This work was supported by NIH Grant HL-113905

この研究のために行うすべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針に従ってにノバサウスイースタン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された、 第 8版（国立アカデミープレス、ワシントン、DC、2011 ）。 受容体オートラジオグラフィーのために1.準備組織切片<ol><li>犠牲時に、収穫の新鮮な脳組織、できるだけ早く-20℃の冷凍庫にアルミ箔と場所で包みます。 20°Cの冷凍庫 - 正しい形状を維持するために、頭蓋骨の内側をシミュレートする脳の金型内の場所の脳は、アルミニウム箔と場所で包みます。 30分後、プレースシール可能な冷凍保存用バッグ内の組織とは、長期保存のために-80℃の冷凍庫に移動します。 <ol><li> -80 -10℃と-18℃の最大値の最小値に設定し、クライオスタットのC冷凍庫、転送°、回避するための解凍から関心のある新鮮凍結組織標本を入手します。 </li&gt; <li>唯一の媒体への試料のごく一部を埋め込む、メディアを埋め込むグリコールおよび樹脂系でマウント組織上に試料を置きます。脳のために、脳は前頭面で切片有効にするために垂直に装着されています。 </li></ol></li><li>組織は、クライオスタット内ミクロトーム上にマウント置き、しっかりと所定の位置に締めてください。背腹軸が垂直に一般的に使用するための脳のアトラスであることを同じ前 - postero座標である脳の左右を確認し、。 </li><li>スライド内のスペースのより大きな表面積を持つように垂直方向にスライド所望の厚さ（推奨さ20μm）での切断を開始し、顕微鏡上にセクションをマウント解凍。スライドの最初のセット、すなわち、5の連続セットでスライド上のセクションを収集1-1、1-2、1-3、1-4を標識し、1-5（ 図3）されています。 </li><li>切片とスライドのセットを充填した後、最大1時間空気乾燥さスライドを可能にし、SLIを配置デ自己シール冷凍保存バッグプラスチックスライドボックスで、-20℃で保存。 </li></ol> 2.受容体オートラジオグラフィー注意：放射能。放射能を処理するために、保護服装を使用してください。処分は、設立に依存され、かつ適切に崩壊（半減期60日）または認証取得企業によってピックアップされるガイドラインに従わなければなりません。 <ol><li> （ 図5）を -20℃冷凍庫から興味のある「-2」「-1」とスライドを外し、スライドグリップに取り付けます。一緒に「非特異的」治療のための「-1」のスライド、および「合計」治療のための「-2」のスライドをマウントします。バインディングjarはわずか10が含まれます、「合計」を（ 表1） &#39; を非特異的」jarは2 R拮抗薬AT PD12331910μMの最終濃度で含有し、アッセイ培地緩衝液中で、1 R拮抗薬AT（AM5）をロサルタンAM5でμMPD123319。 </li><li>スライドを反転グリップは、室温で30分間AM5 35〜40 mlを充填したプレインキュベーションコプリンジャーにスライドし、それぞれの阻害剤を配置します。それらのプレインキュベーション浴内の後続のセットは、4分間隔で開始します。 </li><li>すぐに部屋で60から90分間、10 AM5のミリリットルに加え、それぞれの阻害剤を用いた（ 図4で計算された）125 I-SI-のAng IIの所定の濃度を含む、インキュベーションスライドメーラーへのプレインキュベーション溶液からスライドを転送します温度。十分な放射性リガンドがある場合は、10スライドが変更されたスライドグリップに（背中合わせに）配置し、コプリンジャーで125 I-SI-のAng IIでインキュベートすることができます。 </li><li>場所は、（必要な場合）、ブロットは、ゆっくり2別々の容器に蒸留水400ミリリットルで1〜2秒間旋回によりすすぎスライドグリップに戻ってスライドします。 </li><li> 図4に示すように、&lt;（正確に1分間ずつ順次AM5 35〜40 mlを含む4コプリンジャーにスライドを移し/強いです&gt;）。 </li><li>最後の1分リンスした後、軽く氷冷蒸留水の4変化で1-2秒間のセクションを旋回。 </li><li>涼しい空気とスライドを乾燥さ-ブロー（注意：熱い空気が放射性化合物を揮発さ）（ 図5）4分間異なる角度から設定4ヘアドライヤーを使用して、すべてのセクションが乾燥しているまで、ペーパータオルの上に置きます。 </li><li>マウントは、組織が両面テープを使用して、X線フィルムに並置するために段ボールの上に上に向けてスライドします。 </li><li>マウント各段ボールの上に少なくとも1、125ヨウ素のキャリブレーション標準のスライド（ 図6）。 注：キャリブレーション基準は徹底的に脳切片と同じ厚さに切断し、顕微鏡上に解凍マウントしクライオスタットある1ミリリットルツベルクリン注射器で遠心分離により圧縮フェノール環を含む化合物に結合した125ヨウ素と混合脳ペーストで構成されスライド。また、125 I較正標準で20μmの厚さで切片可塑性樹脂は、商業的に得ることができます。これらの規格でプラスチック樹脂は、部分的に40％〜の組織等価は、キャリブレーションに考慮されるべきであるように、放射線からフィルムを保護します。 </li></ol> 3.フィルムの露光、現像<ol><li>ストラップバックX線カセットおよびオートラジオグラフィーフィルムと暗室に進んでください。カセットを開き、内側スライド（ 図6）とのダンボールを置きます。 <ol><li>ライトをオフにして、セーフライトをオンにします。慎重に1膜を除去し、カセット内のスライドの上に（右下隅にギザギザのエッジに）フィルム光沢面を配置し、X線フィルムのボックスを開きます。慎重にカセットを閉じて、光（ 図6）を出て密封するためにロッキングバーをねじります。 -20℃で数日から数週間のためのスライドを公開します。 </li></ol></li><li>暗室では、カセットを開き、フィルム開発のprocを進めますESS。 <ol><li>連続してトレイにスライドを置きます。 2分、30秒、5％氷酢酸を含有する水、及び5分間定着用現像剤。フィルムはせいぜい10秒Photofloに入れ、ハングした後、20分間流水でトレイに配置されます。 低い結合を有する領域から測定可能な信号を得るために十分な長さではなく、あまりにも長い間高い結合を有する領域によってフィルムを飽和するよう：露光時間は、経験的に決定され、異なる露光時間で複数の膜を含むことができる：注意してください。許容可能な露光が得られたら、次の手順に進みます。 </li></ol></li></ol> 4.組織学<ol><li>チオニン染色および染色試薬（ 表2、 図7）を準備します。 <ol><li>スライドラックに「-3」のスライドを置き、1分間脱イオン水で始まる順番に転送は、その後10分間チオニン染色液には消孤に3ディップが続きます化された水、脱イオン水で1 30秒間洗浄。 </li><li>水に続いて、次のようにエタノール洗浄にスライドラックを置きます。 50％、70％、および30秒間90％は、1分ごとに100％エタノールで2回洗浄しました。最後に、5分間の第二のキシレン溶液に渡って転送した後、3分間キシレンにスライドラックを配置します。 </li></ol></li><li>最後のキシレン浴から一度に一つのスライドを削除し、有機溶剤封入剤中の樹脂をベースとするスライドの上縁をカバーし、スライド上に24ミリメートル×60ミリメートルカバースリップを配置。スライドは十分に乾燥〜48時間、その後、2400 dpiのグレースケールでコンピューターにスキャンすることができます。 </li></ol> 5.濃度測定の画像解析<ol><li>左下隅にあるギザギザのエッジに、フィルム光沢面を下に置き、イメージングシステムのコンピュータ内の任意の歪みのない膜密度情報を送信することができる独自のスキャナを使用してスキャンします。 </li><li>独自のイメージングsysを開きます。フィルム（ - 12 図9）上の画像の今後の濃度分析のためのキャリブレーション標準を確立するために、キャリブレーションバーをTEM及び利用します。 </li><li>テンプレートを確立するか、経験的に関心のある分野を概説いずれかによって関心のある分野を測定します。データは、対照または野生型（セクション）、および領域のいずれかを収集し、フィルムに基づいて分離されます。密度（fmolの/ g）を、走査領域、および測定における総ターゲット領域（ 図9）を必ず含めてください。 <ol><li>関心領域は、強調表示のパラメータ（ 図10）の間に入ることを保証することにより、スキャンエリアバーを調整します。 </li><li>スプレッドシートへのデータのエクスポート（ 表4）。密度時間全体目標面積を掛け、その特定の領域の結合のための値を得るために、スキャン面積で割ます。これは測定されたすべての値に完了すると、特定の結合Pを生成するために合計から設立された非固有の基質憤慨。平均は、これらの値に対して実行されてもよいです。 </li></ol></li></ol>

