We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).

진딧물 1. 문화 참고 :. 처녀 생식 태생 완두콩 진딧물의 실험실 변형 pisum는 원래 중앙 대만에서 수집 된 300 개 이상의 세대에 긴 일 광주에서 기주 식물 (정원 완두콩 Pisum의 속 sativum 또는 광범위 한 콩 잠두)에서 사육 된 (한 세대 : ~ 10 일). <ol><li> 씨앗의 발아 <ol><li> RT 3-5 일 동안 수돗물에 기주 식물의 씨앗을 만끽 해보세요. 하루에 한 번 신선한 물을 채우십시오. 참고 : 또는 직선 습한 토양에 기주 식물의 씨앗을 퍼팅뿐만 아니라 발아를 유도 할 수있다. </li><li> 광주 16 시간 조명 / 20 ° C에서 8 시간의 어둠에서 성장 챔버에서 토양과 작은 냄비 (9cm 지름 X 7cm 높이) 10 발아 씨앗을 성장. </li><li> 성장이 시작 약 10 일 후에, 그 높이보다 8cm입니다 식물에 진딧물을 전송합니다. </li></ol></li><li> 진딧물의 전송 <oL&gt; <li> , 1 리터 유리 비커 내에서 식물의 각각의 냄비를 유지 붓을 사용하여 식물에 8 성인 진딧물을 전송 한 다음 탈출 진딧물을 방지하기 위해 거즈 메쉬로 통기성 커​​버 비커를 밀봉. </li><li> 광주 16 시간 조명 / 20 ° C에서 8 시간의 어둠에서 성장 챔버에서 진딧물을 품어. 매일 하루에 한 번 식물의 각 공장 냄비에 물을. </li><li> 진딧물 차세대 얻는 단계 1.1.3-1.2.2 십일 차 전사 후 진딧물을 유지한다. </li></ol></li></ol> 2. 해부 및 난소의 고정 <ol><li> 갓 고정 버퍼로서 1X 인산 완충 식염수 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비한다. </li><li> PFA (약 500 μL)에 자리 판 잘 하나 채우기, 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 접시를 놓고 해부에 대한 PFA 내 성인 진딧물 잠수함. </li><li> , 포셉 한 세트와 머리와 복부를 유지하는 등의 오픈 절단하여 난소를 해부하다복부의 표피 및 복강에서 멀리 난소를 드래그. </li><li> 20 분 동안 실온에서 PFA 1 ㎖를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 난소 세 쌍 수정. </li><li> 전송 피펫 (유리 하나 또는 일회용) 1X PBS에서 0.2 % 트리톤-100 (PBST) 10 분 각 3 회와 난소를 세척 후와와 디 캔트 고정 버퍼입니다. 마일드 (회전 각도 : 60 ° (F60) / 회전 속도 : 8 RPM) 믹서 / 회전에 떨고하는 고정 및 세척을 모두 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. 테 K (PK)과 치료는 배아 조직의 투과성을 증가 참고 : PK 처리 이후 세균 밴드 확장 (단계 개발의 11)에서 배아에 적용됩니다. 젊은 배아의 경우,이 단계는 선택 사항입니다. <ol><li> 직렬 작업 1 μg의 농도 / ㎖로 1X PBS와 PK의 스톡 용액 (10 ㎎ / ㎖)을 희석. </li><li> 가벼운 흔들림과 함께 10 분 동안 PK (약 500 μL)의 1 μg의 / ㎖과 난소를 품어. </li><li> 가만히 따르다 PK의 soluti다음 글리신의 700 μL (2 ㎎ / ㎖) 5 분마다 3 번과 난소를 씻어에. </li><li> 10 분마다 두 번 0.2 % PBST로 난소를 씻으십시오. </li><li> 가벼운 흔들림으로 실온에서 15 분 동안 고정 버퍼 다시 난소를 수정합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 분마다 두 번 0.2 % PBST로 난소를 씻는다. </li></ol> 4. 메탄올 배양 내인성 과산화 효소를 억제 (POD) 활동에 대한 참고 : 메탄올 배양 메탄올 민감 Phalloidin의 염색 또는 항체 항원 결정기를 실시 배아에 적용되지 않습니다. <ol><li> 직렬 PBST 0.2 % 메탄올의 다른 비율로 난소 탈수 (3 : 1 : 1, 3 : V / V 1) 온화한 교반과 함께 10 분 동안 메탄올 용액의 각 농도에서 배양함으로써 난소. </li><li> 온화한 교반과 함께 RT에서 1 시간 동안 100 % 메탄올로 난소 탈수. 주 : 염색의 만족스러운 결과는 여전히 100 % 메탄올에 저장되었다 진딧물 조직으로부터 얻을 수 -20# 176; C 1 개월. </li><li> 직렬 PBST 0.2 % 메탄올의 다른 비율로 난소 재수 (1 : 1 : 3 1, 1, V / V 3) 온화한 교반과 함께 10 분 동안 메탄올 용액의 각 농도에서 배양함으로써 난소. </li></ol> 5. 