We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).

アブラムシの1.文化注：単為生殖胎生エンドウアブラムシAの実験室株エンドウは、もともと台湾中部に回収し、300以上の世代のために長日の光周期の下で宿主植物（エンドウのエンドウのマメやソラマメソラマメ ）で飼育されています（一世代：〜10日）。 <ol><li>種子の発芽<ol><li>室温で3〜5日間水道水に宿主植物の種子を浸します。 1日1回、新鮮な水を補充します。 注：別の方法として、ストレート湿った土壌に宿主植物の種子を置くことだけでなく、発芽を誘導することができます。 </li><li>光周期16時間の明/ 20℃で8時間の暗闇の下で成長チャンバー内の土壌を持つ小さなポット（直径9cm×7センチ）で10発芽種子を栽培。 </li><li>成長が始まる約10日後に、その高さが8つ以上センチ、植物にアブラムシを移します。 </li></ol></li><li>アブラムシの譲渡<oL&gt; <li>絵筆を使用して植物に8大人のアブラムシ転送、1リットルのガラスビーカー内の植物のそれぞれの鍋を保持し、その後、逃げるのアブラムシを防ぐために、このようなガーゼメッシュなどの通気性のカバーでビーカーをシール。 </li><li> 20℃での光周期16時間明/ 8時間暗下で成長チャンバー内のアブラムシをインキュベートします。毎日一回植物の各植木鉢に水を。 </li><li>アブラムシの次の世代を得るために、手順を繰り返す1.1.3-1.2.2 10日の一次アブラムシ転送後。 </li></ol></li></ol> 2.解剖と卵巣の固定<ol><li>新たに固定緩衝液として1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製。 </li><li> PFA（約500μL）と、スポットプレートの1つのウェルを記入し、低倍率での立体顕微鏡下でプレートを配置し、解剖用のPFA内の大人のアブラムシを沈めます。 </li><li>背の切開、鉗子の一組で頭と腹部を保持することによって卵巣を解剖腹部のクチクラ、および腹腔から離れて卵巣をドラッグします。 </li><li>室温で20分間PFAの1ミリリットルを含む1.5 mlチューブに卵巣の3組を修正しました。 </li><li>トランスファーピペット（ガラスまたは使い捨てのいずれか）で固定バッファをデカントした後、10分間毎に1×PBS（PBST）中で0.2％トリトンX-100で3回卵巣を洗います。マイルドミキサー/ローテーターに揺れ（回転角：60°（F60）/回転数：8 RPM）は、固定および洗浄の両方をお勧めします。 </li></ol> 3.プロテイナーゼK（PK​​）での処置は、胚組織の透過性を高めるために注：PK処理は、生殖帯域拡張以降（開発段階11）からの胚に適用されます。若い胚の場合、このステップはオプションです。 <ol><li>直列作業濃度を1μg/ mlから1×PBSでPKのストック溶液（10mg / ml）に希釈します。 </li><li>穏やかな振盪しながら10分間、PK（約500μL）を1μg/ mlの卵巣をインキュベートします。 </li><li>デカントPK solutiそしてその後、グリシン700μlの（2 mg / mlの）5分ごとに、3回と卵巣を洗いに。 </li><li> 10分ごとに二回、0.2％PBSTで卵巣を洗ってください。 </li><li>軽度に振盪しながら室温で15分間固定緩衝液で再び卵巣を修正しました。 </li><li>上清を捨て、10分間ずつ二回、0.2％PBSTで卵巣を洗います。 </li></ol>内因性ペルオキシダーゼ（POD）活性を抑制するための4メタノールインキュベーション注：メタノールのインキュベーションは、メタノールに敏感であるファロイジン染色または抗体エピトープを施した胚には適用されません。 <ol><li>直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を脱水（3：1：1：1、3：V / V 1）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。 </li><li>穏やかな振盪しながら室温で1時間、100％メタノールで卵巣を脱水。 注：染色の良好な結果がまだで、100％メタノール中に保存したアブラムシの組織から得ることができる-20＃176; C 1ヶ月。 </li><li>直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を再水和（1：1：3：1：1 v / v 3）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。 </li></ol> 5.