This work was supported by NIH Grant HL-113905

Todos os procedimentos com animais realizados para este estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Nova Southeastern University de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8 th Edition (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ). 1. Preparar as secções de tecido para o receptor A autorradiografia <ol><li> No momento do sacrifício, colheita frescos tecidos cerebrais, e embrulhe em papel alumínio e coloque em um freezer -20 ° C o mais rapidamente possível. Para manter a forma correta, coloque cérebros em um molde cérebro que simula o interior do crânio, embrulhe em papel alumínio e coloque em um - 20 ° C congelador. Após 30 min, os tecidos lugar em um saco de armazenamento vedável congelador e mover-se para um congelador de -80 ° C para armazenamento a longo prazo. <ol><li> Obter os amostra fresca de tecido congelado de interesse a partir do descongelamento -80 ° C congelador, e transferir para um criostato definido para um mínimo de -10 ° C e um máximo de -18 ° C, a fim de evitar. </li&gt; <li> Coloque a amostra sobre o tecido de montagem com um glicol e meio de incorporação à base de resina, apenas a incorporação de uma pequena parte da amostra para o meio. Para cérebro, o cérebro é montado verticalmente para permitir que o corte no plano coronal. </li></ol></li><li> Coloque montar o tecido para o micrótomo dentro do criostato e aperte firmemente no lugar. Assegurar o lado esquerdo e direito do cérebro estão nas mesmas coordenadas ântero-póstero, e que o eixo dorso-ventral do cérebro é atlas perpendicular ao vulgarmente utilizados. </li><li> Iniciar o corte com a espessura desejada (20 uM recomendado) e descongelar montar as secções em lâminas de microscópio numa direcção vertical para ter uma área de superfície maior de espaço na corrediça. Recolha secções em lâminas em conjuntos sequenciais de cinco anos, ou seja, o primeiro conjunto de slides são rotulados 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5 (Figura 3). </li><li> Depois de preencher um conjunto de slides com seções, deixar as lâminas secar ao ar durante até 1 hora, em seguida, coloque o SLIdes em uma caixa plástica de slides em um saco de armazenamento congelador auto-selante, e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Receptor autorradiografia CUIDADO: Radioactividade. Use roupas de proteção para lidar com radioatividade. Eliminação é dependia estabelecimento, e deve seguir as orientações para se decompor adequadamente (meia-vida de 60 dias) ou ser pego por uma empresa certificada. <ol><li> Retire o &quot;-1&quot; e &quot;-2&quot; slides de juros a partir do freezer -20 ° C e montar em suportes de slide (Figura 5). Monte os &quot;-1&quot; slides juntos para o tratamento &quot;não específica&quot;, e os &quot;-2&quot; desliza para o tratamento &#39;total&#39;. Frascos &#39;não-específicas &quot;irá conter 10 uM concentrações finais de PD123319 um antagonista 2 R, e do losartan um AT um antagonista de R, em tampão de meio de ensaio (AM5) (Tabela 1), o&quot; total &quot;frascos de ligação irá conter apenas 10 ? M PD123319 em AM5. </li><li> Inverta a corrediçaapertos para colocar as lâminas em frascos Coplin pré-incubação enchidos com 35-40 ml de AM5, e respectivos inibidores durante 30 min à temperatura ambiente. Comece séries subsequentes em seu banho de pré-incubação em intervalos de 4 min. </li><li> Imediatamente transferir lâminas a partir da solução de incubação pré aos utentes incubação de deslizamento, contendo 10 ml de AM5, além de uma concentração pré-determinada de 125I-SI-Ang II (calculada na Figura 4) com os respectivos inibidores, para 60-90 min a sala temperatura. Se houver radioactivo suficiente, 10 lâminas podem ser colocados (back to back) em suportes de slide modificados e incubadas com 125 I-SI-Ang II em frascos Coplin. </li><li> Colocar as lâminas de volta para os suportes de slide (se necessário), mancha, e lavar por agitação suave para 1-2 seg em 400 ml de água destilada em dois recipientes separados. </li><li> Transferir as lâminas sequencialmente em quatro frascos Coplin contendo 35-40 ml de AM5 durante exactamente 1 min cada (como ilustrado na Figura 4 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Após a última lavagem 1 min, agitar suavemente as seções de 1-2 segundos em quatro mudanças de gelo frio água destilada. </li><li> Seque as lâminas com ar frio (Atenção: o ar quente volatiliza o composto radioactivo) usando quatro secadores de cabelo criados a partir de ângulos diferentes para 4 min (Figura 5), até que todas as seções estão secos, em seguida, coloque sobre uma toalha de papel. </li><li> Mount desliza com os tecidos para cima em um papelão para