항체 염색 <ol><li> DIG-기반의 버퍼 세트의 10 배 차단 솔루션을 희석 (DIG-B)는 1 배로. 주 : 1X DIG-B 블록킹 용액 (BSA 표준 블로킹 5 %로 이루어지는 시약 (v / v)의 정상 염소 혈청 (NGS)와 0.5 % (v / v)의 소 혈청 알부민보다 염색 배경을 감소시키기위한보다 효과적인 ) 0.2 % PBST에. </li><li> 가벼운 흔들림 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 2.5 시간 4의 1 배 DIG-B 차단 솔루션과 난소를 품어. 참고 : 1.5 ML 튜브에서 난소 삼쌍를 들어, 200 μL 샘플 차단 및 항체 염색의 최소 볼륨입니다. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다하고 적절한 diluti에서 일차 항체를 포함하는 신선한 1X DIG-B 차단 솔루션으로 대체비에. 가벼운 흔들림 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 4 시간 동안 난소를 얼룩. 주 : (1) ApVas1 항체 : 1 : 여기에 설명 된 실험, 일차 항체의 다음과 같은 최적의 희석 사용 발색 염색 500, 면역 형광 염색 1:50; (2) 항 - 튜 불린 α 항체 1 : 500; (3) 4D9 단일 클론 항체 : 1시 25분. </li><li> 15 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 난소를 씻으십시오. </li><li> 가벼운 흔들림으로 실온에서 1 시간 동안 1X DIG-B 차단 솔루션과 난소를 품어. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다 신선한 1X DIG-B 차단 솔루션은 적절한 희석 비율로 차 항체를 포함로 교체. 가벼운 흔들림 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 4 시간 동안 난소를 얼룩. <ol><li> 이차 항체의 다음 희석 비율을 사용하여 (1) 면역 염색의 경우 : 1 : 알렉사 플 루어 633 염소 항 - 토끼 IgG에 또는 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG 500; (2) 발색 염색 : 1 : 200 비오틴 염소 항 - 토끼 IgG를합니다. 주 : 바이오틴 이차 항체 염색 신호가 크게 증폭되는 기판 계 (발색) 검출에 아비딘 - 비오틴 - 복합체 (ABC)와 상호 작용하기 위해 적용된다. </li><li> 이차 항체가 민감한 빛 때문에 면역 형광 염색은, 어둠 속에서 염색을 실시하고 있습니다. </li></ol></li><li> 10 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 차 항체를 씻으십시오. </li></ol> 6. 원자력 및 F - 굴지 염색 참고 :이은 면역 형광 염색법에 대해 적용됩니다. <ol><li> 어둠 속에서 실온에서 DAPI (2 NG / μL), 2 시간 동안 Phalloidin의-TRITC (100 nm의)를 포함 0.2 % PBST로 난소를 얼룩. </li><li> 10 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 난소를 씻으십시오. </li><li> 가벼운 흔들림 4 ° C에서 설치 매체 O / N과 난소를 품어. </li></ol> 7. 신호 개발 참고 :이는 발색 염색 적용됩니다. <ol><li> 100 μl를 준비비오틴 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제와 접합 (시약 B 1 μL를, 0.2 % PBST 98 μL 시약 (아비딘) 1 μl를 첨가 부드러운 피펫을 통해 철저히 혼합하고, 추가로 신호를 향상 (ABC) 시약 아비딘 - 비오틴 - 복합체 ), 즉시 혼합 하였다. 온화한 교반과 함께 30 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. </li><li> 온화한 교반과 함께 30 분 동안 실온에서 시약 A 및 B의 혼합물에 (해리 달걀 챔버 포함) 난소 배양한다. </li><li> 10 분간 각각 0.2 % PBST로 4 회 시약 및 B의 혼합물을 씻어. </li><li> 플라스틱 적기에 현장 접시에 잘에 PBST에 잠긴 난소를 전송합니다. </li><li> 3,3&#39;- 디아 미노 (DAB)의 기질 용액을 제조 하였다 : 하나 DAB 태블릿 플러스 1 분 동안 격렬하게 볼 텍싱 통해 DDH 2 O 1 ㎖를 함유하는 또 하나의 우레아 과산화수소를 녹인다. 참고 : DAB, 퍼 옥시 다제의 침전 기판, 면역 염색에 대한 인기 발색입니다. 그것은 BR를 생산과산화 효소에 의해 산화 된 후 자신의 불용성 침전물. 