このプロジェクトのための作業は、保健R01 - NR5339の国立研究所からの補助金と健康科学 - R061LDの制服サービス大学によってサポートされていました。

1。軟膜動脈の分離と準備<ol><li>ラットは麻酔の挿入であり、1X PBSで1％エバンスブルーと動脈と浸み込ませるにカテーテルを固定しながら。軟膜血管は、エバンスブルー色素がそれらを簡単に分離することでうまく染まる。 </li><li>必要になるまで-70℃で脳や店舗を抽出します。最適に、脳はもう2ヶ月以上保管しないようにしてください。 </li><li>解剖顕微鏡を使用すると、脳の表面から軟膜細動脈（平均直径35〜50μm）を取り外します。慎重に先の細いピンセットを用いて皮質の背側および側面からのすべて青に染色された細動脈をやってのける。固定液に入れる前に余分な接着皮質組織を削除します。 </li><li> 30分間、0.1M PBS中2％冷パラホルムアルデヒドで収穫した細動脈を修正。 </li><li>切片のために動脈を準備するにはディスク凍結/チャック（-20℃で設定）に埋め込む培地を注ぐ。 </li><li>チャック上に平らな場所の細動脈のセクションそれは凍結するためにNDを待つ。しっかりとあなたが直面している動脈の先端でメディアを埋め込むにクライオスタットの冷凍のディスク上に、右の容器を置きます。それがしっかりと凍結されるまで、ピンセットでそれを保持する。 </li><li>クライオスタットのヘッドに容器を凍結ディスクを置き、クライオスタットで8μmの軟膜細動脈のリングをカット。 </li><li>クロム酸カリウム、ゼラチンsubbedスライド上の細動脈のセクションをマウントします。 </li><li> 4℃で一晩冷蔵庫でスライドボックスに準備されたスライドを保管してください。 </li></ol> 2。 ER -α免疫蛍光染色日1 <ol><li>冷蔵庫からスライドを外し、室温にそれぞれをもたらす。 </li><li>スライドを洗浄するには1〜1.5ミリリットル0.1M PBSは（十分なすべてのセクションをカバーする）、10分間座ってドレインを聞かせてさらに2回の手順を繰り返し注ぐ。スライドの各エッジには、疎水性のマーカーを持っています。その結果、液体は、スライドの表面上に残ります。各洗浄に液体が注がれていますアウトと新鮮0.1 M PBSで置き換え。 </li><li>内因性の蛍光を減らすために、室温で30分間50mmの塩化アンモニウム1ml中のスライドをインキュベートする。 </li><li> 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう</li><li> 0.1％トリトンX - 100に加え、30分間、PBS中の1％正常ヤギ血清（NGS）のブロックスライド。非特異的結合を低減する。 </li><li>一晩4 PBS + 0.1％トリトン- X + 1％NGSで℃、一次抗体（1:500ウサギポリクローナル抗ER -α）でサンプルをインキュベートする</li></ol>日2 <ol start="7"><li>冷蔵庫からスライドを外し、室温にそれぞれをもたらす。 </li><li> 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう</li><li> 1％NGS、暗所、室温で2時間のための0.1パーセントトリトン- X100 + PBSでオレゴングリーン488二次抗ウサギでインキュベートする。この段階から、次のステップは、暗所で行う必要があります。 </li><li> 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう</li><li> VEの下でntilatedフード、4&#39;の代わりに1滴、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を加えた後、マウント船舶上のメディアとサンプルにカバースリップを配置。 </li><li>カバースリップの端を密封するために研磨明確な釘を適用します。約24時間かかりますれ、完全に乾燥するまで、スライドを移動しないでください。 </li></ol> 3。デジタル蛍光イメージング<ol><li>軟膜血管内イメージングER -αのために我々はデジタルカメラを搭載した3色（青、緑と赤）のためのフィルタを使用してニコンEclipseの組み合わせ例デジタル蛍光顕微鏡を使用してスライス。 </li><li>顕微鏡下で染色された軟膜血管のセグメントを持つ準備されたスライドを挿入し、関心の蛍光標識の領域を可視化するために調整する。 X600倍率に増加してX100倍率で起動します。 </li><li>複数のビューを変換するためにDAPI（青）と細胞核（DAPI）とニコン拡張奥行きのフォーカスのソフトウェアを使用して、ER -α（オレゴングリーン）のFITC（緑）のチャンネルで画像をキャプチャするためにカメラを使用して、2次元画像への血管セグメントのの。 </li></ol> 4。代表的な結果： 我々は、ローカライズされた蛍光プローブを使用して軟膜動脈血管におけるエストロゲン受容体-αとデジタル蛍光顕微鏡を用いた受容体の私達の可視化を最適化。受容体の存在を検出するために、ウサギポリクローナル一次抗体およびオレゴングリーン488標識二次抗体は、軟膜動脈の受容体は脳の表面から分離されたイメージに使用されていました。また、核染色（DAPI）細胞核を特定し、ER -αは細胞cyotosolと核に存在することが報告されているので、我々が核にある受容体を検出できるかどうかを判断するために使用された。さらに、我々は一次抗体の特異性を検証し、一次抗体に対する二次の結合を確認するために確証実験を行った。 <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="図1"/><br/&gt; 図1。免疫ER -αの染色（緑）とメスのラットの脳から単離された軟膜動脈のリングにDAPI（青）と対比。図1Aは、いくつかの核内エストロゲン受容体- A（矢印）の存在を示唆してマージされた画像を示しています。図1B及び1Cは、Z -スタック画像の組合せであるER -αの焦点画像です。画像は、X600倍率で撮影し、別の面で同じ容器のカットリングからですした。矢印は、エストロゲン受容体-αを示している。 <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。雌ラットの脳から単離された軟膜動脈のリングでの対照群のための免疫蛍光染色。図2Dは、一次抗体のない容器を示しています。図2Eは、二次抗体（血管内皮側に沿って個別の自家蛍光を注意してください）​​することなく容器を示しています。画像は、X600倍率で撮影してdiffereで同じ容器のカットリングからですられたNTプレーン。