aposição ao filme de raios-X usando fita dupla face. </li><li> Montar pelo menos um, 125 calibração corrediça iodo padrão para cada cartão (Figura 6). Nota: Os padrões de calibração consiste de pasta de cérebro completamente misturado com 125 Iodo ligado a um composto contendo um anel de fenol, compactado por centrifugação numa seringa de 1 ml de tuberculina, que são criostato segmentado com a mesma espessura como as secções do cérebro e descongelar-montada em microscópio slides. Alternativamente, 125 padrões de calibração em Iresina plástica seccionados a 20 uM de espessura podem ser obtidas comercialmente. A resina plástica nestas normas protege parcialmente o filme da radiação tal que uma equivalência de tecido de ~ 40% devem ser tidos em conta na calibração. </li></ol> 3. Exposição e Desenvolvimento Film <ol><li> Proceder a uma câmara escura com uma cassete de raios-X strap-costas e filmes auto-radiografia. Abrir a cassete e colocar o cartão com corrediças no interior (Figura 6). <ol><li> Desligue as luzes e ligue a luz de segurança. Cuidadosamente abra a caixa de filme de Raios-X, remova um filme, e coloque o lado da película brilhante para cima (com a borda irregular no canto inferior direito) sobre os slides da cassete. Feche cuidadosamente a cassete, e torcer as barras de travamento para selar a luz (Figura 6). Expor as lâminas para vários dias a várias semanas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Na câmara escura, abra a gaveta e prossiga com a proc revelação de filmesess. <ol><li> Colocar as lâminas nas bandejas consecutivamente; programador durante 2 min, água contendo 5% de ácido acético glacial durante 30 seg, e fixador durante 5 min. As películas são colocadas no dentro de um tabuleiro com água corrente durante 20 minutos, em seguida, colocados em Photoflo para não mais do que 10 segundos e penduradas. Nota: O tempo de exposição é determinada empiricamente e pode envolver vários filmes com diferentes tempos de exposição: o tempo suficiente para obter sinais mensuráveis ​​de áreas com baixa ligação, mas não tão longo como a saturar o filme de áreas com alta de ligação. Uma vez que as exposições aceitáveis ​​são obtidos, em seguida, avance para a próxima etapa. </li></ol></li></ol> 4. Histologia <ol><li> Preparar a mancha tionina e reagentes de coloração (Tabela 2, Figura 7). <ol><li> Colocar as lâminas &quot;-3&quot; no porta-lâminas, e transferência de forma sequencial começando com água desionizada durante 1 min, em seguida, tionina solução corante durante 10 min seguido de três mergulha deionáguas ized, e uma lavagem de 30 segundos em água deionizada. </li><li> Após a água, coloque o porta-lâminas para lavagens de etanol como segue; 50%, 70% e 90% durante 30 segundos, seguido por duas lavagens de etanol a 100% durante 1 min cada. Por último, coloque o porta-lâminas em xileno por 3 min, em seguida, transferir para uma segunda solução xileno durante 5 min. </li></ol></li><li> Remover uma lâmina de cada vez a partir do último banho de xileno, e cobrir a borda superior da lâmina com uma base de resina em meio de montagem solvente orgânico, e colocar uma lamela de 24 milímetros x 60 milímetros sobre a lâmina. Deixar as lâminas suficientemente seca para ~ 48 horas e, em seguida, digitalizar para o computador a 2.400 dpi em tons de cinza. </li></ol> 5. densitomï¿½rica Análise de Imagem <ol><li> Coloque o lado do filme brilhante para baixo, com a borda irregular no canto inferior esquerdo e digitalizar usando um scanner proprietária capaz de transmitir a informação densidade do filme, sem qualquer distorção no computador sistema de imagem. </li><li> Abra as sys imagem proprietáriasTEM e utilizam as barras de calibração para estabelecer padrões de calibração para a futura análise densitométrica das imagens sobre o filme (Figuras 9 - 12). </li><li> áreas medida de interesse por qualquer estabelecimento de um modelo ou empiricamente, indicando as áreas de interesse. Os dados são recolhidas e separadas baseado no filme, controlo ou de tipo selvagem (seção), e região. Certifique-se incluir densidade (fmol / g), área de digitalização, e uma área de meta total nas medições (Figura 9). <ol><li> Ajuste bares área de digitalização, assegurando que a região de interesse cai entre parâmetros de destacar (Figura 10). </li><li> Exportar dados em uma planilha (Tabela 4). Multiplicar as vezes de densidade da área alvo total, então dividir pela área de leitura, a fim de obter o valor para a ligação do que a área específica. Uma vez que isto é feito para todos os valores medidos, o substrato não-específica estabelecida total e produzir o p de ligação específicaressentir-se. Médias também pode ser realizada por estes valores. </li></ol></li></ol>