약한 신호는 기질 용액 (최종 농도 0.05부터 0.08까지 %)에 염화 니켈을 첨가함으로써 향상 될 수있다. </li><li> 웰 내에 잔류 PBST 용액을 제거하고 신호 개발 DAB 기질 용액 100 ㎕와 리필. </li><li> 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 신호의 강도를 모니터링합니다. </li><li> 즉시 1X PBS로 재충전 하였다 DAB 용액을 제거하여 반응을 정지. 두 번 세척을 반복합니다. </li><li> 1.5 ML 튜브로 다시 난소로 이동 한 다음 15 분마다 두 번 1X PBS 또는 PBST로 씻는다. </li><li> 가벼운 흔들림 4 ° C에서 글리세롤 기반 설치 매체 (70 % 글리세롤) O / N에서 난소를 품어. </li></ol> 8. 진딧물 배아를 장착 참고 : 진딧물 배아의 두께는 개발 단계 사이에 다릅니다. 설치 전략 따라서 조기에 맞게 수정 (germaria 및 0-10 스테이지), 중간 (단된다그림 2B에서 설명된다 11-18), 늦은 배아 (단계 19 ~ 20) - D. 배아 준비는 미우라 등을 따랐다. (12) <ol><li> 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 샘플을 플라스틱 스포이드로 셀 트레이에 매체를 장착와 함께 난소를 전송하고 관찰한다. </li><li> 곤충 핀을 사용하여 측면 난관과 관련된 꽃받침을 차단하고 적기에 잘 빈 유리에 고립 ovariole을 전송합니다. 설치 매체를 사용하여 50 ~ 100 μL에 최종 볼륨을 확인합니다. </li><li> 유리 dropper으로 슬라이드에 ovariole을 전송 한 다음, 곤충, 핀을 사용하여 난자 챔버 해부. 참고 : 개발의 단계 6 세 이상 배아를 들어, 계란 챔버의 분리를 제안한다; germaria 무대 6 세 미만의 처음 두 계란 챔버에 대한 분리는 선택 사항입니다. </li><li> 유리 dropper를 사용하여 깨끗한 슬라이드에 해부 계란 챔버를 변경합니다. </li><li> 커버 슬립 (크기를 넣어 : 22 X 22해부 germaria 또는 천천히 거품을 피하기 위해 달걀 챔버 (단계 개발의 1-10에서 배아를 포함) mm 이상). <ol><li> 마운트 달걀 챔버 일방적 coverslip에 다리와 슬라이드 (단계 개발의 11-18에서 배아를 포함) 및 다른 coverslip에 배치 : 샘플의 상단에 (크기 18 X 18mm)를. </li><li> 마운트 달걀 챔버 양면 커버 슬립의 다리로 슬라이드 (개발의 단계 19 이전의 배아를 포함) 및 다른 coverslip에 배치 : 샘플의 상단에 (크기 18 X 18mm)를. </li></ol></li><li> 샘플을 건조 방지하기 위해 설치 매체를 사용하여 상단 커버 슬립 아래 공간을 채 웁니다. </li><li> 온화하게 관찰에 대한 올바른 방향을 얻기 위해 커버 슬립을 밀어 배아를 굴립니다. </li><li> 매니큐어와 (브리지 된 커버 포함) 된 커버의 가장자리 주위에 인감. </li></ol> 9. 이미징 분석 <ol><li> 사진 미분 간섭 대비 (DIC)의 이미지 compou와 배아를 전체를 마운트차 현미경 DIC 광학 및 카메라에 연결 건조 대물 렌즈 (10X, 20X, 40X)를 장착. 제조업체의 지침을 사용하여 카메라와 컴퓨터 사이의 이미지 전송을위한 소프트웨어를 설치합니다. </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (14)과 형광 표지 된 배아의 돌기를 획득. , 촬영 Z-스태킹 및 3D 이미징 소프트웨어를 사용하여 투사 제조업체의 지침을 따르십시오. <ol><li> 10X 목적에 탑재 된 샘플을 발견, 거꾸로 슬라이드를 켜고 잘 기름칠 기반의 펜으로 샘플 영역을 동그라미. 참고 :이 공 초점 현미경의 목표를 통해 검색 할 때 샘플을 쉽게 식별합니다. </li><li> 반대측 9.2.1에 설명 된대로 표지 커버 슬립 영역의 상부에 오일 방울을 추가한다. </li></ol></li><li> 40X 기름 침지 목표에 초점면 다음 63X 기름 침지 목표로 변경하실 수 있습니다. 수동으로 미세 초점 제어를 이동 할WN 최고의 초점면을 촬영합니다. 참고 : germaria 및 초기 배아의 세부 구조를 관찰, 우리는 40X 목적 또는 더 높은 배율을 가진 사람을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 다른 여기 채널에서 배아를 스캔 Z 스택 이미지를 얻을 수 있습니다. 참고 : 완두콩 진딧물 조직의 경우, 1.5 ㎛ 이하까지 각각의 광 부분의 두께를 줄일 수 있습니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