抗体染色<ol><li> 1XのDIGベースのバッファセット（DIG-B）から10倍のブロッキング溶液を希釈します。 注：1×DIG-Bブロッキング溶液は、5％（v / v）の正常ヤギ血清（NGS）からなる標準的なブロッキング試薬に比べ染色のバックグラウンドを低減し、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミンに対してより効果的である（BSA ）0.2％PBSTインチ</li><li>穏やかな振盪しながら4℃でRTまたはO / Nで2.5〜4時間、1X DIG-Bブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。 注：1.5ミリリットルチューブ内の卵巣の三対のために、200μlのサンプルブロッキングと抗体染色のための最小量です。 </li><li>上清を除去し、適切なdilutiで一次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換比に。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。 注：ここで説明する実験では、一次抗体の次の最適な希釈液を使用します（1）ApVas1抗体：1：発色性染色のための500を、免疫蛍光染色のために1時50分。 （2）抗αチューブリン抗体：1：500; （3）4D9モノクローナル抗体：1：25。 </li><li> 15分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。 </li><li> 1X DIG-Bは、穏やかな振盪しながら室温で1時間ブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。 </li><li>上清を除去し、適切な希釈率で二次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換してください。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。 <ol><li>二次抗体の以下の希釈比を使用する：（1）免疫蛍光染色の場合：1：アレクサフルオロ633ヤギ抗ウサギIgGまたはAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGについて500。 （2）発色性染色のために1：ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG 200。 注：ビオチン化二次抗体を染色シグナルが著しく増幅されるを通して基板ベース（発色）の検出にアビジン - ビオチン複合体（ABC）と対話するために適用されます。 </li><li>二次抗体は、光に敏感であるため、免疫蛍光染色のために、暗所で染色を行います。 </li></ol></li><li> 10分ごとに0.2％PBSTで4回、二次抗体を洗い流します。 </li></ol> 6.核とF-アクチン染色注：これは、免疫蛍光染色のために適用されます。 <ol><li>暗所で室温で2時間、DAPI（2 NG /μL）およびファロイジンTRITC（100 nM）を含む0.2％PBSTで染色卵巣。 </li><li> 10分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。 </li><li>穏やかな振盪しながら4℃で封入O / Nで卵巣をインキュベートします。 </li></ol> 7.シグナル開発注：これは、発色性染色のために適用されます。 <ol><li> 100μlの準備試薬アビジン - ビオチン複合体（ABC）、0.2％PBSTの98μlの試薬A（アビジン）の1μLを加え穏やかにピペッティングを経由して十分に混合し、試薬Bを1μlを追加することにより、信号を向上させるための（西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートビオチン）、即座に混合し​​ました。穏やかな振盪しながら室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>穏やかな振盪しながら室温で30分間、試薬AとBの混合物に（関連付けを解除卵室を含む）の卵巣をインキュベートします。 </li><li> 10分ごとに0.2％のPBSTで4回試薬A及びBの混合物を洗い流します。 </li><li>プラスチックスポイトでスポットプレート上のウェルに、PBST中に沈め卵巣を転送します。 </li><li> 3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）の基質溶液を調製：1 DABタブレットを加え、1分間激しくボルテックスを経由してのddH 2 O 1ml中の尿素過酸化水素を含む別のものを溶解させます。 