマルチクローニングサイト（MCS）一方で、RSIAT、KQKVMNH、およびRPACKIPNDLKQKVMNHリンカーはBiFC実験3,9で正常に使用されている</li><li> トランスフェクション条件を決定します。複数の変異をテストする前に、いくつかの制御実験を行う必要があります。試行すべき最初の二つBiFCの組み合わせは、対話と相互作用しない1つの野生型と変異することが知られている2つの野生型タンパク質である。これらの2つの組み合わせを使用して、DNAとトランスフェクション時間の異なる量は、候補タンパク質のBiFC信号を検出するための最適条件を決定するためにテストする必要があります。我々は、6ウェルディッシュのほか、単一のために各BiFC構造の0.25ug、0.5ug、1.0ugをテスト示唆している。信号の開発のための最適な時間を決定するために蛍光顕微鏡法によるトランスフェクションモニター細胞の翌日。 <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a>とpBiFC - bFosVC155 2の構造はBiFCのための有用なポジティブコントロールであるとAddgene（上記参照）から入手できます。さらに、ウエスタンブロット分析は、構造の同じ表現を確認するために実行する必要があります。条件は、蛍光シグナルは、2つの野生型タンパク質の間に観察されているが、無信号にはほとんどが野生型と変異体タンパク質との間で観察されるように選択しなければなりません。最後に、これは非特異的な相互作用を防ぐために、可能な限り低くタンパク質の発現を維持するのが最善です。 </li><li> BiFCフラグメントの添加は、目的タンパク質の局在を変化させるかどうかを調べます。各BiFC構造はどちらHAまたはFLAGエピトープタグを含む。免疫染色では、HAまたはFLAGエピトープタグと同様にBiFCタグが目的タンパク質の局在に影響を与えるかどうかを判断するためにも内因性タンパク質（可能な場合）の両方の細胞をtransefected。 </li></ol>セルのB.播種とトランスフェクション<ol><li> COS細胞（1.3 × 5）1つのグラスの底Matekプレートおよびサンプルあたり6ウェルプレートの2ウェル上、それぞれのメッキが施されています。細胞は一晩37℃を解決することができます関心の候補タンパク質に関連性の高い代替細胞型を使用してもよい。 </li><li>トランスフェクション用のDNAを準備します。我々は通常、COSのトランスフェクションのためにリポフェクトアミン（Invitrogen）を利用する。しかし、他の試薬は、関心の細胞株に対してより適切かもしれない。トランスフェクション混合物を1つのグラスの底皿と6ウェルプレートの2ウェルの間で分割されるので、この区分を考慮してDNAの適当な量を使用してください。無血清（SF）DMEMの250uLでDNAを希釈する。トランスフェクションのコントロールとして合計BiFCのD​​NAの1 / 5量でCFPを追加。 BiFC定量では、CFPのために陽性の細胞のみがBiFC信号の存在について分析されます。したがって、代替のトランスフェクションのコントロールを、CFPのスペクトルは、表1のBiFCペアの一部と重なることに注意してください多分必要。 250uL SF DMEM（DNAの10uL Lipofectamine/1ug）にリポフェクタミンを希釈する。 DNAとリポフェクトアミンの希釈液を混ぜる。 20分室温でインキュベートする。 注：リポフェクタミン：DNA比は細胞の種類によって異なりますができます。興味の細胞株に適したトランスフェクション法を使用してください。 </li><li>暖かいSF DMEMで2倍の細胞をすすいでください。各グラスの底板または同様の6ウェルディッシュにSF DMEMの2mLのを追加。 </li><li>のガラスボトムディッシュ、6ウェルディッシュの二つの井戸間で均等にそれぞれのトランスフェクション混合物を分割する。 </li><li> 5時間、37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>トランスフェクションのメディアを取り出して、（DMEM +10％FBS）の完全なメディアと交換してください。 </li><li> 37℃で一晩細胞をインキュベート℃をインキュベーション以下のトランスフェクションの長さは、目的のタンパク質の発現レベルによって異なります。このステップは経験的に決定する必要があるので、長時間のインキュベーションでは、非特異的な相互作用が発生する可能性があります。 </li></ol>イメージングのための細胞のC.の準備<ol><li>細胞は、最初に陽性コントロールが蛍光であることを保証する落射蛍光顕微鏡で検査されています。そうでない場合、それはシグナルが観察されるまで37℃で細胞をさらに時間を許可する必要があるかもしれません。 </li><li> PBS（pH7.4）で3倍の細胞をすすいでください。ガラスボトムディッシュ中の細胞に2％のパラホルムアルデヒド（pH7.4）を加える。氷上で10分間細胞を固定する。 PBS（pH7.4）で3倍の細胞をすすいでください。 4℃店舗細胞° C 1mLのPBS（pH7.4）で覆われた。細胞は、イメージングのために固定する必要はありませんが、一度BiFCの断片をそのまま蛍光団を改革し、それはこのようにダイナミックな相互作用3の解析を防止する不可逆的です。また、未固定の細胞が信号を開発し続けることに留意してください。 6ウェルディッシュに細胞を溶解し、ウェスタンブロット解析のためにライセートを準備。溶解した細胞は、撮像された細胞の代表になるように、すべてのセルが同時に準備されていることが重要です。 </li></ol> D.イメージング細胞<ol><li>蛍光強度は細胞ごとに計算されます。画像個々のセルにしてください。 </li><li> CFPは、トランスフェクションのコントロールとして含まれていたとだけCFP陽性細胞がBiFC信号の分析のために選択されています。我々は、セルがCFPをトランスフェクトされている場合、それはまたBiFC構築物でトランスフェクトされていることを前提にしてください。このアプローチは、BiFC信号を欠いている画像化された細胞は、目的のタンパク質ではなく、一つの欠如に起因またはそのセルの両方BiFC発現コンストラクトとの間の相互作用の欠如に起因する負であることを保証します。 </li><li>我々は、細胞イメージングのためのツァイスLSM 510共焦点顕微鏡を使用してください。この顕微鏡を使用するときにはズーム、ピンホール、検出器のゲイン、アンプのオフセット、フレームサイズ、走査速度、スキャンの平均、およびレーザパワーの一貫性を保つことが重要です。あらゆるイメージングシステムを使用する場合には、蛍光がサンプル間で比較可能となるように設定を一定に保つことが重要です。また、蛍光を定量するとき、それは、ピクセルが飽和していないことが重要です。 </li></ol>蛍光を定量化するE. <ol><li>蛍光は、任意の画像処理ソフトウェアを用いて定量することができます。私たちは、NIH（http://rsb.info.nih.gov/ij/）から自由に利用可能であるImageJを利用する。 ImageJのにイメージファイルを開きます。 AnalyzeSet​​測定に進みます。エリアのチェックボックスをオンにし、測定ボックス内のグレー値を平均。 </li><li> &quot;フリーハンド選択&quot;ツールを使用して、CFPのチャネルの全体のセルのエッジの周りにアウトラインを描きます。 </li><li>場所にこのアウトラインを残し、YFPチャンネルにシフト。 AnalyzeMeasureに移動します。 平均グレー値は、ピクセルの数（すなわち、セルの面積あたりの平均蛍光強度）で割って選択範囲のすべてのピクセルのグレー値の合計です。 </li><li>イメージごとにセルが含まれていない地域においてYFPチャンネルで円を描画します。背景として、この領域の測定を行う。それぞれの画像から背景を引きます。 </li><li>平均的な一つのサンプルで結像されるすべてのセルの背景マイナス平均グレー値。これは、細胞の集団の平均蛍光強度になります。我々は3つの実験上の約60の細胞を定量することが示唆している。 </li></ol> F.代表の結果： 私たちの研究室では、複数の生化学的およびシグナル伝達経路10,11,12,13,14を規制する多くのタンパク質と相互作用する複数のドメイン足場タンパク質、intersectin（ITSN）に焦点を当てています。 ITSNは2つのEps15相同性（EH）ドメイン、コイルドコイル状の地域、および5つのSrcホモロジー3（SH3）ドメインが含まれています。 ITSNの長いアイソフォームもDBLホモロジー（DH）およびCdc42 15グアニンヌクレオチド交換因子としてコンサートのプレクストリン相同（PH）ドメインをその行為が含まれています。このモジュラー構造は、タンパク質促進：タンパク質間相互作用をしBiFC実験のための理想的な候補をITSNです。 ITSNの細胞内局在は、その結合パートナーを変えるため、ITSN（unpublisによって規制経路を変更することができますHEDデータ）。最近、私たちの研究室では、ITSNはPI3K -C2β11、小説クラスII PI3Kの調節を介してニューロンの生存を調節することが実証されています。 PI3K -C2βのアミノ末端プロリッチドメインは、ITSNのSH3ドメインの2つの結合部位が含まれています。 ITSNとPI3K -C2β切断型変異体との共免疫沈降法を用いて、我々は、ITSNのSH3AとSH3Cドメインは、PI3K -C2βのアミノ末端領域と相互作用することを示した。次に、我々はこの複合体の細胞内局在を可視化するBiFC使用。 ITSNは金星（PHA - VC155）のカルボキシ末端に融合金星（pFLAG - VN173）とPI3K -C2β構造のアミノ末端に融合されました。別のネガティブコントロールとして、非特異的なペプチドは、PHA - VC155に融合した。 VN - ITSNとVC - PI3K -C2βは、句読点の分布（図2A、上部のパネル）でBiFC複合体を形成。 ITSNとPI3K -C2βの共沈を混乱させるPI3K -C2βのプロが豊富なドメインの変異はBiFC信号（図2A、下のパネル）11に減少。 ITSN二PI3K -C2βタンパク質間のBiFC信号の差は、蛋白質の発現の違い（図2B）によるものではなかった。 <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 BiFCでは、蛍光体（この場合は金星は）（VN）アミノ酸に分割されます-とカルボキシ（VC）端子が終了。これらの目的は、関心のある2つのタンパク質に融合されています。 2つのタンパク質が相互作用する場合、VNとVCの断片が再アソシエートの相互作用部位と蛍光団と蛍光の再構成をもたらす。タンパク質相互作用5：BiFCは蛋白質を測定するために使用される蛋白質の断片の相補アッセイ（PCA）の具体例です。 <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。ITSNとPI3K -C2βフォームBiFC複雑。 A. VN -タグ付きITSNは、VC -タグ付きPI3K -C3βWTまたはプロリンリッチドメイン変異体（PI3K -C2β- PA）と共同tranfectedした。 ITSNとWT PI3K -C2βフォーム複合体（緑）。 CFP（赤）ウエスタンブロット法は構造の等しい発現を実証するために実行されたトランスフェクションコントロールB.として使用されていました。 VC -タグ付きのコンストラクトは、HAタグ付けされています。 <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="表1" /> 表1。BiFCと互換性のある複数のベクトルがあります。 YN155：YFPの1 - 155aa、YC155：YFPの155 - 238aa、YN173：YFPの1 - 172aa、YFPのYC173、173 - 238aa、VN155：金星の1 - 154aa、VC155：金星の155から238、VN173：金星の1 - 172aa、VC173：金星の173 - 238aa、CN155 CFPの1 - 154aa、CC155 CFPの155 - 238aa、GN173：GFPの1 - 172aa、CitN155：シトリンの1 - 155aa、CitC155：155 - 238aaシトリン、CitN173：シトリン、CitC173の1 - 172aa：シトリン、CerN173の173 - 238aa：セルリアン2,3,9の1 - 172aa。