우리는 완두콩 진딧물에 성공 면역에 중요한 최적의 조건을 확인했다. pisum, 게놈과 발달 연구 3,15에 대한 새로운 모델 생물. 조직 투과성을 증가시키고, 배경 얼룩을 감소시키기위한 최적 조건은 신호 강도 및 특이성을 향상. 이들은 세포막에 구멍을 만들고 결합 비 - 특이 적 항체를 차단하는 단계에서 다른 동물 모델에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜이 다르다. <p class="jove_co...

진딧물은 작은 (1-10mm) 소프트 기관과 hemipteran 곤충이다. 그들은 피어싱 구기와 체관부 수액을 빨아 식물을 먹고. 또한, 그들은 체관부 수액 다이어트 결핍 필수 아미노산을 합성, 의무적 endosymbiotic 세균 Buchnera의 aphidicola에 의존한다. 진딧물은 봄과 여름 긴 일 photoperiods 그들이 월동 계란 1, 2의 제한된 수의 누워있는 동안 짧은 일 photoperiods에 의해 트리거 성적 난생 재생시 처녀 생식 태생 재생을 포함하는 복잡한 삶의 역사를 가지고 있습니다. 봄이 계란 가을까지 처녀 생식 재생의 많은 라운드를 다음, 모든 여성 진딧물 (fundatrices)의 첫 번째 세대를 생산하기 위해 부화. 연간 라이프 사이클에 무성 성적 단계의 대체가 진화 참신 1,2로 간주 된 진딧물에 순환 처녀 생식. 처녀 생식 태생 진딧물에서, 배아는 난소 세관 (ovarioles)의 달걀 챔버 내에서 발생한다. 반면, 성적 난생 배아는 수정란에서 개발. 외에도 생식 소성에서, 진딧물은 transgenerational 날개 polyphenism를 표시 할 수 있습니다 과밀 신호와 포식자의 위협에 대한 응답으로, unwinged 성별이 여성은 viviparously 장거리 이동을위한 날개 자손을 생성 할 수 있습니다. 완두콩 진딧물의 게놈 시퀀스의 출판 Acyrthosiphon pisum 년 -에 대한 최초의 게놈 서열을 기초 hemimetabolous 곤충 - 수 생식 소성, 날개 polyphenism 및 분자에 진딧물 곤충 - 식물의 상호 작용, 바이러스 벡터링과 공생을 포함한 다른 기능의 추가 탐사 기준 3. 시퀀스 된 게놈 외에, 유전자 발현과 기능을 특성화 툴 성숙한 모델 생물로서 4 완두 진딧물을 촉진해야한다. 우리는 전체 마운트의 강력한 프로토콜을 설명했다 <em&gt; 진딧물 배아 5-7에서의 mRNA의 발현을 검출하기위한 현장 하이브리드에. 이중 가닥 RNA 주입 및 이송을 통해 RNA 간섭 (RNAi) 진딧물 약충 및 성인에서 유전자 침묵에 사용되었지만, 배아 유전자 녹다운을위한 조건은 아직 안정 8-10보고되지 않았다. 면역 염색 및 RNAi의 최저 후, 완두콩 진딧물 배아 11-13에서 수행되기 전에 샘플에서 단백질 발현을 검출 할 수있는 항체 기반의 접근 방식. 그러나, 조직 투과성 및 배경 얼룩 제거의 증가는 완두콩 진딧물의 무성 태생 배아에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜을 사용하여 아직 만족스럽지 못하다. 예를 들어, 우리는 조직에 대한 항체의 침투 gastrulating 배아 감소 발견 (8-10 스테이지)과 형태 학적으로 식별 사지 싹 (단계 13 ~ 14)와 배아 항체에 거의 투과 있다고. 또한, 배경 염색은 무성 viviparo에 가시화생식 세포 마커 바사뿐만 아니라 그에 대한 배아 세그먼트 (12, 13)로 표현 Engrailed / Invected 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색 우리 완두콩 진딧물의 배아. 사실 배경 염색은 여전히​​ 혼자 차 항체로 염색 배아에서 분명히 볼 수 있었다. 진딧물 조직의 완전성을 손상시키지 않고 투과성을 증가시키기 위해, 우리는 신중 테 K의 농도를 적정하고 진딧물 배아 조직 분해를위한 최적의 조건을 결정 하였다. 완두 진딧물에 비특이적 염색을 방지하기 위해, 우리는 배아를 효과적으로 차단하고 내인성 퍼 옥시다아제 (POD)의 활성, 면역 동안 신호를 증폭하기 위해 사용되는 효소를 억제 할 수있는 화합물을 검색. 전통적으로 사용되는 표준 오히려 염소 혈청 (NGS), 디곡시 제닌 (DIG) 기반 버퍼 세트에 의해 제공되는 차단 시약 / 소 혈청 알부민 (BSA)을 크게 백그라운드 염색을 감소시켰다. 또한, 메탄올 INHI였다과산화수소보다 효과적으로 POD 내인성 활성 비트 (H 2 O 2). 배아에 대한 면역 염색에 대한 이러한 진딧물 특정 조건에 관한 세부 사항은 다음 절에서 설명한다.