注：DAB、ペルオキシダーゼの沈殿させる基板は、免疫染色のために人気の色原体です。これは、BRを生成ペルオキシダーゼによって酸化された後の自分と不溶性の沈殿物。弱い信号は、基質溶液（最終濃度0.05〜0.08％）と塩化ニッケルを添加することによって高めることができます。 </li><li>ウェル内に残っているPBST溶液を除去し、信号の開発のためのDAB基質溶液100μlを補充します。 </li><li>低倍率での実体顕微鏡下で信号の強度を監視します。 </li><li>すぐに1×PBSで再充填が続くDAB溶液を除去することにより反応を停止します。二回洗浄を繰り返します。 </li><li> 1.5mlチューブに戻って卵巣を転送した後、15分間ずつ二回、1×PBSまたはPBSTで洗浄します。 </li><li>穏やかな振盪しながら4℃でグリセロールベースの​​封入剤（70％グリセロール）、O / Nで卵巣をインキュベートします。 </li></ol> 8.アブラムシ胚をマウントします注：アブラムシ胚の厚さは、開発の段階との間で変化します。マウントの戦略は、このように、中間（ステージ、早期（germariaやステージ0-10）を合わせて変更されています11-18）、および図2Bに示されてい後期胚（ステージ19〜20）、 - D。胚のステージングは、三浦らを追った。12 <ol><li>プラスチックスポイト付きセルトレイにメディアをマウントするとともに卵巣を移し、低倍率でステレオ顕微鏡でサンプルを観察します。 </li><li>虫ピンを使用して横方向の卵管に関連する腎杯をカットした後、スポイトでよく空のグラスに分離された卵巣管を転送します。マウンティング培地を用いて50〜100μlに最終容量をアップしてください。 </li><li>ガラススポイトでスライド上に卵巣管を転送して、虫ピンを使用して卵室を分析。 注：開発のステージ6よりも古い胚の場合、卵室の分離が提案されています。 germariaとステージ6歳未満の最初の二つの卵室のために、分離はオプションです。 </li><li>ガラススポイトを使ってきれいなスライドに解剖卵室を再配置します。 </li><li>カバースリップ（サイズを置く：22×22ゆっくりと泡を避けるために、解剖germariaまたは卵室mm以上）（発達の段階1-10で胚を含みます）。 <ol><li>片側カバーガラスの橋でスライド上の（開発段階11-18で胚を含む）マウント卵室と他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。 </li><li>マウント卵室両面カバーガラスの橋でスライドに（開発のステージ19よりも古い胚を含む）および他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。 </li></ol></li><li>サンプルの乾燥を避けるために取り付けたメディアとトップカバースリップの下のスペースを埋めます。 </li><li>軽度の観察のための正しい方向を得るために、カバースリップをスライドさせて胚をロールバックします。 </li><li>マニキュアと（ブリッジカバーガラスを含む）カバーガラスのエッジの周りにシール。 </li></ol> 9.イメージング解析<ol><li> compouでホールマウント胚の写真微分干渉コントラスト（DIC）画像NDカメラに接続され、DIC光学系および乾燥系対物レンズ（10X、20X、40X）を備えた顕微鏡。製造元の指示を使用して、カメラとパソコンの画像転送用のソフトウェアをインストールします。 </li><li>レーザー走査共焦点顕微鏡14と、蛍光標識された胚の投影を取得します。 、Z-スタッキングを撮影し、3Dがイメージングソフトウェアを投影するための製造元の指示に従ってください。 <ol><li>逆さまにスライドを回して、10倍の対物レンズとマウントされたサンプルを見つけ、細かい油を塗ったベースのペンでサンプル領域を一周。 注：これは、共焦点顕微鏡の対物レンズを介してそれを検索するときにサンプルが容易に識別することができます。 </li><li>反対側9.2.1で説明したようにラベル付けされたカバースリップ領域の上に油の滴を追加します。 </li></ol></li><li> 63×油浸対物レンズに変更し、その後40X油浸対物レンズで焦点面を検索します。手動で微細なフォーカス制御を移動して行いますWNは、最良の焦点面をキャプチャします。 注：germariaと初期胚の構造の詳細を観察するために、我々は40X目的または高倍率のものを使用することをお勧め。 </li><li>異なる励起チャンネルで胚をスキャンし、zスタック画像を得ます。 注：エンドウアブラムシの組織のために、1.5μm以下にまで、各光学部の厚さを薄くします。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