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

O protocolo descrito identifica a visualização de &quot;total&quot; e &quot;não específica&quot; de ligação do radioligando em secções adjacentes de secções coronais de cérebro de roedor anteriormente colhido e armazenado a -80 ° C, e pode ser facilmente aplicável a virtualmente todos os tecidos que tem anatomicamente resolvido subestruturas que mostram quantidades diferenciais de receptores ou locais de ligação de radioligandos. Os procedimentos descritos no âmbito do protocolo são simples e a análise...

A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte e incapacidade nos Estados Unidos, causando mais de 30% das mortes em os EUA em 2011 1. As estatísticas mais recentes da American Heart Association indicam que mais de uma em cada três pessoas tem uma ou mais tipos de doenças cardiovasculares. pesquisa cardiovascular continua a fazer progressos contra a compreensão desta doença, mas como as gerações começam a envelhecer, é imperativo para continuar esses esforços. O sistema renina-angiotensina (RAS) desempenha um papel central na regulação do sistema cardiovascular, principalmente através da promoção da aterosclerose, a inflamação, a vasoconstrição sistémica, e a activação do sistema nervoso simpático (Figura 1) 2-8. O RAS é um sistema hormonal que é activada quando as células justaglomerulares do rim secretam renina na corrente sanguínea em resposta à diminuição da pressão sanguínea, aumento sympatestimulação hetic, ou diminuição do fluxo de sódio pela mácula densa. A renina metaboliza o angiotensinogénio (sintetizado no fígado) para formar a angiotensina I (Ang I). Ang I é então metabolizado pela enzima conversora de angiotensina (ACE), uma ectoenzima no lado luminal das células endoteliais vasculares, principalmente nos pulmões e rins, para formar angiotensina II (Ang II), o péptido de efector principal do RAS. Ang II é capaz de activar dois subtipos de receptores; o receptor de tipo 1 (AT1 R) e o receptor de tipo 2 (AT 2 R), tanto que regulam o sistema cardiovascular, manter a homeostase de fluidos e eletrólitos e agora são considerados para afetar a função cognitiva e doença neurodegenerativa processa 8,9. A RAS local, específica do cérebro é relatado para sintetizar de forma independente Ang II. No cérebro, o angiotensinogénio proteína precursora é sintetizado de astroglia 10 convertido a Ang I por uma enzima renina-3 como, possivelmente, a pro-renina ligado ao receptor de pro-renina11, e, subsequentemente, convertida em angiotensina II pela enzima conversora de angiotensina que é abundantemente expresso na superfície extracelular de neurónios no cérebro 12. Este intrabrain gerado Ang II é o agonista para o cérebro AT 1 e AT 2 receptores que são isoladas a partir de sangue-carregada de Ang II. Enquanto o NO desempenha um R um importante papel fisiológico, é melhor conhecida pelos seus efeitos patofisiológicos de todo o corpo, que afecta principalmente o sistema cardiovascular e nos rins (figura 2). Quando a Ang II liga-se a AT 1 R, que provoca vasoconstrição; aumento da resistência ao fluxo sanguíneo e aumentar a pressão sanguínea. Além disso, promove a síntese e secreção de aldosterona e vasopressina, levando ao aumento da retenção de sódio e água. Estes efeitos podem também induzir a lesão cerebral isquémica e deficiências cognitivas e está ligada à doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e diabetes, bem como a ser recentemente identificado para afectar de aprendizagem e de memória 13-15. Há um ciclo de feedback no RAS em que a AT 1 R nas células justaglomerulares no rim inibe a secreção de renina. Curiosamente, o NO 2 R geralmente contra-regula a acção de pelo 1R, causando vasodilatação, o crescimento de neurites, a regeneração axonal, anti-proliferação e cerebroprotection entre muitos outros 16-20. O NO 2 R também foi identificado como um alvo para anti-hipertensão e, recentemente, drogas anti-câncer 21. Determinar a localização e densidade de receptores de Ang II no prazo de vários tecidos e como eles são influenciados por diversos tratamentos e estados de doença, utilizando auto-radiografia receptor densitometria quantitativa irá ajudar a descobrir o papel que o RAS desempenha nas doenças específicas. Autorradiografia do receptor foi usado há mais de 30 anos como um método eficaz para a indicação da presença de angiotensina II receptores e outros componentes do RAS no cérebro e outros tecidos do rato, murganho, cobaia, cão e ser humano sob uma variedade de condições experimentais 22-34. A importância de localizar receptores de Ang II no cérebro é que se pode aplicar neuroanatomy funcional para as acções de Ang II no cérebro, por exemplo, a presença de pelo um de R no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) sugere uma função de Ang II no cérebro para estimular a vasopressina, a oxitocina ou libertação da hormona de libertação de corticotropina (CRH), ou a activação do sistema nervoso simpático. Assim, as drogas que bloqueiam a AT 1 R pode diminuir alguns destes efeitos PVN mediadas associados com relação à actividade das RAS cerebrais. Trabalhos em curso sugere que o uso de AT 1 antagonistas R pode diminuir Stress