<table><tbody><tr><td>30% hydrogen perxidase (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td></tr><tr><td>4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>AB_528224</td><td>For labeling the developing segments of embryo.</td></tr><tr><td>ApVas1 rabbit polyclonal antibody</td><td>Our laboratory</td><td>N/A</td><td>For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td></tr><tr><td>Camera connted to compound microscope</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>For photographing of aphid embryos.</td></tr><tr><td>Colorimetric 8 cell tray</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.</td></tr><tr><td>Compound microscope with DIC optics</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides.</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4&quot; of tip length.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>For detection of primary antibody from mouse.</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>For detection of primary antibody from rabbit.</td></tr><tr><td>Intelli mixer</td><td>ELMI laboratory equipment</td><td>RM-2M</td><td>For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.</td></tr><tr><td>Laser-scanning confocal microscopy</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Burdick and Jackson</td><td>AH2304</td><td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td></tr><tr><td>Microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Microscope Cover glasses</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td></tr><tr><td>Microscope Cover glasses</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For sealing the coverslips on the slides.</td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>For fixation of aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>For labeling the distrbution of F-actin on embryos.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>As isotonic solution for aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Plastic dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pyrex spot plate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and&amp;nbsp; depth 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine (DAB) tablets&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>For dissection and observation of aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>For creating pores (punching) on the cell membrane.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Vector laboratories</td><td>PK-6101</td><td>For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td></tr></tbody></table>