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	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

見解は著者のものであり、健康科学の制服サービス大学、国防総省、または米国政府の公式政策や立場を反映するものではありません。

以前、我々は一時的なグローバルな虚血性脳損傷後の血管拡張薬7,8および血管収縮剤9の両方に対応して直径を変更するには軟膜動脈の能力が著しく若い卵巣摘出ラットに押されていることを示した。慢性的なエストロゲンの補充は血管運動応答7-9を復元します。さらに、遅延エストロゲン補充は、私たちは長期的なエストロゲンの枯渇がcerebrovasculatureのER -α濃度に影響を与えるかどうか疑問につながる軟膜動脈血管拡張容量10エストロゲンの有益な効果を逆転。我々は、西部は慢性的なエストロゲンの枯渇に応答して、ER -α発現の変化を評価するためにブロッティングと組み合わせた免疫蛍光ラベルを使用する予定です。我々は受容体の離散群の可視化にいくつかの困難があったので、我々はここで発揮する方法を変更。したがって、本研究で私たちの主な目標は、最初のビジュアルを最適化するために比較的簡単な方法を開発することでした軟膜細動脈における受容体の化。いくつかの報告と一致し6,11,12で私たちがプロービングされた組織の種類、試料の厚さ、容器内のER -αの分布だけでなく、非特異的結合の程度を調整することが必要があると認める。 我々の手法は軟膜血管スライスのER -αの存在を可視化する非常に効果的です。しかし、他の人として以前に、興味、固定、ブロッキングプロトコルと組織の処理12のタンパク質の細胞内局在抗体の特異性と濃度に大きく依存するこれらのメソッドの使用が成功して指摘している。私たちの船の準備の可視化の前に我々はすべてのこれらの変数を動作するように時間を費やしました。我々はこの論文で我々のアプローチのいくつかを調整するために必要な方法強調している。 我々は最適軟膜細動脈にER -αを視覚化するために着手し、これにはいくつかの課題を提示。最初に、ラット軟膜動脈の平均サイズはややトリッキーな脳の表面から分離し、除去すること35から50ミクロンの間である。我々は前にエバンスブルー色素とその灌流犠牲にすることが動脈の解離が容易に発見。エバンスブルーは蛍光影響を与える可能性がありますが、我々はこの染料を使用する利点は、そのマイナーな欠点を上回ると感じている。我々のプロトコルでは船が数回洗浄されています。これは、血管内の残留色素を最小限に抑え、蛍光で染色した場合の影響を低減します。我々が遭遇した別の難しさは、軟膜血管セグメントの厚さは、困難な受容体の明確な可視化を行ったということでした。さらに、我々は、ER -αは、いくつかの細胞層全体に分散されたという事実におそらく原因で、特に明確な画像を得ることができなかった。我々は、長手方向の血管のスライス（他の人が持っているとして）で作業しようとしたが、マウント中のため小さい軟膜サイズには、血管を処理し、血管のねじれを防止することは困難であった顕微鏡を使用していても上をスライドします。最後に、我々が正常にクライオスタットを用いて、8μm厚のリングにクロス賢明な容器を切断することにより私たちのテクニックを変更しました。リングは、扱いやすいといくつかのスライドに取り付けることができます。 かつて我々はDanseshatalbと関連付けます（11）で提案された船を固定して組織を凍結最初のフラッシュの効果をテストすることが必要だと感じたの船舶を取得しました。我々はわずかに少ない背景の免疫蛍光法を見つけたが、我々はまた、受容体が少ない激しく受容体の可視化をより困難に染色したと指摘した。その結果、我々は（一般的に1〜2カ月の間に）必要な時まで先制脳全体および店舗を凍結することを好む。我々は、その後、前述のように船をやってのけるし、クリオスタットでスライスする前に船を固定してください。我々はここに示すように。 一必要なステップは別々に一次と二次抗体の両方でコントロールを実行することです特異性とバックグラウンドの免疫蛍光法を決定する。