全体のマウント免疫組織化学は、標識された抗体を使用して組織または生物内のタンパク質を直接空間的および時間的に観察することを可能にする比較的迅速かつ簡単な技術です。この技術の有用性は、それを第1の切片にすることなく、無傷の組織または生物の染色を可能にし、共焦点顕微鏡を使用してタンパク質発現パターンの三次元表現を生成することができる。免疫体化学は、疾患の根源となる病因と分子メカニズムを理解するために、生物医学研究で広く使用されています。
また、病理学的サンプルの腫瘍を同定するための貴重な診断ツールです。まず、システムの水で満たされた産卵タンクを準備し、メッシュまたはスロットライナーを所定の位置に置きます。一晩タンク内のグループに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアを配置します。
14時間/10時間の明暗サイクルを使用し、9時.mにライトが点灯します。翌朝、ライトをつけた後、生卵水を新鮮なシステムの水で交換して、フェクを取り除きます。卵が産まれると、大人を自宅のタンクに戻します。
転送ピペットを使用してそれらを描画することにより、卵を収集します。胚培地で半分に満たされた各ペトリ皿に50個の卵を移します。死んでいるか、分裂しなかった不透明で曇った卵を取り除きます。
受精後23時間まで28.5°Cで卵の皿をインキュベートします。胚が受精後24時間より古い場合、ピペットを用いて胚培地中の200ミクロモルPTUに移してメラニン形成を防ぐ。ステレオ顕微鏡の下で、超微細な先端鉗子を使用して、孵化していない胚をデコールリアテットする。
火で磨いたパスツールピペットを使用して損傷を最小限に抑え、胚培地に溶解した1〜2%のアガロースでコーティングされたガラスまたはプラスチックペトリ皿に移します。その後、プラスチックまたは火で研磨されたピペットを使用して胚を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。マイクロピペットで胚培地を取り除きます。
胚を覆うのに十分な液体だけを残してください。室温で穏やかな揺れで4%PFAで胚を1〜2時間固定します。次に、1X PBSで胚を3回、PBTritonを1%で5分間洗浄します。
すぐに胚を使用するか、最大1週間摂氏4度で保存します。長期保存のために、脱水し、マイナス20°Cで100%メタノールで胚を保存します。胚を水分補給するには、最終洗浄のためにメタノールとPBSおよびPBTritonの量を減少させ、室温でそれぞれ5分間連続インキュベーションを行う。
原稿に従って胚の準備を進める。BSAのミリリットル当たり2ミリグラムの有無にかかわらずPBTritonの10%ヤギ血清など、二次抗体宿主種に一致するブロッキング溶液を選択する。胚を含むチューブに0.5ミリリットルのブロッキング溶液を加え、室温で1〜3時間ロッカーにチューブを置きます。
次に、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体で胚をインキュベートし、揺れながら摂氏4度で一晩PBTritonを行います。朝、PBTritonで胚を揺らしながら室温でそれぞれ10分間5回洗浄します。次に、一次抗体の宿主種と所望の波長を488ナノメートルで基づいて二次抗体を選択する。
ブロック溶液中で希釈した二次抗体を胚を含むチューブに加えます。チューブをアルミホイルで覆い、揺れながら室温で2時間インキュベートします。その後、胚をPBTritonでそれぞれ10分間洗浄し、アルミホイルで覆い、揺れ動かします。
ピペットを用いて、胚培地中の2%アガロースのベッド上でPBS中の50%グリセロール溶液に胚を移す。黄身を取り除くために、1X PBSの200マイクロリットルをうつ病スライドまたはプレーンガラススライドに移します。プラスチック製の転写ピペットを使用して、1つ以上の胚をPBS液滴に移動します。
超微細な鉗子と二重ゼロの昆虫ピンを使用して黄身を分解し、胚の腹側表面から黄身顆粒を非常に穏やかに削ります。黄身顆粒を取り出し、必要に応じてPBSで補充します。取り付け後、サンプルを顕微鏡のステージに置きます。
比較的明るい例を選択して、対象地域を見つけます。信号が飽和することなく十分に明るくなり、カメラの露出とゲインを調整します。実験用抗体標識胚と対照抗体胚とを比較する場合は、同じ露光設定を使用する。
このマウント免疫体化学全体のプロトコルは、ゼブラフィッシュの開発を用いた空間的および時間的タンパク質発現の研究に役立つツールです。NMDA型グルタミン酸受容体のGluN1サブユニットは、受精後23時間でゼブラフィッシュの筋肉を発達させるグルタミン酸受容体サブユニットの発現を明らかにした。72時間受精後の胚の凍結切片をスライドに取り付け、増殖細胞のマーカーであるホスホ-H3に対して免疫染色した。
いくつかの細胞は、ホスホ-H3を発現し、その発現は心室帯で最も顕著であった。マウスIgG対照抗体および一次抗体を除くと、低レベルの非特異的発現が明らかになった。検出を確実にし、非特異的染色を最小限に抑えるためには、一次抗体宿主種に基づいて適切なブロッキング溶液および二次抗体を選択することが重要です。
免疫体化学は、観察されたシグナルが実際に目的のタンパク質であることを確認する必要があります。フォローアップ実験は、通常、遺伝的または環境的に改変された生物を使用して含まれます。免疫組織化学は、研究者に、その際のタンパク質を観察する能力を与え、特に胚発生時に基礎生物学と応用生物学の両方で多くのシステムの理解を大幅に加速します。
メタノールとホルムアルデヒドは有毒であり、慎重に取り扱う必要があります。廃棄物は、制度上の手続きに従って回収し、処分する必要があります。