identification of critical conditions for immunostaining in the pea aphid embryos: increasing tissue permeability and decreasing background staining

완두콩 진딧물 Acyrthosiphon의 pisum는 시퀀스 된 게놈과 풍부한 표현형 소성으로, 게놈 및 개발 연구를위한 새로운 모델이되고있다. 다른 진딧물, 등을들 수있다. pisum은 배아가 ovariole의 조립 라인 방식으로 계란 챔버 내에서 개발 처녀 생식 태생 재생을 통해 빠르게 전파. 이전에 우리는 진딧물의 배아에서 mRNA 발현의 검출을 허용 현장 하이브리드의 전체 마운트의 강력한 플랫폼을 설립했다. 단백질의 발현을 분석하지만, 만족스러운 결과를 생성하지 않았다 무성 태생 진딧물의 ovarioles를 면역 염색을위한 프로토콜을 설립했다. 여기에서 우리는 조직 투과성을 증가 설립 방식을 적용 할 때 문제가 있었다 둘 배경 염색을 감소시키는 최적의 조건을보고합니다. 최적화는 다음과 같습니다 필수 F 발견 된 단백질 분해 효소 K (1 μg의 / ㎖, 10 분),의 (1) 배양중간 및 말기 진딧물 배아 또는 항체 침투; 디곡시 제닌 (DIG)에 의해 공급 차단 시약 정상 염소 혈청 / 소 혈청 알부민 (2) 여분 세트 버퍼와 내인성 퍼 옥시다아제 표백 메탄올 오히려 과산화수소 (H 2 O 2), (3)베이스 어플리케이션; 이는 크게 진딧물 조직에서 배경 염색을 감소시켰다. 면역 염색에 최적화 된이 중요한 조건은. pisum과 다른 진딧물의 배아에서 유전자 산물의 효율적인 검색을하실 수 있습니다.

본 연구에서는 무성 완두콩 진딧물 (그림 1A)의 배아에 전체 마운트 면역 염색을 시행 하였다. 이 여성은 생식에와 viviparously 자손을 생산하고 있습니다. 이 여성 배아는 난소 세관 (ovarioles) (그림 1B 그림 2A)의 달걀 챔버 내에서 개발. 현미경 전에 해부 ovarioles는 염색 타겟이고; 그러나, 달걀 챔버 분리 현미경 (- D도 2b)...

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Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K 조회수.  National Taiwan University. A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

비디오: Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

연구

발생학

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

생물학

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

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이해 간체를 사용하여 초기 형성기

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

전체 산

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법

의 Permeabilization의 방법

완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

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