私たちは、エンドウヒゲナガアブラムシAの成功免疫染色するために重要最適な条件を特定した。 エンドウ 、ゲノムおよび発達研究3,15のための新たなモデル生物。組織透過性を増加させ、バックグラウンド染色を低減するための最適化された条件は、信号の強度および特異性を増強しました。それらは、細胞膜の孔を作成して、非特異的抗体結合をブロックするための?...

アブラムシは、小さな（1-10 mm）のソフトボディと半翅目の昆虫です。彼らはピアス口器と師部の樹液を吸引することにより、植物を餌に。さらに、彼らは師部樹液の食事で不足している必須アミノ酸を合成するために、必須の細胞内共生細菌、 ブフネラの aphidicolaに依存しています。アブラムシは、春と夏の長日日長、彼らは越冬卵1,2の数が限られて横たわっている間、短日の光周期によってトリガ性的卵生再生時の単為生殖胎生再生を含んで複雑 ​​な生活史を持っています。春に秋まで単為生殖の多くのラウンドに続いて、すべての女性のアブラムシ（fundatrices）の第一世代を生成するために、これらの卵が孵化。毎年恒例のライフサイクルにおける無性生殖と有性段階の代替アブラムシの周期的単為生殖は、進化のノベルティ1,2と見なされてきました。単為生殖胎生アブラムシで、胚発生は、卵巣細管（ovarioles）の卵の室内で行われます。これとは対照的に、性的卵生の胚は受精卵で開発しています。別に生殖可塑性から、アブラムシは、世代間の翼polyphenismを表示することができます。過密信号と捕食者の脅威に対応して、翼のない無性女性はviviparously長距離移動のための翼の子孫を生成することができます。エンドウヒゲナガアブラムシのゲノム配列の公表Acyrthosiphonエンドウ -theの最初のゲノム配列基礎不完全変態の昆虫ができます生殖可塑性、翼polyphenism、分子のアブラムシで昆虫植物の相互作用、ウイルスベクタとの共生など、他の機能のさらなる調査基礎3。 ゲノム配列決定に加えて、遺伝子発現および機能を特徴づけるためのツールは、成熟したモデル生物として4エンドウアブラムシを促進するために必要とされます。我々は全体のマウントの堅牢なプロトコルを記載しています<em&gt;アブラムシ胚5-7でのmRNAの発現を検出するためのin situハイブリダイゼーション。二本鎖RNAの注入と給電ビアRNA干渉（RNAi）はアブラムシの幼虫及び成虫における遺伝子サイレンシングのために使用されてきたが、胚における遺伝子ノックダウンのための安定した条件がまだ8-10報告されていません。免疫染色、およびRNAiノックダウン後、エンドウアブラムシ胚11-13で行われた前のサンプル中のタンパク質の発現を検出することができる抗体に基づくアプローチ。しかし、組織透過性およびバックグラウンド染色の除去の増加は、エンドウアブラムシの無性胎生胚における免疫染色のための標準プロトコルを使用して、まだ不十分です。たとえば、私たちは、組織への抗体の浸透が（ステージ8-10）胚をgast​​rulatingに減少し、形態学的に識別可能な肢芽（ステージ13〜14）との胚は、抗体にほとんど透過性であることがわかりました。また、バッ​​クグラウンド染色は無性viviparoで可視化されました私たちエンドウアブラムシの胚は、生殖細胞系列マーカーヴァーサだけでなく、胚性セグメント12,13で表現エングレイルド/半円形の波形のタンパク質に対するそのに対する抗体を用いて染色しました。実際にはバックグラウンド染色は、まだ二次抗体のみで染色した胚ではっきりと見えました。 アブラムシ組織の完全性に損傷を与えることなく、透過性を高めるために、我々は慎重にプロテイナーゼKの濃度を滴定し、アブラムシの胚における組織消化のための最適条件を決定しました。エンドウアブラムシに非特異的な染色を避けるために、我々は、効率的に胚をブロックし、免疫染色の間、信号を増幅するために用いられる酵素の内因性のペルオキシダーゼ（POD）の活性を抑制し得る化合物について検索しました。伝統的に使用される通常のヤギ血清ではなく（NGS）、ジゴキシゲニン（DIG）ベースのバッファセットによって提供されるブロッキング試薬/ウシ血清アルブミン（BSA）は、有意にバックグラウンド染色を減少させました。また、メタノールはINHIことが見出されましたより効果的に過酸化水素（H 2 O 2）に比べ、内因性POD活性をビット。胚の免疫染色のためにこれらのアブラムシ、特定の条件に関する詳細は、以下のセクションで説明します。