エストロゲン受容体-α抗体は扱いが困難になる可能性があります。私達は私達の体の染色の成功に満足される前に実際には、我々は3つの異なる一次抗体を（1モノクローナルと2ポリクローナル）を試みた。弊社のコントロールの一環として、まず一次抗体の添加の省略によって一次抗体の特異性を検証する。図2Dは、一次抗体なしで容器を示しています。は染色とほんの少しのバックグラウンドシグナルはありません。一次抗体はポリクローナルであるため、一部のびまん性非特異的なバックグラウンド染色があります。第二に、我々は、一次抗体を加え、ではなく、二次抗体（図2E）。一つは、血管の内皮の境界線に沿ってautofluoresenceを表す素敵なマージンを見ることができます。これは、ダンと関連付けます5の仕事と一貫性があります。しかし、どちらのER -αを表す免疫の小さな点、また粒状の外観を参照数多くの受容体の存在ぶ必要がすることは、プライマリとセカンダリの両方の抗体の組み合わせに検出できます。我々は、血管の内皮縁に沿ってautofluoresenceの異なるパターンを指摘した。彼らはER -αに対する抗体の特異性を確認し、二次抗体が一次的に結合すると抗体の特異性のためのこれらの独立したテストは重要です。 結論では、他の4で示すように、5脳の血管は、多数のER -αサブタイプ受容体が含まれています。私たちの手では、分離された軟膜動脈から8μm断面スライスを準備する染色と受容体の可視化を強化。伝統的な方法は、サンプルを検査する共焦点顕微鏡を使用。厚い標本から連続光学切片を表示する能力を持つことは、共焦点顕微鏡の重要な利点です。しかし、良好な共焦点顕微鏡の購入は非常に高価になることができます。拡張奥行き（EDF）ソフトウェアを使用することにより、我々は、ことがわかった当社の機器のコストを減らすことができる。 EDFと蛍光顕微鏡を用いて、我々は、クリアな画像を取得し、Z -スタックを使用して複数のレベルで軟膜動脈のER -αを視覚化することができます。 EDFのソフトウェアの大きな利点は、それが効果的に画像から3次元画像を作成する方法で、画像キャプチャを可能にするということです。 oneの充当ソフトウェアとデジタル蛍光顕微鏡を購入する共焦点顕微鏡へのアクセスや資金を持っていない研究室のために研究者の目標に応じて実践的かつ低コストのオプションがあります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>エバンスブルー</td><td>シグマ</td><td> E - 2129 </td></tr><tr><td> 10 × PBS </td><td>シグマ</td><td> P - 5493 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> T353 </td></tr><tr><td>組織- Tek社のOCTコンパウンド</td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td>アンモニウム塩化</td><td>シグマ</td><td> A9434 </td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>シグマ</td><td> T9284 </td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER -αのウサギポリクローナル抗体</td><td>サンタクルス</td><td> H - 184 </td></tr><tr><td>オレゴングリーン488ヤギ抗ウサギIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> O - 11038 </td></tr><tr><td> Vectashieldマウントのための培地 DAPIで蛍光</td><td>ベクトルラボ</td><td> H - 1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