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

説明されたプロトコルは、齧歯類脳以前に採取し、-80℃で保存の冠状切片の隣接するセクションでの放射性リガンドの結合を「合計」及び「非特異的」の視覚化を識別し、実質的にすべての組織に容易に適用することができること解剖学的に受容体または放射性リガンド結合部位の差分量を表示する下部構造を解決しました。プロトコル内で説明する手順は簡単で、分析は結果を正しく解釈?...

心血管疾患は2011年1米国における死因の30％以上を引き起こし、米国における死亡および障害の主要な原因であり続けています。米国心臓協会からの最新の統計が3で複数の人が1を持っていることを示しています心血管疾患の種類以上。心血管研究は、この疾患の理解に対して、引き続き注力していきますが、世代が高齢になっ始めると、これらの努力を継続することが不可欠です。レニン-アンギオテンシン系（RAS）は、主として、アテローム性動脈硬化症、炎症、全身の血管収縮、交感神経系の活性化（ 図1）2-8 を促進することによって、心血管系の調節において中心的な役割を果たしています。 RASは、腎臓の傍糸球体細胞は、血圧の減少に応答して血流中にレニンを分泌するときに活性化されるホルモン系、増加sympatありますhetic刺激、または黄斑緻密によってナトリウムの流れを減少させました。レニンは、アンジオテンシンI（アンI）を形成する（肝臓で合成された）アンジオテンシノーゲンを代謝します。アンギオテンシンIは、次いで、アンジオテンシンII（ANG II）、RASの主要なエフェクターペプチドを形成するために、主に肺および腎臓で、血管内皮細胞の管腔側に、アンジオテンシン変換酵素（ACE）によって外酵素が代謝されます。アンギオテンシンIIは、2つの受容体サブタイプを活性化することができます。 （1 AT R）タイプ1受容体及び（2 R AT）2型受容体は、心臓血管系を調節する両方、体液および電解質の恒常性を維持し、現在、認知機能および神経変性疾患に影響を与えると考えられている8,9を処理します。局所脳特異RASは、独立して、アンギオテンシンIIを合成することが報告されています。脳では、前駆体タンパク質アンギオテンシノーゲンはレニンのような酵素3によってアンギオテンシンIに変換アストログリア10で合成され、おそらくはプロレニンプロレニン受容体に結合しました11、その後豊富脳12内のニューロンの細胞外表面上に発現されたアンジオテンシン変換酵素によってアンギオテンシンIIに変換されます。アンギオテンシンII生成されたこのintrabrainは1 AT脳および血液由来のAng IIから隔離されている2受容体でアゴニストです。 AT 1 Rは、重要な生理学的役割を果たしているが、それはより良い、主に心臓血管系及び腎臓（ 図2）に影響を与える、体全体にその病態生理学的効果のために知られています。アンギオテンシンIIは、AT 1 Rに結合すると、それは血管収縮を引き起こします。血流に対する抵抗性を増加させ、血圧を上昇させます。それはまた、増加したナトリウムおよび水の保持をもたらす、アルドステロンおよびバソプレシンの合成および分泌を促進します。これらの効果はまた、虚血性脳損傷および認知機能障害を誘発することができ、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびdiabeに連結されていますTES、並びに、最近学習および記憶13-15に影響を与えることが同定されています。レニン分泌を抑制し、腎臓での傍糸球体細胞に1 R ATという点で、RASでフィードバックループがあります。興味深いことに、AT 2 Rは、一般的に血管拡張、神経突起伸長、軸索再生、抗増殖、および他の多くの間で脳保護16-20を引き起こし、1 R ATの行動を反調節します。 AT 2 Rは、抗高血圧、最近、抗がん剤21のための標的として同定されています。様々な組織内のAng II受容体の局在化および密度を決定し、それらがどのように定量的デンシトメトリー受容体オートラジオグラフィーを用いた各種トリートメントや病気の状態によって影響を受けることはRASが特定の疾患に果たす役割を明らかにするのに役立ちます。 受容体オートラジオグラフィーは、アンジオテンシンIの存在を示すための有効な方法として、30年以上にわたって使用されていますI受容体と脳内のRASの他の構成要素および実験条件22-34の様々な下ラット、マウス、モルモット、イヌおよびヒトの他の組織。脳内のAng II受容体の位置を特定することの重要性は、一つは、脳内でのAng IIのアクションに例えば機能的な神経解剖学を適用することができるということである、視床下部の室傍核におけるAT 1 R（PVN）の存在は、アンの機能を示唆しています脳内のIIは、バソプレッシン、オキシトシンまたは副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）のリリース、または交感神経系の活性化を刺激します。したがって、AT 1 Rをブロックする薬は、脳のRASの活動の上に関連したこれらのPVN媒介効果のいくつかを低下させる可能性があります。進行中の作業は1 RアンタゴニストATの使用はCRHの心的外傷後ストレス障害（PTSD）誘導放出を減少させ、PTSDの症状を改善することができることを示唆している（ハートら 、出版のために提出します）。 PVN、弓器官（SFO）、および扁桃体がホメオスタシス、食欲/渇き、睡眠、記憶、感情的反応を調節するために知られており、この実証研究の対象領域です。これらの領域は、顕微鏡スライド上に脳の冠状切片を収集し、およびAng II受容体に特異的な放射性リガンドと共に特異的阻害剤で切片を処理することにより調べました。本研究では、提案したベンダーと一緒にすべての材料および試薬は記載されている、ヨウ素125は、その後、モノ125 Iのようにして精製したアンギオテンシンII受容体拮抗薬、サルコシン1、イソロイシン8のAng II（SIのAng II）を、放射性標識するために使用されたされています以前に35記載のようにHPLC法を用いて-SIのAng II。この高い比活性の放射性リガンドの使用は、X線フィルムへの放射性標識部分の露光後に、低中程度および高い受容体密度の領域の可視化を可能にします。ヨウ素125、特定量の既知量を含む脳ペースト規格にフィルムを校正することにより、領域に結合アンギオテンシンII受容体を定量することができます。実験的研究では、実験対象の脳に結合アンギオテンシンII受容体は、対照被験者の脳におけるものと比較することができます。これはアンギオテンシンIIの作用は、遺伝的状態、表現型の異常、疾患状態または薬物療法に応答して変更されているかどうかを示すことができます。この知識は、その後、RASの調節不全に関連する疾患を治療するための治療法の開発に適用することができます。