<table><tbody><tr><td>30% hydrogen perxidase (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td></tr><tr><td>4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>AB_528224</td><td>For labeling the developing segments of embryo.</td></tr><tr><td>ApVas1 rabbit polyclonal antibody</td><td>Our laboratory</td><td>N/A</td><td>For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td></tr><tr><td>Camera connted to compound microscope</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>For photographing of aphid embryos.</td></tr><tr><td>Colorimetric 8 cell tray</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.</td></tr><tr><td>Compound microscope with DIC optics</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides.</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4&quot; of tip length.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>For detection of primary antibody from mouse.</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>For detection of primary antibody from rabbit.</td></tr><tr><td>Intelli mixer</td><td>ELMI laboratory equipment</td><td>RM-2M</td><td>For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.</td></tr><tr><td>Laser-scanning confocal microscopy</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Burdick and Jackson</td><td>AH2304</td><td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td></tr><tr><td>Microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Microscope Cover glasses</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td></tr><tr><td>Microscope Cover glasses</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For sealing the coverslips on the slides.</td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>For fixation of aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>For labeling the distrbution of F-actin on embryos.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>As isotonic solution for aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Plastic dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pyrex spot plate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and&amp;nbsp; depth 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine (DAB) tablets&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>For dissection and observation of aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>For creating pores (punching) on the cell membrane.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Vector laboratories</td><td>PK-6101</td><td>For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td></tr></tbody></table>

identification of critical conditions for immunostaining in the pea aphid embryos: increasing tissue permeability and decreasing background staining

配列決定されたゲノムと豊富な表現型可塑性とエンドウAcyrthosiphonエンドウアブラムシは、ゲノムおよび発達の研究のための新たなモデルとなっています。他のアブラムシ、Aのよう 。 エンドウ胚は卵巣管に組立ライン方式で卵の室内で開発単為生殖胎生再現、を経て急速に伝播します。これまで我々は、アブラムシの胚におけるmRNA発現の検出を可能にするin situハイブリダイゼーションホールマウントの堅牢なプラットフォームを確立しています。タンパク質の発現を分析するために、しかし、満足な結果を生じなかった無性胎生アブラムシのovariolesを免疫染色するためのプロトコルを確立しました。ここでは、組織透過性を増加させ、確立されたアプローチを適用する際に問題があったどちらもバックグラウンド染色を、減少させるための最適化された条件をレポートします。最適化が含まれます：必須のFを発見されたプロテイナーゼK（1 / mlの、10分）、の（1）のインキュベーション中・後期アブラムシ胚または抗体の浸透; （2）ジゴキシゲニン（DIG）により供給されるブロッキング試薬と正常ヤギ血清/ウシ血清アルブミンの交換は、バッファセットと、内因性ペルオキシダーゼを漂白するためにメタノールではなく、過酸化水素（H 2 O 2）、（3）アプリケーションをベース。これはかなりアブラムシ組織におけるバックグラウンド染色を減少させました。免疫染色のために最適化されたこれらの重要な条件は、A。 エンドウ及び他のアブラムシの胚における遺伝子産物の効果的な検出を可能にします。

本研究では、無性エンドウアブラムシ（ 図1A）の胚のホールマウントの免疫染色を行いました。これらの女性は、単為生殖とviviparously子孫を生産します。これらの女性の胚は、卵巣細管（ovarioles）（ 図1Bおよび図2A）の卵の室内で開発しています。顕微鏡検査の前に、解剖ovariolesは染色標的です。しかし、卵室の分離は、顕微鏡?...

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Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

identification-critical-conditions-for-immunostaining-pea-aphid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K ビュー.  National Taiwan University. A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

ビデオ: Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

簡体字を使用した初期の器官形成の理解<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルで<em&gt;アフリカツメガエル</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

発生生物学

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

の透過方法<em&gt;ショウジョウバエ</em小分子の活性のアッセイのための&gt;胚

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

要約

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簡体字を使用した初期の器官形成の理解

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チックの全マウントの抗体染色のための方法

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細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

全体のマウント

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

の透過方法