血管反応性に対するエストロゲンの影響の多くは、エストロゲン受容体1、2、3との相互作用を介して媒介される。 2つのサブタイプ（エストロゲン受容体αとβ）が存在するが、エストロゲン受容体-αは平滑筋の両方で、共焦点レーザー走査顕微鏡4と組み合わせて蛍光染色を使用して軟膜動脈セグメントの内皮細胞で同定されている。さらに、ER -αは核にし、ラットの脳底動脈5の細胞質に位置しています。受容体が豊富で鮮やかな蛍光を発するが、受容体の個別のグループの明確な可視化が困難な可能性軟膜血管セグメントの多くの細胞層にある数字によるものです。さらに、免疫組織化学的手法を用いて多くの報告が不十分な共焦点顕微鏡詳細実験6の再現のための重要な要件とペア。この記事の私達の目的は、tを最適化するために単純な手法を説明することです彼は、染色とER -αの可視化雌ラットの脳から取得軟膜細動脈の断面スライスを使用して。まず、簡単に我々は解剖顕微鏡下で分離面軟膜動脈を識別するために、エバンスブルー色素のラットを灌流。動脈の8μmの断面をスライスするクライオスタットの使用は、その別の船の面がより明確に可視化するので、私たちは、薄い血管のセクションを取得することができます。容器を横断するのではなく、小血管のセグメントを使用すると内皮細胞と平滑筋層の見易さの利点があります。さらに、奥行きを拡張したソフトウェアとデジタル免疫蛍光顕微鏡の使用は10〜12種類の容器の平面の鮮明な画像を生成し、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用するよりも低コストです。

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Imaging of Estrogen Receptor-&amp;#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

この記事の目的は、デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラットの軟膜動脈のスライスにエストロゲン受容体α（ERα）​​の免疫蛍光検出を最適化する方法を示すことです。

デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

12.3K ビュー.  Uniformed Services University of the Health Sciences. この記事の目的は、デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラットの軟膜動脈のスライスにエストロゲン受容体α（ERα）​​の免疫蛍光検出を最適化する方法を示すことです。

ビデオ: Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

顕微鏡の適切な手入れとクリーニング

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

生物学

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

光学顕微鏡の主要なコンポーネント

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em&gt;トトで</em&gt;イメージングの<em&gt; C.虫</em&gt;開発

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

サファイアとOPOレーザー基づく標準レーザー走査顕微鏡：Tiの上のコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）システムの実装

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

ラット精巣挙筋の細動脈における無細胞層の可視化と定量化

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

X 線マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいてトウモロコシの維管束のミクロン スケール表現型解析技術

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

多パラメータ灌流制御による原発性ラット肝細胞の単離

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...