代替的な受容体結合部位を同定する技術が、低減解剖学的解像度で、解離定数（K Dとしての放射性リガンド結合親和性を評価するために、濃度の範囲にわたって放射性リガンド組織ホモジネート由来の組織の膜調製物を使用する結合アッセイであります目的の組織の）および最大結合能（B max）が。 ここで説明するプロトコルは、大きく5つの共同に分けることができますmponents：受容体オートラジオグラフィーのための組織切片を準備します。受容体オートラジオグラフィー;フィルムの露光、現像、組織学;そして、濃度測定の画像解析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500ml Plastic Beakers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24mm x 60mm Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-050-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography Imaging Film 24x30cm</td>
			<td>Carestream-Biomax MR Film</td>
			<td>891-2560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin (from Bacillus licheniformis)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard Sheet 8x11</td>
			<td>Crescent Illustration Board #201</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hair dryers</td>
			<td>Conair</td>
			<td>Model SD6X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium salt, Dihydrate)</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>15-699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16-100-210&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulary Substitute for D-19 Developer</td>
			<td>Photographers Formulary, Inc.&#160;</td>
			<td>01-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38 SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoprep / OCT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH75-125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film Fixer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>5160320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo flo</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Losartan</td>
			<td>Fisher/Tocris</td>
			<td>37-985-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID&#8482; Core 7.0</td>
			<td>MCID</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way slide grips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48440-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD123319</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-615-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Charged Slides , Fine Ground Edge</td>
			<td>Premiere Microscope Slides</td>
			<td>9308W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125I Ligands</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX- 248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125SI-Ang II&#160;</td>
			<td>George Washington University</td>
			<td>Radioiodinated by Dr. Speth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mailers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>RDCS0750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thionin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T409-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Casette (10 x 12)</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td>Four Square</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

receptor autoradiography protocol for the localized visualization of angiotensin ii receptors