Disorder (PTSD) a libertação induzida pós-traumático de CRH e melhorar os sintomas de PTSD (ferir et al., Submetido para publicação). O PVN, subfornicialórgão (SFO), e na amígdala são conhecidas por regular a homeostase, o apetite / sede, sono, memória, reações emocionais, e são as áreas-alvo deste estudo demonstração. Estas regiões foram examinados através da recolha de secções coronais de cérebro em lâminas de microscópio, e o tratamento das secções com inibidores específicos, juntamente com um ligando radioactivo específico para receptores de Ang II. Neste estudo, todos os materiais e reagentes juntamente com os fornecedores sugeridas são listados, Iodo-125 foi utilizado para radiomarcar um antagonista de angiotensina II receptor, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), que foi depois purificado como o mono 125I -Si Ang II utilizando métodos de HPLC conforme descrito anteriormente 35. O uso desta elevada actividade específica de radioligando permite a visualização de áreas de baixa, moderada e alta densidade de receptor após a exposição das secções radiomarcado a um filme de raios-x. Ao calibrar o filme com os padrões de pasta cerebrais que contenham quantidades conhecidas de iodo-125, a quantidade específicaAng II de ligação ao receptor em uma área pode ser quantificada. Em estudos experimentais, o receptor de Ang II de ligação nos cérebros de sujeitos experimentais pode ser comparada com a no cérebro de indivíduos de controlo. Isto pode indicar se as acções de Ang II são alteradas em resposta a uma condição genética, anormalidade fenotípica, estado de doença ou de tratamento da droga. Este conhecimento pode, então, ser aplicada ao desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da RAS. As técnicas alternativas que a identificação de sítios de ligação ao receptor, mas com uma resolução reduzida anatómica, são ensaios que utilizam preparações de membrana de tecidos derivadas de homogenatos de tecidos, as quais são incubadas com o radioligando ao longo de uma gama de concentrações a fim de avaliar a afinidade de ligação de radioligandos como a constante de dissociação (Kd de ligação ) e capacidade de ligação máxima (B max) do tecido de interesse. O protocolo aqui descrito pode ser dividido em 5 dos principais components: Preparando secções de tecido para o receptor autorradiografia; Receptor autorradiografia; Exposição de Cinema e Desenvolvimento; Histologia; Análise de Imagem e densitométrica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500ml Plastic Beakers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24mm x 60mm Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-050-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography Imaging Film 24x30cm</td>
			<td>Carestream-Biomax MR Film</td>
			<td>891-2560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin (from Bacillus licheniformis)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard Sheet 8x11</td>
			<td>Crescent Illustration Board #201</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hair dryers</td>
			<td>Conair</td>
			<td>Model SD6X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium salt, Dihydrate)</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>15-699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16-100-210&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulary Substitute for D-19 Developer</td>
			<td>Photographers Formulary, Inc.&#160;</td>
			<td>01-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38 SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoprep / OCT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH75-125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film Fixer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>5160320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo flo</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Losartan</td>
			<td>Fisher/Tocris</td>
			<td>37-985-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID&#8482; Core 7.0</td>
			<td>MCID</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way slide grips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48440-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD123319</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-615-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Charged Slides , Fine Ground Edge</td>
			<td>Premiere Microscope Slides</td>
			<td>9308W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125I Ligands</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX- 248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125SI-Ang II&#160;</td>
			<td>George Washington University</td>
			<td>Radioiodinated by Dr. Speth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mailers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>RDCS0750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thionin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T409-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Casette (10 x 12)</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td>Four Square</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

receptor autoradiography protocol for the localized visualization of angiotensin ii receptors