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞全体のタンパク質の相互作用およびこれらの複合体の細胞内局在を決定する：BiFCは、タンパク質を可視化するための優れた方法です。 BiFCの利点は唯一相互作用するタンパク質は、蛍光、過渡的な相互作用が安定しているか、および画像データの後処理が最小である。ということですこのメソッドの2つの欠点は、蛍光団と蛍光団複合体の不可逆性のための成熟の時間です。一部のアプリ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

シグナル伝達複合体の細胞内分布を定義すると、その複合体からの出力を理解する上で不可欠です。 このような免疫沈降などの従来の方法は、複合体の空間的局在に関する情報を提供していません。対照的に、BiFCはタンパク質複合体の相互作用と細胞内局在を監視します。この方法では、fluororescentタンパク質は、関心のある2つのタンパク質に融合されているアミノおよびカルボキシ末端に非蛍光フラグメントに分割されます。蛍光体の再構成におけるタンパク質の結果の相互作用（図1）1,2。 BiFCの制限は、断片化された蛍光体が再構成されると、複雑な3不可逆であるということです。この制限は、一時的または弱い相互作用を検出するのに有利であるが、複雑なダイナミクスの動態解析を排除する。追加の注意点は、再構成されたflourophoreが再びリアルタイムの相互作用4の観察を排除、成熟し、蛍光を発するために30分必要があるということです。タンパク質相互作用5,6：BiFCはそのような緑色蛍光タンパク質変異などのレポータータンパク質（BiFC）、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、および蛋白質を測定するルシフェラーゼを採用した蛋白質フラグメントの相補アッセイ（PCA）の具体例です。蛋白質研究するために代替方法：細胞内のタンパク質の相互作用は、蛍光共局在し、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）7が含まれています。共局在のために、二つのタンパク質は、個別に直接蛍光体でまたは間接蛍光抗体のいずれかによってタグ付けされます。しかし、このアプローチは、それが困難な共局在のデータを解釈すること、非相互作用するタンパク質の高いバックグラウンドにつながります。さらに、共焦点顕微鏡の分解能の限界のため、2つのタンパク質は必ずしも相互に作用することなく、共局在表示されることがあります。興味のある2つのタンパク質が相互作用するときBiFCで、蛍光のみが観察される。タンパク質相互作用が、技術的に挑戦することができます：FRETはタンパク質を研究するための別の優れた方法です。 FRETの実験では、ドナーとアクセプターは、細胞内で同様の明るさと化学量論であることが必要です。さらに、一つはアクセプターチャネルとその逆にドナーの通過ブ​​リードを考慮する必要があります。 FRETのとは異なり、BiFCは、画像データの少ないバックグラウンド蛍光、少し後処理を有し、高い過剰発現を必要とせず、弱または一時的な相互作用を検出することができます。生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）はドナーがそれによって刺激的なアクセプター発光になるために基質を触媒する酵素（例えばルシフェラーゼ）であることを除いてFRETを同様の方法です。 BRETは、スルーブリードの技術的な問題や高いバックグラウンドの蛍光を欠いていることもありましたが、特定のコンパートメント8〜基板の局在の欠如に空間的な情報を提供する能力を欠いている。全体的に、BiFCは区分シグナリングへの洞察を得るためにタンパク質複合体の細胞内局在を可視化するための優れた方法です。

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Bimolecular Fluorescence Complementation

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。

二分子蛍光相補

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K ビュー.  University of Illinois at Chicago. タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。

ビデオ: Bimolecular Fluorescence Complementation

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

生物学

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

蛍光パターンを調査するための凍結セクショニング酵母コミュニティ

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...