このプロトコルは、受容体オートラジオグラフィーマッピングを実行するためのAng II受容体に特異的な放射性リガンドを用いて、ラット脳におけるアンジオテンシンII（アンギオテンシンII）の受容体結合パターンを説明しています。 組織標本を採取し、-80℃で保存します。クライオスタットは、冠状セクションに組織（脳）を使用し、帯電したスライド上のセクションをマウント解凍します。スライドに取り付けられた組織切片は、アンギオテンシンII受容体を放射標識するために125 I-SI-アンギオテンシンII中でインキュベートします。受容体飽和の非放射性標識アンギオテンシンIIの濃度、または（1 R AT）AT 1アンギオテンシンII受容体サブタイプ選択的なアンギオテンシンII受容体アンタゴニストの存在下で、「非特異的結合」（NSP）、隣接するスライドを2つのセットに分離されています、ノーAT 1 Rアンタゴニストと「総結合」。 AT 2の飽和濃度（2 R AT）アンギオテンシンIIレセプターサブタイプ拮抗薬（PD123319、10μM）もincubati中に存在しますバッファにAT 1 Rサブタイプに結合する125 I-SI-アンギオテンシンIIを制限します。スライド10μMのPD123319にさらされている」結合は合計「ながら〜22℃で30分間のプレインキュベーションの間に、NSPのスライドは、10μMのPD123319およびロサルタンにさらされています。次いで、スライドを「全結合」、およびPD123319およびアッセイ緩衝液中のNSPのためのロサルタン、塩を除去するために、いくつかのバッファ内の「洗浄液」、そして続いて水と非ためのPD123319の存在下で、125 I-SI-アンギオテンシンIIと共にインキュベートします特異的に結合した放射性リガンド。次いで、スライドを、特殊なフィルムとカセットを使用して、オートラジオグラフィーフィルムに露光ブロードライヤーを使用して乾燥させます。フィルムは現像され、画像が独自のイメージングシステムとスプレッドシートを使用して、視覚的および定量的デンシトメトリーのためにコンピュータにスキャンされています。スライドの追加セットは、組織学的比較のためチオニン染色されています。 受容体オートラジオグラフィーを使用する利点は、視覚化する能力でありますアンギオテンシンII組織標本のセクション内のインサイツの受容体、および解剖学的には、隣接する組織の基準セクションと比較することによって組織の領域を特定します。

レニン-アンギオテンシン系の代謝経路の概要を、図1に示されており、アンジオテンシンII受容体サブタイプ（1 R ATおよび2 R AT）への直接的な焦点は、図2に記載されている。3ディスプレイ冠状脳の転送図 図4に見られるように、所定の125 I-シャンII濃度を用いて受容体...

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Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K ビュー.  Nova Southeastern University. Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II. 

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The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

NeuroStar TMSデバイス：うつ病の治療薬としてFDA承認されたプロトコルを実施

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

神経科学

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

アニマルコミュニケーションの研究のための自動化されたインタラクティブなビデオ再生

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

聴覚路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛神経核の直接可視化

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and hypothalamus that supplies blood to the brain and surrounding structures. It has been implicated in several cerebrovascular disorders, including cerebral amyloid angiopathy (CAA)-associated vasculopathies, intracranial atherosclerosis and intracranial aneurysms. Studies of the molecular mechanisms underlying these diseases for the identification of novel drug targets for their prevention require animal models. Some of these models may be transgenic, whereas others will involve isolation of the cerebro-vasculature, including the CoW.The method described here is suitable for CoW isolation in any mouse lineage and has considerable potential for screening (expression of genes, protein production, posttranslational protein modifications, secretome analysis, etc.) studies on the large vessels of the mouse cerebro-vasculature. It can also be used for ex vivo studies, by adapting the organ bath system developed for isolated mouse olfactory arteries.

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...