Este protocolo descreve os padrões de ligação do receptor de angiotensina II (Ang II) no cérebro de rato usando um radioligando específica para os receptores de Ang II para executar o mapeamento do receptor de auto-radiografia. Os espécimes de tecido são colhidas e armazenadas a -80 ° C. A criostato é usado para a secção coronal do tecido (cérebro) e descongelar-montar as secções em lâminas carregadas. As secções de tecido em lâminas são incubadas em 125I-SI-Ang II para marcar radioactivamente receptores de Ang II. Lâminas adjacentes são separados em dois conjuntos: &quot;ligação não específica&quot; (NSP) na presença de uma concentração saturante de receptores de não-marcado radioactivamente Ang II, ou um subtipo AT 1 do receptor de angiotensina II (AT 1 R) antagonista selectivo do receptor Ang II e &#39;ligação total &quot;, sem AT 1 antagonista R. Uma concentração saturante de AT 2 subtipo do receptor Ang II (2R) antagonista (PD123319, 10 uM) também está presente no incubatiem tampão de limitar 125I-SI-Ang II se ligarem ao subtipo AT 1 R. Durante 30 min de pré-incubação à temperatura de ~ 22 ° C, as lâminas NSP são expostas a 10? M e PD123319 losartan, enquanto &#39;ligação total &quot;slides são expostas a 10? M PD123319. As lâminas são então incubadas com 125 I-Si-Ang II, na presença de PD 123319 para &#39;ligação total &quot;, e PD 123319 e de losartan para PEN em tampão de ensaio, seguido de várias lavagens&#39; &#39;em tampão, e água para remover o sal e não- radioligando especificamente ligado. As lâminas são secas com secador por, em seguida, exposto a filme de auto-radiografia usando um filme especializada e cassete. O filme é desenvolvido e as imagens são digitalizadas em um computador para densitometria visual e quantitativa usando um sistema de imagem proprietária e uma planilha. Um conjunto adicional de slides são tionina-coradas para comparações histológicas. A vantagem de utilizar a autorradiografia do receptor é a capacidade de visualizarAng II receptores in situ, dentro de uma secção de uma amostra de tecido, e anatomicamente identificar a região do tecido por comparação desta com uma secção histológica de referência adjacente.

A síntese da via metabólica do sistema renina-angiotensina é mostrado na Figura 1 e o foco directo sobre os subtipos de receptores da angiotensina II (AT 1 R e AT 2 R) está descrita na Figura 2. A Figura 3 mostra a transferência de cérebro coronal secções em lâminas de microscópio, que são executados através de um processo de auto-radiograf ia do receptor utilizando uma concentração pré-determinada <s...

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Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

A autorradiografia do receptor Protocolo para a visualização localizada da angiotensina II Receptores

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K visualizações.  Nova Southeastern University. Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II. 

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The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

O dispositivo NeuroStar TMS: Conduzindo a FDA Aprovado protocolo para o tratamento da depressão

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Neurociência

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Reprodução de vídeo automatizada interativo para estudos da comunicação animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

De alta capacidade de análise de mamíferos olfativas Receptores: Medição do Receptor de ativação via luciferase Atividade

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and hypothalamus that supplies blood to the brain and surrounding structures. It has been implicated in several cerebrovascular disorders, including cerebral amyloid angiopathy (CAA)-associated vasculopathies, intracranial atherosclerosis and intracranial aneurysms. Studies of the molecular mechanisms underlying these diseases for the identification of novel drug targets for their prevention require animal models. Some of these models may be transgenic, whereas others will involve isolation of the cerebro-vasculature, including the CoW.The method described here is suitable for CoW isolation in any mouse lineage and has considerable potential for screening (expression of genes, protein production, posttranslational protein modifications, secretome analysis, etc.) studies on the large vessels of the mouse cerebro-vasculature. It can also be used for ex vivo studies, by adapting the organ bath system developed for isolated mouse olfactory arteries.

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...